Name: assessing mineral availability in fish feeds using complementary methods demonstrated with the example of zinc in atlantic salmon
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon at JoVE.com

Эта работа была выполнена в рамках проекта APREMIA (Очевидная доступность и потребность в минералах в атлантическом лососе, грант No 244490), финансируемого Норвежским исследовательским советом.

<ol>
	<li>Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilisation+of+feed+resources+in+production+of+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+in+Norway.">Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway.</a> Aquaculture. 448, 365-374 (2015).</li><li>Prabhu, P. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+dietary+supply+of+microminerals+as+a+premix+in+a+complete+plant+ingredient-based+diet+to+juvenile+rainbow+trout+(Oncorhynchus+mykiss).">Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).</a> Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).</li><li>Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+biochemistry:+from+a+single+zinc+enzyme+to+a+key+element+of+life.">Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life.</a> Advances in nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).</li><li>Hogstrand, C., Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish Physiology. 31, 135-200 (2011).</li><li>Baeverfjord, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineral+nutrition+and+bone+health+in+salmonids.">Mineral nutrition and bone health in salmonids.</a> Reviews in Aquaculture. , (2018).</li><li>Maage, A., Julshamn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+zinc+status+in+juvenile+Atlantic+salmon+(Salmo+salar)+by+measurement+of+whole+body+and+tissue+levels+of+zinc.">Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc.</a> Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).</li><li>Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+zinc+in+fish+feed+by+size+exclusion+chromatography+coupled+to+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+&#8211;+Using+fractional+factorial+design+for+method+optimization+and+mild+extraction+conditions.">Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry &#8211; Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions.</a> Journal of Chromatography B. , (2018).</li><li>Prabhu, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+uptake+in+fish+intestinal+epithelial+model+RTgutGC:+Impact+of+media+ion+composition+and+methionine+chelation.">Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation.</a> Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).</li><li>Silva, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+availability+of+zinc,+selenium+and+manganese+as+inorganic+metal+salts+or+organic+forms+in+plant-based+diets+for+Atlantic+salmon+(Salmo+salar).">Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar).</a> Aquaculture. 503, 562-570 (2019).</li><li>Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+iron,+zinc,+sulfur+and+phosphorus+speciation+analysis+of+barley+grain+tissues+using+SEC-ICP-MS+and+IP-ICP-MS.">Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS.</a> Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).</li><li>Lothian, A., Roberts, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standards+for+Quantitative+Metalloproteomic+Analysis+Using+Size+Exclusion+ICP-MS.">Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Minghetti, M., Schirmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+media+composition+on+bioavailability+and+toxicity+of+silver+and+silver+nanoparticles+in+fish+intestinal+cells+(RTgutGC).">Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC).</a> Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).</li><li>Glover, C. N., Hogstrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+modulation+of+in+vivo+intestinal+zinc+absorption+in+freshwater+rainbow+trout.">Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout.</a> Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).</li><li>Ekman, R., Ekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. , 105-115 (2009).</li><li>Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+Size-Exclusion+Chromatography+for+the+Analysis+of+Protein+Biotherapeutics+and+Their+Aggregates.">A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates.</a> Journal of Liquid Chromatography &amp; Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).</li><li>Krezel, A., Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+inorganic+chemistry+of+zinc+ions.">The biological inorganic chemistry of zinc ions.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , (2011).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

