Name: ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Vi tackar MS Romy Kempe och Mrs. Annett Opitz för expert teknisk support. Vi tackar också Mr Bjoern Binnewerg för IT-stöd. Detta arbete stöddes av bidrag från a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", medicinska fakulteten Carl Gustav Carus Dresden och c) Else kröner-Forschungskolleg (EKFK) medicinska fakulteten Carl Gustav Carus Dresden. Vi är tacksamma för finansieringen och stödet.

Följande protokoll följer den institutionella djuromsorg riktlinjer Technische Universität Dresden, Tyskland (filnummer: T 2014/4) samt internationellt accepterade djuromsorg riktlinjer (FELASA)17. Figur 1 visualiserar cell isolerings processen.
1. förbereda installation, material och media
<ol><li>Förbered cellkulturmedium, PBS lösning, kollagenase blandning stamlösning (Rekonstituera 50 mg frystorkat kollagenase blandning i 12 ml...

<ol>
	<li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts:+what+are+we+talking+about.">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li><li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts.">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li><li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro:+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density.">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li><li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts:+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor.">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length.">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes:+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro.">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation.">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098 (2018).</li><li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tsch&#246;pe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells.">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Poulet, C., K&#252;nzel, S., B&#252;ttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li><li>G&#252;nd&#252;z, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes,+Endothelial+Cells,+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart.">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes.">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li><li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy.">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+Guidelines+and+Recommendations.">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).</li><li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density.">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li><li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems:+myofibroblasts+all+along.">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li><li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019)</li><li>Copp&#233;, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines.">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li><li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems.">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li></ol>

Jämfört med förevigade fibroblast cellinjer, primära fibroblaster erbjuder flera fördelar. De kan vara isolerade kostnadseffektivt i hög kvalitet och kvantitet. Dessutom erbjuder primär kulturer möjligheten att studera celler från flera individer, vilket ökar tillförlitligheten hos de erhållna resultaten och minskar sannolikheten för att enbart studera cellkultur artefakter. Kontinuerlig generering av nya primär kulturer förhindrar genetiska förändringar som vanligtvis inträffar efter upprepad passaging...

Fibroblaster är platta, Spindelformade celler med flera stellate processer och en omfattande grov endoplasmatiska nätmagen1,2. En genomsnittlig fibroblast åtgärder 30-100 μm och har en livslängd på 57 ± 3 dagar1,3. Den genomsnittliga cell cykel varaktigheten av humana fibroblaster varierar från 16-48 h beroende på kulturen villkor4. Det finns belägg för att den replikativa kapaciteten och funktionella kvaliteten hos odlade primära fibroblaster negativt korrelerar med givar åldern, vilket tyder på att yngre donatorer (djur eller patienter) bör föredra om möjligt5,6 .
Fibroblaster utgör en dominerande celltyp av de flesta däggdjurs organ vävnader. Trots sin allestäde närvarande närvaro, molekylära identifiering av fibroblaster är fortfarande en utmaning7. Fibroblaster migrera till att utveckla vävnader och organ från olika källor under embryonal utveckling8. Av denna anledning, det finns en uppsjö av markör proteiner som kan hittas i fibroblaster medan unika markör proteiner, som finns i varje fibroblast population och exklusivt för fibroblaster, saknas fortfarande. Sålunda, uttrycksmönster av flera erkända markörer används vanligtvis för att identifiera fibroblaster. Bland de mest erkända markörer är vimentin, humant fibroblast yta protein (HFSP), discoidin domän receptor 2 (DDR2) och alfa glatt muskel aktin (αsma).
Fibroblaster är den största extracellulära matrix (ECM)-producerande celltyp. Därmed upprätthåller fibroblaster en ordnad vävnads arkitektur och ger mekaniskt stöd för angränsande celler1. Balansen mellan ECM-syntes och nedbrytning är en välreglerad process. Förskjutningar mot syntes markerar början på överdriven ECM-deposition som, om den inte avslutas, leder till fibros. Fibros medieras av myofibroblaster, som härstammar från aktiverade fibroblaster som genomgår molekylära och fenotypiska förändringar. Ett kännetecken för myofibroblaster är förbättrad utsöndring av ECM och cytokiner och uttrycket av ordnad arrangerade αSMA Microfilaments9.
Primära fibroblaster har varit i fokus för ny forskning med fokus på fibros, vävnadsinflammation och fibroblast-cancer-cellinteraktioner10,11. Emellertid, att effektivt studera fibroblast egenskaper i hälsa och sjukdom, det är nödvändigt att isolera livskraftiga primära vuxna fibroblaster på regelbunden basis. Det finns flera metoder som är tillgängliga för att isolera fibroblaster12,13,14. De tre viktigaste metoderna för fibroblast isolering är utväxt från vävnad bitar12, enzymatisk vävnad nedbrytning15, och enzymatisk perfusion av ihåliga organ9,13,16. Fördelen med utväxt är en skonsam isolerings process utan enzymatisk cell nedbrytning. Å andra sidan, utväxt kulturer kräver vanligtvis långvariga odlings perioder tills cellerna kan användas för experiment. Vanlig enzymatisk matsmältning är snabb men bär en risk för kontaminering med andra celltyper (t. ex. endotelceller) eller bakterier i omrörningsprocessen, vilket är nödvändigt för att mekaniskt lösa upp vävnaden. Dessutom är dessa metoder ofta utarbeta och kräver tid och skicklighet att lära.
När det gäller vikten av primära fibroblaster i forskning, det finns fortfarande ett behov av att optimera befintliga cell isolering metoder i termer av snabbhet, enkelhet och tillförlitlighet. Här, en roman ultraljud-baserade enzymatisk fibroblast isoleringsmetod som levererar högkvalitativa celler tillhandahålls.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1103px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">T4049-100ML</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>Gibco LS15140148&#160;</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>51023608</td>
			<td>HeraSafe KSP15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>50049176</td>
			<td>BBD 6220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on vessel</td>
			<td>6-, 12-, 24-wells Nunclon surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture suction</td>
			<td style="width:339px;">VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td>
			<td>20727400</td>
			<td style="width:405px;">BVC professional suction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell strainer (mesh)</td>
			<td>Corning, Tewksbury, USA</td>
			<td style="width:143px;">431750</td>
			<td>40 &#181;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">75007213</td>
			<td>Megafuge 8R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless pipetting controller</td>
			<td>Hirschmann, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td>Pipetus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>SafeSeal tips for pipettes (10 &#181;l, 20 &#181;l, 100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Myco Medical, Cary, USA</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>Techno cut</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>41965-062</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>50 &#181;l, 500 &#181;l, 1.500&#181;l, 2.000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase blend</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">5401020001</td>
			<td>Liberase TL Research Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 6 cm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Senescence detection kit</td>
			<td style="width:339px;">Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab65351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Shaker/ Vortex</td>
			<td style="width:339px;">IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile plastic tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>Falcon 352095</td>
			<td>BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:143px;">312</td>
			<td>Sonorex RK100H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors (atraumatic)</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">NR 82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">eq 1060.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical forceps</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">BD577</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation

