Name: ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Biz uzman teknik destek için Bayan Romy Kempe ve Bayan Annett Opitz teşekkür ederiz. Biz de destek için Bay Bjoern Binnewerg teşekkür ederiz. Bu iş bir) tarafından destekleniyordu a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Tıp Fakültesi Carl Gustav Carus Dresden ve c) başka Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Tıp Fakültesi Carl Gustav Carus Dresden. Biz fon ve destek için minnettarız.

Aşağıdaki protokol Technische Universität Dresden, Almanya (dosya numarası: T 2014/4) yanı sıra uluslararası kabul görmüş hayvan bakım kuralları (FELASA)17kurumsal hayvan bakım yönergeleri takip eder. Şekil 1 hücre yalıtım sürecini görselleştirir.
1. Kurulum, malzeme ve medyayı hazırlama
<ol><li>Hazırlamak hücre kültürü orta, PBS çözüm, kolajenaz karışım stok çözüm (Re, 50 mg likofilized kolajenaz kar...

<ol>
	<li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+and+myofibroblasts:+what+are+we+talking+about.">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li><li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts.">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li><li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro:+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density.">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li><li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts:+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor.">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length.">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes:+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro.">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation.">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098 (2018).</li><li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tsch&#246;pe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells.">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Poulet, C., K&#252;nzel, S., B&#252;ttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li><li>G&#252;nd&#252;z, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes,+Endothelial+Cells,+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart.">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes.">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li><li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy.">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+Guidelines+and+Recommendations.">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).</li><li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density.">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li><li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems:+myofibroblasts+all+along.">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li><li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019)</li><li>Copp&#233;, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines.">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li><li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems.">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li></ol>

Mortalize fibroblast hücre hatları ile karşılaştırıldığında, primer fibroblastlar çeşitli avantajlar sunar. Yüksek kalitede ve miktarda verimli bir şekilde maliyet yalıtılabilir. Ayrıca, primer kültürler, elde edilen sonuçların güvenilirliğini artıran ve sadece hücre kültürü eserlerinin incelenmesi olasılığını azaltan birden fazla kişiden hücre Etüdü olanağı sunar. Yeni primer kültürlerin sürekli üretimi, tekrarlanan geçişte21' den sonra sıklıkla meyd...