На кишечное всасывание Zn, по-видимому, влияет химическая форма вида Zn13. В связи с этим использование протоколов, описанных в данной статье, позволило последовательно изучать химические и биологические аспекты, лежащие в основе «доступности» Zn в атлантическом лососе.
В этом исследовании сообщалось об использовании метода анализа видообразования Zn. Метод SEC-ICP-MS предоставил качественные данные о молекулярной массе химических веществ Zn, присутствующих в растворимой фракции корма атлантического лосося. Это было достигнуто путем сравнения времени удержания калибровочных эталонов молекулярной массы (т.е. тиреоглобулина (660 кДа), супероксиддисмутазы Zn/Cu (32 кДа), миоглобина (17 кДа) и витамина B12 (1,36 кДа)) со временем удержания Zn, содержащего пики. Проблемой, обнаруженной в анализе видообразования Zn, была идентификация неизвестных химических видов Zn из-за отсутствия аналитических стандартов. В SEC разделение молекул основано на их размерах относительно пор в стационарной фазе. В принципе, более крупные молекулы будут путешествовать быстрее, элюируя первыми, а меньшие молекулы будут путешествовать медленнее, элюируя позже14. Следовательно, каждый Zn, содержащий пик, может содержать несколько соединений с аналогичной молекулярной массой15. Это также способствует проблеме идентификации неизвестных химических видов Zn. Кроме того, для извлечения Zn было протестировано несколько мягких условий экстракции. Извлеченный Zn был низким (~10%). Мягкие условия экстракции были применены для сохранения химических веществ Zn нетронутыми, но это, возможно, поставило под угрозу эффективность экстракции7.
В анализе растворимости in vitro растворимость дополненного Zn (в виде радиоизотопа 65ZnCl2)показала, что аминокислоты, особенно гистидин и лизин, увеличивают растворимость Zn(рисунок 5). Использование образцов корма непосредственно для анализа растворимости in vitro в смоделированных желудочно-кишечных условиях основано на знании того, что изменение видообразования Zn зависит от рН16. Однако кислые условия в начале желудочно-кишечного тракта могут привести к некоторому изменению видообразования, которое может быть необратимым (например, ZnO-> ZnCl2,в присутствии HCl в кислых условиях в желудке). Тем не менее, источником Zn, используемым здесь, являетсяZnSO 4, растворимость которого была улучшена аминокислотами в среде. Следующий вопрос, на который необходимо ответить, заключался в том, можно ли перевести повышенную растворимость в доступность? Для изучения этого вопроса была использована клеточная линия кишечника RTgutGC. В контексте минерального питания у животных термин «доступность» трудно определить и может регулироваться дифференцированно в клетках (in vitro) по сравнению с животным (in vivo). Следовательно, термин «поглощение» использовался, когда дело доходило до оценки in vitro с использованием кишечной клеточной линии. Клеточная линия предоставила полезную информацию о механизмах поглощения Zn в кишечном эпителии, который является частью сложного регуляторного процесса, регулирующего доступность минералов у животных. Клетки RTgutGC вызывали лучшую способность к апикального поглощению Zn в присутствии аминокислоты (т.е. метионина; Рисунок 6). Однако кажущаяся доступность in vivo существенно не различаться между неорганическими и органическими источниками Zn в атлантическом лососе. В исследовании доступности in vivo сравнение источников Zn проводилось при диетических уровнях Zn, значительно превышающих известные потребности в Zn атлантического лосося17,общую концентрацию Zn 150 мг / кг корма. Различия в доступности лучше визуализируются, когда тестируемые диетические уровни падают в линейном динамическом диапазоне до того, как животное достигнет насыщения. В настоящем исследовании in vivo возможно, что атлантический лосось был хорошо насыщен для наблюдаемой разницы в поглощении Zn между используемыми источниками.
Таким образом, первый метод предоставил качественную информацию о различных химических видах Zn, обнаруженных в растворимой фракции корма атлантического лосося; второй способ, in vitro растворимость дополненного Zn улучшалась в присутствии аминокислотных лигандов; третий метод подтвердил, что улучшенная растворимость аминокислот может улучшить поглощение эпителия кишечника; и наоборот, четвертый метод не смог найти различий в доступности Zn от неорганического или органического источника до атлантического лосося. В заключение, хотя и не в соответствии с выводами in vivo, протоколы in vitro предоставили интересное понимание различных компонентов доступности Zn.