Primära vuxna fibroblaster har blivit ett viktigt verktyg för att studera fibros, fibroblast interaktioner och inflammation i alla kroppens vävnader. Eftersom primära fibroblaster inte kan dela på obestämd tid på grund av myofibroblast differentiering eller åldras induktion, nya kulturer måste fastställas regelbundet. Det finns dock flera hinder att övervinna under processerna för att utveckla ett tillförlitligt isolerings protokoll och primär fibroblast isolering själv: metodens svårighetsgrad (särskilt för nybörjare), risken för bakteriell kontaminering, nödvändig tid tills primära fibroblaster kan användas för experiment, och efterföljande cell kvalitet och lönsamhet. I denna studie, en snabb, tillförlitlig och lätt att lära sig protokoll för att isolera och odla primära vuxna fibroblaster från mus hjärta, lungor, lever och njure som kombinerar enzymatisk matsmältning och ultraljud agitation tillhandahålls.

Möjligheten för detta protokoll för att isolera vuxna fibroblaster från solid murin vävnad visades. Livskraftiga fibroblaster erhölls som kunde användas för efterföljande experiment som immunofluorescensfärgning eller proliferation experiment (figur 2D-F, figur 5A).
Vuxna fibroblaster är platt spindel-formade celler med flera cellulära processer som vanligtvis växer i enskiktslager<sup cl...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Vi presenterar ett protokoll för att isolera primära vuxna fibroblaster på ett enkelt, snabbt och tillförlitligt sätt, framföras av nybörjare (t. ex. studenter). Förfarandet kombinerar enzymatisk vävnad nedbrytning och mekanisk agitation med ultraljud vågor för att få primära fibroblaster. Protokollet kan enkelt anpassas till specifika experimentella krav (t. ex. mänsklig vävnad).