Fibroblastlar, birden fazla stellat süreçleri ve geniş bir kaba endoplazmik retikulum ile düz, iğ şeklinde hücreler1,2. Ortalama bir fibroblast 30-100 μm ölçer ve 57 ± 3 gün1,3yaşam süresi vardır. İnsan fibroblastlarının ortalama hücre döngüsü süresi, kültür koşullarına göre 16-48 h arasında değişmektedir4. Kültürlü primer fibroblastların çoğaltılabilir kapasitesinin ve fonksiyonel kalitesinin, donör çağıyla olumsuz şekilde ilişkilendirileceğinden, Genç bağışçıların (hayvanların veya hastaların) mümkünse5,6 .
Fibroblastlar en memeli vücut dokularının baskın bir hücre türünü oluşturmaktadır. Her zaman bulundukları varlığa rağmen, fibroblastların moleküler tanımlaması hala bir zorluk7. Fibroblastlar, embriyonik gelişim sırasında farklı kaynaklardan gelen doku ve organlara göç etmek8. Bu nedenle, fibroblastlar içinde bulunan, her fibroblast nüfusunda bulunan ve fibroblastların özel olan benzersiz Marker proteinlerinin hala eksik olduğu bir bolluk Marker proteini vardır. Böylece, birçok tanınan işaretçileri ifade desenleri genellikle fibroblastlar tanımlamak için kullanılır. En tanınmış belirteçleri arasında vimentin, insan fibroblast yüzey proteini (hFSP), discoidin Domain reseptör 2 (DDR2) ve Alfa pürüzsüz Kas aksini (αSMA).
Fibroblastlar, büyük hücre içi matris (ECM) üreten hücreli tiptir. Böylece, fibroblastlar düzenli bir doku mimarisi korumak ve komşu hücreler için mekanik destek sağlamak1. ECM sentezi ile bozulma arasındaki denge iyi düzenlenmiş bir süreçtir. Sentez yönüne doğru vardiyalar, sonlandırılmadıkça fibrozis yol açan aşırı ECM birikmesi başlangıcına işaret ederler. Fibrozis, moleküler ve fenotektal değişikliklerden kaynaklanan aktif fibroblastlar kaynaklı myofibroblastlar tarafından aracılılar. Miyofibroblastların bir damgasını ECM ve sitokinlerin salgılanması ve düzenli olarak düzenlenmiş αSMA mikrofilemlerin ifadesi9.
Primer fibroblastlar, fibrozis, doku iltihabı ve fibroblast-kanser-hücre etkileşimlerine odaklanan son araştırmaların Spotlight olduğunu10,11. Ancak, sağlık ve hastalık fibroblast özellikleri etkili bir şekilde çalışmak için, düzenli olarak uygun primer erişkin fibroblastlar izole etmek gereklidir. Fibroblastlar12,13,14yalıtmak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Fibroblast izolasyonunun üç ana yöntemi, doku parçaları12, enzimatik doku sindirimi15ve boş organların enzimatik perfüzyon9,13,16büyüme vardır. Büyüme avantajı enzimatik hücre bozulması olmadan nazik bir yalıtım sürecidir. Öte yandan, büyüme kültürler genellikle hücreler deneyler için kullanılabilir kadar uzun süreli kültür dönemleri gerektirir. Yaygın enzimatik sindirim hızlı ama diğer hücre türleri ile kontaminasyon riski taşımaktadır (örneğin, endotel hücreleri) veya bakteri ajitasyon sürecinde, hangi mekanik doku çözülür için gerekli olan. Ayrıca, bu yöntemler genellikle ayrıntılı ve öğrenmek için zaman ve beceri gerektirir.
Araştırmalarda primer fibroblastların önemi ile ilgili olarak, mevcut hücre yalıtım yaklaşımlarını hızlı, basitlik ve güvenilirlik açısından optimize etmek için hala bir ihtiyaç vardır. Burada, yüksek kaliteli hücreler sunan bir yeni ultrasonik bazlı enzimatik fibroblast yalıtım yöntemi sağlanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1103px;" width="1103">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">T4049-100ML</td>
			<td style="width:405px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>Gibco LS15140148&#160;</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>51023608</td>
			<td>HeraSafe KSP15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>50049176</td>
			<td>BBD 6220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on vessel</td>
			<td>6-, 12-, 24-wells Nunclon surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell culture suction</td>
			<td style="width:339px;">VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td>
			<td>20727400</td>
			<td style="width:405px;">BVC professional suction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell strainer (mesh)</td>
			<td>Corning, Tewksbury, USA</td>
			<td style="width:143px;">431750</td>
			<td>40 &#181;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:143px;">75007213</td>
			<td>Megafuge 8R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cordless pipetting controller</td>
			<td>Hirschmann, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td>Pipetus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>SafeSeal tips for pipettes (10 &#181;l, 20 &#181;l, 100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Myco Medical, Cary, USA</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>Techno cut</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>41965-062</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:143px;">depends on volume</td>
			<td>50 &#181;l, 500 &#181;l, 1.500&#181;l, 2.000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase blend</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td style="width:143px;">5401020001</td>
			<td>Liberase TL Research Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 6 cm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Senescence detection kit</td>
			<td style="width:339px;">Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab65351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Shaker/ Vortex</td>
			<td style="width:339px;">IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td>
			<td style="width:143px;">n.a.</td>
			<td>MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile plastic tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td>
			<td>Falcon 352095</td>
			<td>BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:143px;">312</td>
			<td>Sonorex RK100H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors (atraumatic)</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">NR 82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">eq 1060.09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical forceps</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:143px;">BD577</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation

Primer erişkin fibroblastlar tüm vücut dokularında fibrozis, fibroblast etkileşimleri ve inflamasyonu incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir. Primer fibroblastlar myofibroblast farklılaşma veya senesans indüksiyon nedeniyle sonsuza kadar bölünemez beri, yeni kültürler düzenli olarak kurulmalıdır. Ancak, güvenilir bir yalıtım Protokolü ve primer fibroblast yalıtım kendisi geliştirme süreçleri sırasında üstesinden gelmek için birkaç engel vardır: zorluk yöntemin derecesi (özellikle yeni başlayanlar için), bakteriyel kontaminasyon riski, Primer fibroblastlar deneyler için kullanılabilir ve sonraki hücre kalitesi ve viability kadar gerekli zaman. Bu çalışmada, hızlı, güvenilir ve öğrenme kolay bir protokol izole etmek ve kültür birincil yetişkin fibroblastlar fare kalp, akciğer, karaciğer ve böbrek enzimatik sindirim ve ultrasonik ajitasyon birleştiren sağlanır.

Bu protokolün yetişkin fibroblastları katı duvar dokusundan yalıtmak için yeteneği gösterildi. İmmünofluoresesans boyama veya proliferasyon deneyleri (Şekil 2D-F, Şekil 5A) gibi sonraki deneyler için kullanılabilecek fibroblastlar elde edildi.
Erişkin fibroblastlar genellikle monolayers12,18büyümek birden fazla hücresel süre...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation at JoVE.com