Рыбная мука и рыбий жир традиционно использовались в кормах для атлантического лосося. Однако эти ингредиенты все чаще заменяются растительными ингредиентами1. Вышеупомянутый сдвиг в составе кормов привел к низкой диетической доступности и увеличению потребности в улучшении минеральной доступности в кормах для атлантического лосося, особенно цинка (Zn)2. Снижение доступности может быть результатом изменения уровня Zn, химических веществ Zn и/или антипитательных факторов, присутствующих в матрице корма. В этом сценарии появился новый набор добавок, которые в целом считаются «органическими источниками», которые могут стать более доступным источником диетических минералов для рыбы. Поэтому важно понимать фундаментальную химию и физиологию, регулирующие доступность минералов и их источников для рыб. Цинк является важным микроэлементом для всех живых организмов3. Роль Zn как сигнальной молекулы была описана как на параклеточном, так и на внутриклеточном уровне у рыб4. У атлантического лосося дефицит Zn был связан со скелетными аномалиями и снижением активности различных металлоферментовZn 5,6.
Это исследование описывает систематический подход к пониманию доступности Zn путем его классификации на четыре различных отдела различной химической и биологической сложности. Используемые методы описаны в четырех разделах, как видно на фиг.1: (1)оценка химических веществ Zn в растворимой фракции корма атлантического лосося с использованием размерно-исключающей хроматографии с индуктивно связанной плазменной масс-спектроскопией (SEC-ICP-MS) метод7; (2) растворимость in vitro дополненного Zn в корме для атлантического лосося; (3) оценка поглощения химических веществ Zn кишечной моделью in vitro (RTgutGC)8; и (4) очевидная доступность Zn в атлантическом лососе(Salmo salar)9. Аналогичные протоколы могут быть разработаны для других минералов (например, марганца, селена, меди), представляющих питательный интерес для видов рыб аквакультуры.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1060px;" width="1060">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:240px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m membrane filter</td>
			<td style="width:240px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">10 % fetal bovine serum</td>
			<td style="width:240px;">Eurobio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter</td>
			<td style="width:240px;">LKB Wallac</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plates (Falcon, TPP microplates)&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10048760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks)</td>
			<td style="width:240px;">TPP Techno Plastic Products AG&#160;</td>
			<td style="width:119px;">90075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bradford assay kit</td>
			<td style="width:240px;">Bio-Rad</td>
			<td>5000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:240px;">Eppendorf Centrifuge 5702</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>30089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DL-methionine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">59-51-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">D-methionine</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>M9375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:415px;">Experimental fish feeds</td>
			<td style="width:240px;">Skretting</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glycine</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Guard column, TSKgel SWxl Type (7&#8239;&#956;m particle size)</td>
			<td style="width:240px;">Tosoh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>53319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS</td>
			<td style="width:240px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:240px;">Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck</td>
			<td>1.00317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knife mill</td>
			<td style="width:240px;">GM 300, Retsch Gmbh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-15 medium</td>
			<td style="width:240px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">&#160;21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-methionine&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>23128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Methanol</td>
			<td style="width:240px;">LiChrosolv, HPLC grade, Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.06035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Milli-Q water (18.2&#160;M&#937;&#160;cm)&#160;</td>
			<td style="width:240px;">EMD Millipore Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Myoglobin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">NexION 350D ICP-MS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td style="width:240px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pH meter&#160;</td>
			<td style="width:240px;">inoLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RTgutGC cells&#160;</td>
			<td style="width:240px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">SEC column, TSKgel G3000SWxl</td>
			<td style="width:240px;">Tosoh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve stainless steel (850&#8239;&#956;m - 1.12&#8239;mm)</td>
			<td style="width:240px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Thyroglobulin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine methanesulphonate</td>
			<td style="width:240px;">PharmaQ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline</td>
			<td style="width:240px;">Biowest</td>
			<td style="width:119px;">L0910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene EDTA solution</td>
			<td style="width:240px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Vitamin B12</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Zinc chelate of glycine</td>
			<td style="width:240px;">Phytobiotics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zinc sulphate</td>
			<td style="width:240px;">Vilomix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing mineral availability in fish feeds using complementary methods demonstrated with the example of zinc in atlantic salmon

Оценка доступности диетических микроминералов является серьезной проблемой в минеральном питании видов рыб. Целью настоящей статьи является описание системного подхода, сочетающего различные методологии оценки доступности цинка (Zn) в атлантическом лососе(Salmo salar). Учитывая, что несколько химических видов Zn могут присутствовать в корме атлантического лосося, было выдвинуто предположение, что доступность Zn зависит от химических веществ Zn, присутствующих в корме. Таким образом, в данном исследовании первый протокол касается того, как извлечь различные химические виды Zn из корма и проанализировать их методом масс-спектроскопии плазмы с индуктивно-индуктивно связанной плазменной (SEC-ICP-MS) с помощью исключения размеров. Впоследствии был разработан метод in vitro для оценки растворимости диетического Zn в кормах атлантического лосося. Третий протокол описывает метод изучения влияния изменения химического видового состава Zn на поглощение Zn в модели эпителия кишечника рыбы с использованием клеточной линии кишечника радужной форели (RTgutGC). Вместе результаты методов in vitro сравнивались с исследованием in vivo, изучающим очевидную доступность неорганических и органических источников Zn, добавляемых в корма атлантического лосося. Результаты показали, что в кормах можно найти несколько химических видов Zn, и эффективность органического источника Zn очень сильно зависит от аминокислотного лиганда, используемого для хелатного Zn. Результаты методов in vitro имели меньшую корреляцию с результатом исследования in vivo. Тем не менее, протоколы in vitro, описанные в этой статье, предоставили важную информацию о наличии Zn и его оценке в кормах для рыб.