Ultraljud-förstärkt primär vuxen fibroblast isolering

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Vårt protokoll ger och enkel och snabb strategi för primär fibroblast isolering med ett tydligt fokus på att undvika bakterier kontaminering, vilket kan vara ett stort problem. Speciellt för nybörjare. Den största fördelen med vår teknik är dess enkelhet.Eftersom det inte kräver omfattande manuella färdigheter eller erfarenhet och det lätt kan läras av alla inom en kort utbildningsperiod. Presentera tekniken kommer att Manja Newe, en tekniker från ut laboratorium. Innan du börjar dissektionen, sätt på två par engångshandskar, en ovanpå den andra.Och fixa musen till en polystyren pad. Desinficera pälsen med 70%etanol, se till att djuret är genomdränkt. Och använd etanolsteriliserade kirurgiska tlyktor och atraumatisk sax för att kopp huden precis ovanför urogenital tarmkanalen.Skär tre till fyra centimeter längs mittlinjen från det inledande snittet till halsen, lägga lättnad skär vid armar och ben. Och stift huden till dynan för att uppnå optimal tillgång till muskulaturen som täcker bukhålan. Därefter, desinficera buken muskulatur två gånger med färsk 70%etanol.När etanolen har torkat, ta bort det första paret handskar. Och använd en ny steril uppsättning av tärningar och saxar för att incise muskellagret för att öppna bukhålan och bröstkorgen. För att avlägsna organ av intresse, försiktigt greppa varje organ med de kirurgiska tycerna utan piercing vävnaden.Och använd saxen för att noggrant skära de försörjande blodkärlen nära inkörpunkten för orgeln. Placera varje organ i ett rör av steril, kall PBS och stäng röret tätt. Placera varje rör på våt is som organen samlas in.När alla organ har skördats, spraya rören med 70%etanol innan du placerar dem i en steril cellkultur huva. Iklädd ett färskt par handskar, använd sterila tärnor för att överföra varje organ på ena halvan av en steril sex centimeter Petriskål. Och tvätta kortfattat organen med färsk PBS för att ta bort överflödigt blod.Överför de sköljda organen till den andra halvan av varje Petriskål och avlägsna överskottet PBS. Med hjälp av två sterila skalpell, finhacka organen i en till två millimeter fragment. Och använd en steril spatel för att överföra vävnadsbitarna till nya, individuella, sterila, 15 milliliter rör.Lägg till två milliliter på 0,25%Trypsinlösning till varje rör. Och placera rören i en cellkultur inkubator på 37 grader Celsius i fem minuter. Vid slutet av inkubationen, vortexa rören på ca 1400 rotationer per minut i tio sekunder.Och arrestera Trypsin reaktionen med fyra milliliter av en lämplig odling medium kompletteras med fetala kalv serum per rör. Därefter lägger du till lämplig volym av kollagenasblandningslösning till varje rör. Och placera rören i en 37 grader Celsius ultraljud vattenbad i 10 minuter.I slutet av ultraljudsbehandling, försiktigt virvel rören i 10 sekunder. Innan du placerar rören tillbaka i ultraljud vattenbad i 10 minuter. I slutet av den andra ultraljudsbehandling, vortexa rören i 10 sekunder.Och desinficera rören med 70%etanol. I cellkulturhuven filtrerar du cellupphängningar genom enskilda 40 mikrometersiler till ett nytt, sterilt, 15 milliliterrör. Och samla in cellerna genom centrifugeringen.Återuppstänga pelletsen i en milliliter färskt medium per rör. Och se cellerna i lämpliga cellkulturkärl vid lämpliga pläteringstätheter. Placera sedan cellerna i cellkulturinkubatorn över natten.Nästa morgon, tvätta varje kultur tre gånger med PBS innan du lägger till färskt medium och återvänder cellerna till inkubatorn. Med hjälp av detta protokoll, kan livskraftiga fibroblaster erhållas för användning i efterföljande experiment. Såsom amino-fluorescerande färgning eller experiment spridning.Vuxna fibroblaster är platta, spindelformade celler med flera cellulära processer som vanligtvis växer i monolayers. Distinkta morfologiska skillnader i fibroblaster populationer från olika organ kan dock observeras. Till exempel, njurbred fibroblaster är mindre och växa vid högre tätheter än hjärt- eller lung- eller leverfibroblaster.De isolerade fibroblaster visar hög spridning priser, når en optisk sammanflödet av mer än 90%efter cirka sex dagar. Här kan en differentierad myofibroblast med särskiljande alfa glatt muskel aktin mikrofilament observeras. Dessa celler finns i överflöd i hjärtat, njure, lever, och lungcell kulturer.Medan endast cirka 20 till 30 procent av isolerade och odlade celler uttrycka ordnade, ordnade, alfa glatta muskel aktin mikrofilament, nästan alla celler är positiva för Vimentin och Discoidin Domain Receptor 2 efter sju dagar i kultur. Det viktigaste att komma ihåg är att använda rätt teknik under hela förfarandet som bakterier kontaminering måste undvikas. Efter primär fibroblastisolering kan cellerna användas för alla slags psykiatriexperiment och karakterisering.Såsom immuncystisk kemi spridning eller sårläkning essäer, eller molekylärbiologiska bedömningar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primär kultur av Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primärtumör och MEF Cell Isolation att studera lungmetastas

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering och odling av primära endotelceller från Canine artärer och vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolering och odling av vuxen råtta hjärtmuskelcellerna

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering av primära mänskliga Decidual celler från foster hinnor av termen efterbörd

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolering av primära mus hepatocyter för begynnande proteinsyntes analys av icke-radioaktiva L-azidohomoalanine märkning metoden

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering av Förmaksmyocyter från vuxna möss

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Murin hjärtinfarkt modell med permanent ligering av vänster främre fallande kranskärlssjukdom

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Förfinad KLARHET-baserad vävnadsrensning för tredimensionell fibroblastorganisation i friska och skadade mushjärtan

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Modifieringar av Langendorff-metoden för samtidig isolering av förmaks- och ventrikulära myocyter från vuxna möss

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...