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Protokolümüz, büyük bir sorun olabilecek bakteri kontaminasyonunu önlemeye odaklanarak primer fibroblast izolasyonu için kolay ve hızlı bir yaklaşım sağlar. Özellikle de yeni başlayanlar için. Tekniğimizin en büyük avantajı sadeliğidir.Geniş manuel beceri veya deneyim gerektirmez ve kısa bir eğitim süresi içinde herkes tarafından kolayca öğrenilebilir. Tekniği sunan Manja Newe, laboratuvar dışından bir teknisyen olacak. Diseksiyonun başlamasına başlamadan önce, biri üst üste olmak üzere iki çift tek kullanımlık eldiven giyin.Ve fareyi polistiren pede sabitle. Kürkü %70 etanol ile dezenfekte ederek hayvanın Sırılsıklam olduğundan emin olun. Ve etanol sterilize cerrahi forceps ve atravmatik makas sağ ürogenital sistem üzerinde cilt fincan kullanın.İlk kesiden boynuna kadar orta hat boyunca 3-4 santimetre kesin ve uzuvlarda kabartma kesikler eklenin. Ve karın boşluğu kapsayan kas en iyi erişim elde etmek için ped için deri pin. Sonra, taze% 70 etanol ile karın kas iki kez dezenfekte.Etanol kuruduğunda, ilk eldiven çiftini çıkarın. Ve karın boşluğu ve toraks açmak için kas tabakası incise için forceps ve makas yeni bir steril set kullanın. İlgi organları kaldırmak için, yavaşça doku piercing olmadan cerrahi forceps ile her organ kavramak.Ve makas dikkatle organın giriş noktası yakınında temin kan damarları kesmek için kullanın. Steril, soğuk PBS bir tüp içine her organ yerleştirin ve sıkıca tüp kapatın. Organlar toplanır gibi ıslak buz üzerinde her tüp yerleştirerek.Tüm organlar hasat edildiğinde, steril bir hücre kültürü başlık yerleştirmeden önce% 70 etanol ile tüpler sprey. Yeni bir çift eldiven giyerek, her organı steril altı santimetrelik Petri kabının yarısına aktarmak için steril çöfler kullanın. Ve kısaca fazla kan kaldırmak için taze PBS ile organları yıkayın.Durulan organları her Petri kabının ikinci yarısına aktarın ve fazla PBS'yi çıkarın. İki steril neşter kullanarak, organları bir ila iki milimetrelik parçalarhalinde doğrama. Ve doku parçalarını yeni, bireysel, steril, 15 mililitrelik tüplere aktarmak için steril bir spatula kullanın.Her tüpe %0,25 Tripsin çözeltisi iki mililitre ekleyin. Ve tüpleri 5 dakika lığına 37 derecede bir hücre kültürü kuvöze yerleştirin. Kuluçka sonunda, on saniye boyunca dakikada yaklaşık 1400 dönüşler tüpler girdap.Ve tüp başına fetal buzağı serumu ile takviye uygun bir kültür ortamı dört mililitre ile Tripsin reaksiyonu tutuklamak. Sonra, her tüp için kollajenaz karışım çözeltisi uygun hacmi ekleyin. Ve tüpleri 37 derece ultrasonik su banyosuna 10 dakika yerleştirin.Sonication sonunda, yavaşça 10 saniye boyunca tüpler girdap. 10 dakika daha ultrasonik su banyosu içine tüpler geri yerleştirmeden önce. İkinci sonication sonunda, 10 saniye daha tüpler girdap.Ve tüpleri %70 etanolle dezenfekte edin. Hücre kültürü başlığında, hücre süspansiyonlarını tek tek 40 mikrometresüzden yeni, steril, 15 mililitrelik bir tüpe süzün. Ve santrifüj ile hücreleri toplamak.Tüp başına bir mililitre taze ortamda peletleri yeniden askıya alın. Ve uygun kaplama yoğunluklarında uygun hücre kültürü damarlarında hücreleri görmek. Sonra, hücre kültürü kuluçka gece hücreleri yerleştirin.Ertesi sabah, taze ortam eklemeden ve hücreleri kuvöze geri vermeden önce her kültürü PBS ile üç kez yıkayın. Bu protokol kullanılarak, sonraki deneylerde kullanılmak üzere uygulanabilir fibroblastlar elde edilebilir. Amino floresan boyama veya proliferasyon deneyleri gibi.Erişkin fibroblastlar genellikle monolayers büyümek birden fazla hücresel süreçleri ile düz, iğ şeklinde hücrelerdir. Ancak farklı organlardan fibroblast popülasyonlarında belirgin morfolojik farklılıklar görülebilir. Örneğin, renal fibroblastlar daha küçüktür ve kardiyak, pulmoner veya hepatik fibroblastlara göre daha yüksek yoğunlukta büyürler.İzole fibroblastlar yüksek çoğalma oranları sergilerler ve yaklaşık altı gün sonra %90'dan fazla optik bir kesişme meydana ulaşırlar. Burada, ayırt edici alfa düz kas aktin mikrofilamentleri ile farklılaşmış bir miyofibroblast görülebilir. Bu hücreler kalp, böbrek, karaciğer ve akciğer hücre kültürlerinde bolmiktarda bulunur.İzole ve kültürlü hücrelerin sadece yaklaşık yüzde 20-30 düzenli ifade ederken, düzenlenmiş, alfa düz kas aktin mikrofilamentler, hemen hemen tüm hücrelerin Vimentin ve Diskoidin Etki Reseptörü için pozitif 2 kültür yedi gün sonra. Unutulmaması gereken en önemli şey, bakteri kontaminasyonundan kaçınılması gerektiği için prosedür boyunca doğru tekniği kullanmaktır. Primer fibroblast izolasyonundan sonra hücreler her türlü psikiyatri deneyi ve karakterizasyonu için kullanılabilir.İmmünsitik kimyanın çoğalması veya yara iyileşmesi denemeleri veya moleküler biyolojik değerlendirmeler gibi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

İnsan Vestibüler Schwannomalar İlköğretim Kültürü

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Sol Anterior İnen Koroner Arterin Kalıcı Ligasyonu ile Murine Miyokard Enfarktüsü Modeli

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Yetişkin Farelerden Atriyal ve Ventrikül Miyositlerinin Eşzamanlı İzolasyonu için Langendorff Yönteminin Modifikasyonları

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...