Оценка химических веществ Zn в растворимой фракции корма атлантического лосося с использованием метода SEC-ICP-MS Метод SEC-ICP-MS предоставляет данные о химических видах Zn, обнаруженных в растворимой фракции корма атлантического лосося. На фиг.4 показан хроматографический профиль Zn, обнаруженный в растворимой фракции. Эта хроматограмма была получена с использованием метода SEC-ICP-MS. Пять Zn-содержащих пиков были обнаружены в растворимых фракциях корма атлантического лосося. Каждый пик имеет различную молекулярную массу; пик один (~ 600 кДа), пик два и пик третий (от 32 до 17 кДа), пик четыре (от 17 до 1,36 кДа) и пик пять (> 1,36 кДа). Пик четыре был самым обильным, за ним следовали пик два, три, пять и один соответственно. Химические вещества Zn, обнаруженные в растворимой фракции, могут иметь различные источники, поскольку используемый корм содержит как морские, так и растительные ингредиенты, а также дополненную форму (т.е. сульфат Zn). Диапазон молекулярной массы химических видов Zn предполагает, что эти соединения могут быть металлопротеинами.
Растворимость in vitro дополненного Zn в кормах для атлантического лосося Растворимость добавляемых 65Zn повышается в присутствии аминокислот. Все испытуемые аминокислоты повышали растворимость добавляемых 65Zn. Метионин, глицин, цистеин, гистидин и лизин улучшали растворимость на 65Zn; более высокая растворимость была обнаружена при гистидине и лизине(рисунок 5).
Оценка поглощения видов Zn с использованием кишечной модели in vitro (RTgutGC) На апикальный захват цинка в клетках RTgutGC значительно влияло присутствие L-Met или DL-Met в концентрациях 2 мМ. Кроме того, влияние метионина на поглощение Zn в клетках RTgutGC отрицательно влияло присутствие BCH (блокатора транспортной системы аминокислот) по сравнению с клетками, необработанными BCH(рисунок 6).
Очевидная доступность диетического Zn в атлантическом лососе(Salmo salar) В практических кормах для атлантического лосося очевидная доступность Zn была одинаковой при приеме добавок с неорганическим источником (сульфат Zn) или органическим источником (хелат Zn глицина). Оценочные значения кажущейся доступности Zn (%, n = 3) у атлантического лосося составили 31% ± 12% при приеме добавок с неорганическим источником (сульфат Zn) и 31% ± 3% при дополнении органического источника (хелат Zn глицина).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig1.jpg"> Рисунок 1:Краткое изложение системного подхода к оценке минеральной доступности с использованием дополнительных методов. Этот подход был использован для изучения доступности цинка в атлантическом лососе, включая видообразование Zn, растворимость Zn в кишечной среде, поглощение Zn кишечными клетками и кажущуюся доступность Zn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig2.jpg"> Рисунок 2:Краткое изложение процедуры извлечения Zn из образца корма. Цинк извлекается из образца корма с использованием мягких условий экстракции. За извлечением следует анализ видообразования Zn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig3.jpg"> Рисунок 3:Пример клеток RTgutGC через 1 ч (слева) и 1 неделю (справа) после посева в колбы для культуры клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig4.jpg"> Рисунок 4:Хроматограмма, показывающая Zn-содержащие пики из растворимой фракции корма атлантического лосося и проанализированная SEC-ICP-MS. Три реплики характеризуются синей, красной и черной линиями. Калибровку молекулярной массы проводили с использованием тиреоглобулина (660 кДа, мониторинг 127I), супероксиддисмутазы Zn/Cu (32 кДа, мониторинг 66Zn), миоглобина (17 кДа, мониторинг 57Fe), витамина B12 (1,36 кДа, мониторинг 59Co); Пик 1 (P1): ~600 кДа, время удержания (RT) 8,2 мин; Пик 2+3 (P2+3): от 32 до 17 кДа, RT 14,2 + 15,3 мин; Пик 4 (P4): от 17 до 1,36 кДа, RT 16,3 мин; Пик 5 (P5): > 1,36 кДа, Rt 23,2 мин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig5.jpg"> Рисунок 5:Влияние аминокислот на растворимость in vitro добавляемого Zn в кормах атлантического лосося. Данные представлены в виде среднего ± УР (n = 3). Данные были проанализированы с помощью односторонней ANOVA, за которой последовал тест на множественное сравнение Даннета, сравнивающий среднее значение каждой группы АА с контрольной группой (без АА). Звездочками обозначен уровень значимости ANOVA (P-значения < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) и < 0,0001 (****)). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig6.jpg"> Рисунок 6:Влияние метионина и ингибитора транспорта аминокислот (2-Аминобицикло [2.2.1]гептан-2-карбоновой кислоты, BCH, 10 мМ). Данные представлены в виде среднего ± УР (n = 3). Данные были проанализированы с помощью двустороннего ANOVA, за которым последовал тест туки с множественным сравнением с уровнем значимости p < 0,05. Пост-специальные различия между группами представлены в виде надстрочного индекса над полосами; бары с разными надстрочными индексами статистически различны (p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Настройки ВЭЖХ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Столбец</td>
			<td>Колонка SEC (30 см x 7,8 мм, размер частиц 5 мкм) + защитная колонна (размер частиц 7 мкм)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Диапазон калибровки</td>
			<td>1.0 × 104 - 5.0 × 105 да</td>
		</tr>
<tr>
<td>Мобильная фаза</td>
			<td>50 мМ Tris-HCl + 3% MeOH (рН 7,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Расход</td>
			<td>0,7 мл мин−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Объем впрыска</td>
			<td>50 мкл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Параметры ICP–MS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Мощность вперед</td>
			<td>1550 Вт</td>
		</tr>
<tr>
<td>Поток плазменных газов</td>
			<td>15.0 л мин−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Расход газа-носителя</td>
			<td>0,86 л мин−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Поток подпитывного газа</td>
			<td>0,34 л мин−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Время пребывания</td>
			<td>0,1 с на изотоп</td>
		</tr>
<tr>
<td>Мониторинг изотопов</td>
			<td>
127 г. I, 66Zn, 59Co, 57Fe</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Обзор настроек приборов для ВЭЖХ и МСП-МС.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Химический состав (мМ)</td>
			<td>L15/ex</td>
			<td>Экспериментальная среда (L15/FW)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нитрат натрия</td>
			<td>155</td>
			<td>155</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нитрат калия</td>
			<td>6.2</td>
			<td>6.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Магния сульфат</td>
			<td>3.8</td>
			<td>19.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нитрат кальция</td>
			<td>1.5</td>
			<td>5.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>ХЕПЕС</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Магния хлорид</td>
			<td>-</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Пируват натрия</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Галактоза</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>рН</td>
			<td>7.1</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ионная сила</td>
			<td>178</td>
			<td>258</td>
		</tr>
<tr height="36">
<td>Ионный состав (мММ)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Кальций, Ca2+ *
</td>
			<td>1.6 ± 0.1</td>
			<td>5.3 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Магний, Мг2+ *
</td>
			<td>3.9 ± 0.3</td>
			<td>32.5 ± 0.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Калий, К+ *
</td>
			<td>8.2 ± 1.2</td>
			<td>8.6 ± 1.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Натрий, Na+ *
</td>
			<td>160 ± 3</td>
			<td>157 ± 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нитрат, NO3- **
</td>
			<td>164</td>
			<td>172.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сульфат, SO4- **
</td>
			<td>3.8</td>
			<td>18.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Хлорид, Cl- **
</td>
			<td>1.5</td>
			<td>31.5</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2. Химический и ионный состав экспериментальной среды проверен.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon at JoVE.com

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

В данной статье подробно объясняется системный подход к оценке наличия микроминеральности у атлантического лосося. Методология включает в себя инструменты и модели с возрастающей биологической сложностью: (1) химический анализ видообразования, (2) растворимость in vitro, (3) исследования поглощения в клеточных линиях и (4) исследования in vivo рыб.

Оценка минеральной доступности в кормах для рыб с использованием дополнительных методов, продемонстрированная на примере цинка в атлантическом лососе

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Мы изучали наличие растворимости микрометаллов, таких как цинковый селен, с различными химическими формами или источниками, как мы его называем, в контексте изменения состава корма. В радионуклидном наборе взвесьте приблизительно 0,2 грамма образцов корма для молотого атлантического лосося и смешайте его с радиоиндикатором цинка известной специфической активности в пробоотборной трубке объемом в пять миллилитров. Подготовьте шесть других аликвот буфера и добавьте одну из аминокислот, показанных здесь, к каждой, чтобы достичь конечной молярной концентрации в пять миллимоляров.Добавьте пресноводный кишечный просветный буфер для подачи образца. Затем добавьте пресноводный кишечный просветный буфер к буферным аликвоткам, содержащим аминокислоты. Закройте трубки и вращайте их на ротационном спиннере со скоростью 25 оборотов в минуту в течение 30 минут.Затем центрифугируют по 1, 157 х г в течение 10 минут, чтобы отделить растворимые и нерастворимые фракции. Используйте гамма-кассиру для измерения количества в минуту радиоиндикатора цинка в растворимых и нерастворимых фракциях. Дважды промыть клеточную линию кишечника радужной форели одним миллилитром раствора ЭДТА и выкачивать раствор после каждой промывки пипеткой.Обработать промытые клетки 0,25% раствором трипсина. Осторожно поверните колбу под острыми углами в течение двух минут. Затем добавляют 10 миллилитров среды L-15, содержащей 5% FBS, чтобы нейтрализовать трипсин.Используя стерильную пипетку, декантировать полученную суспензию ячейки в коническую нижнюю центрифужную трубку. Центрифуга при 130 x G в течение трех минут. Затем с помощью гемоцитометра определяют плотность собранных клеток методом ручного подсчета.Посейте клетки на 24 пластины лунки при плотности клеток 50 000 клеток на миллилитр на лунку и инкубируйте пластины при 19 градусах Цельсия в нормальной атмосфере в течение 48 часов до экспериментов. После кормления рыб в течение 11 дней и усыпления их, соберите объединенный образец фекалий рыбы, сняв с вентрального плавника до ануса и поместите его на тарелку. Используйте шпатель для переноса кала с пластины в коническую трубку размером 50 миллилитров.Немедленно храните образцы при 20 градусах Цельсия. В этом исследовании минеральная доступность кормов для рыб оценивается с использованием ряда дополнительных методов. Репрезентативный анализ кормов атлантического лосося с помощью метода масс-спектрометрии плазменной масс-спектрометрии с исключением размеров индуктивно-связанной плазмы дает данные о химических видах цинка, обнаруженных в растворимой фракции.В этой фракции можно увидеть пять пиков, содержащих цинк, каждый с различной молекулярной массой. Химические вещества цинка, обнаруженные в растворимой фракции, могут иметь различные источники, потому что используемый корм содержит как морские, так и растительные ингредиенты и дополняется. Диапазон молекулярной массы этих видов предполагает, что эти соединения могут быть металлопротеинами.В то время как растворимость дополненного цинка 65 увеличивает присутствие всех протестированных аминокислот, более высокая растворимость обнаруживается с гистидином и лизином. На поглощение апикального цинка в клетках Arteca GC значительно влияет присутствие L-Met или DL-Met в двух миллимолярных концентрациях. Кроме того, на влияние метионина на поглощение цинка отрицательно влияет присутствие МГБ.Основным преимуществом этого протокола является то, что мы попытались объединить различные подходы в визуальных, аналитических и инвиво-исследованиях, сравнить и дополнить друг друга, когда дело доходит до изучения минеральной доступности.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Очистка М. magneticum Штамм AMB-1 Magnetosome белка, связанного MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Геном Редактирование с помощью пользовательских CompoZr нуклеаз цинкового пальца (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Перепрограммирование соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) Использование ретровирусных вектор с GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Прочная 3D рыбу ДНК с использованием меченых зондов непосредственно

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов Cut открыть Вазелин Gap Напряжение-зажим Техника С флуорометрии

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Оценка Виды-конкретный вклад в черепно-лицевой развития Использование Перепела-утки химер

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Наблюдение и Количественная теломер и повторяющихся последовательностей с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация (FISH) с зондами PNA<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...