Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

وقد دعم هذا العمل مجلس بحوث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC, RGPIN-2019-04658)؛ NSERC اكتشاف إطلاق الملحق للباحثين الوظيفي المبكر (DGECR-2019-00081) وجامعة ماكغيل.

1. تحليل البروتينات IP- أو PI ملزمة عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب والنشاف الغربية
<ol><li>نمو الخلايا والخلايا والكروماتوغرافيا المتقاربة
	<ol><li>تنمو خلايا T. بروسي إلى مرحلة منتصف السجل ورصد صلاحية الخلية وكثافتها. يكفي ما مجموعه 5.0 × 107 خلايا لفاكس واحد ملزم.<ol>
<li>لأشكال مجرى...

تحديد البروتينات التي تربط إلى IPs أو PIs أمر بالغ الأهمية لفهم الوظيفة الخلوية من هذه الأيض. يوفر التصوير اللوني المتقارب المقترن باللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي فرصة لتحديد البروتينات المتفاعلة بين بروتوكول الإنترنت وPI وبالتالي اكتساب رؤى حول وظيفتها التنظيمية. IPs أو PIs الموسومة كيمي...

الفوسفات الإينوزيتول (IPs) وفوسفوينوسيتيدات (PIs) تلعب دورا مركزيا في علم الأحياء eukaryote من خلال تنظيم العمليات الخلوية مثل السيطرة على التعبير الجيني1،2،3، الاتجار الحويصلة 4، إشارة transduction5،6، التمثيل الغذائي7،8،9، والتنمية8،10. الوظيفة التنظيمية لهذه الأيض ينتج عن قدرتها على التفاعل مع البروتينات وبالتالي تنظيم وظيفة البروتين. عند الربط بواسطة البروتينات، قد تغير التأثيرات الدولية وPIs مطابقة البروتين11، النشاط الحفاز12، أو التفاعلات13 وبالتالي تؤثر على وظيفة الخلوية. يتم توزيع الـ IPs وPIs في مقصوراتدون خلوية متعددة، مثل النواة 2،3،14،15،الشبكية الإندوبلازمية16،17، البلازما غشاء1 وسيتوسول18، إما المرتبطة البروتينات3،19 أو مع RNAs20.
يؤدي انشقاق PI المرتبط بالغشاء (4,5)P2 بواسطة phospholipase C إلى إطلاق Ins(1,4,5)P3، والتي يمكن أن تكون فوسفورية أو منزوعة الفوسفور بواسطة كيناز IP وفوسفاتاس، على التوالي. الـ IPs هي جزيئات قابلة للذوبان يمكن ربطها بالبروتينات وممارسة الوظائف التنظيمية. على سبيل المثال، Ins(1,4,5)P3 في ميتازوان يمكن أن تكون بمثابة رسول الثاني عن طريق ربط مستقبلات IP3، مما يحفز التغيرات المطابقة مستقبلات وبالتالي الإفراج عن Ca2+ من مخازن داخل الخلايا11. Ins(1,3,4,5)P4 يربط إلى مجمع deacetylase الهيستون وينظم تجميع البروتين معقدة والنشاط13. وتشمل الأمثلة الأخرى على الوظيفة التنظيمية IPs السيطرة على منظمة الكروماتين21،RNA النقل22،23،RNA التحرير24،والنسخ1،2،3 . وعلى النقيض من ذلك ، غالبا ما ترتبط مؤشرات ببس مع توظيف البروتينات إلى غشاء البلازما أو أغشية الجهازية25. ومع ذلك، فإن خاصية الناشئة من PIs هو القدرة علىربط مع البروتينات في بيئة غير membranous 3،15،19،26. هذا هو الحال بالنسبة للعامل الستيرويدوجينيك مستقبلات النووية، والتي يتم تنظيم وظيفة التحكم النسخي من قبل PI (3،4،5) P319، وبوليميراز بولي-A التي يتم تنظيم النشاط الأنزيمي من قبل PI النووية (4،5) P226. وقد تبين دور تنظيمي للإيبي وPIs في العديد من الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة22،27، خلايا الثدييات19،23، Drosophila10 والديدان28. من المهم دور هذه الأيض في التربانوسوم، التي تختلف في وقت مبكر من النسب eukaryotic. هذه الأيض تلعب دورا أساسيا في تريبانوسوما بروسي التحكم النسخي1,3, تطوير8, التكوين الحيوي العضوي وحركة البروتين29,30 , 31 , 32، وتشارك أيضا في السيطرة على التنمية والعدوى في مسببات الأمراض T. كروزي33،34،35،توكسوبلازما36 والبلازموديوم 5 , 37- ومن ثم، فإن فهم دور الملوثات العضوية المُسَوِّعين والـ "بي آي آي" في التربانوسوم قد يساعد على توضيح الوظيفة البيولوجية الجديدة لهذه الجزيئات وتحديد أهداف جديدة للمخدرات.
خصوصية البروتين والملكية الفكرية أو ربط PI يعتمد على مجالات تفاعل البروتين وحالة الفوسفور من الإينوزيتول13،38، على الرغم من أن التفاعلات مع الجزء الدهني من PIs يحدث أيضا19. توفر مجموعة متنوعة من الـ IPs وPIs وكيناز وتعديلها وفوسفاتاتآلية خلوية مرنة للتحكم في وظيفة البروتين التي تتأثر بتوافر المستقلب ووفرة، وحالة الفسفور من الإينوزيتول، والبروتين تقارب التفاعل1،3،13،38. على الرغم من أن بعض مجالات البروتين تتميز بشكل جيد39،40،41،على سبيل المثال، مجال الهومولوجيا pleckstrin42 وSPX (S YG1 / P ho81 /XPR1) مجالات43 ،44،45، بعض البروتينات تتفاعل مع IPs أو PIs بواسطة الآليات التي لا تزال غير معروفة. على سبيل المثال، البروتين المقمع المنشط 1 (RAP1) من T. بروسي يفتقر إلى المجالات الملزمة PI الكنسية ولكن يتفاعل مع PI (3,4,5)P3 والنسخ التحكم في الجينات المشاركة في الاختلاف المضادة للجينات3. الكروماتوغرافيا التقاربية وتحليل الطيف الكتلي للبروتينات المتفاعلة IP أو PI من الخلايا التربانوسومأو الخميرة أو الثدييات حددت العديد من البروتينات دون مجالات مُعرفة ببروتوكول IP أو PI8،46، 47. وتشير البيانات مجالات البروتين غير مميزة إضافية التي تربط هذه الأيض. وبالتالي، فإن تحديد البروتينات التي تتفاعل مع الملوثات العضوية المُسَوِّقة أو الـ "بي آي" قد يكشف عن آليات جديدة للتفاعل بين البروتين والمستقلب والوظائف التنظيمية الخلوية الجديدة لهذه الجزيئات الصغيرة.
تستخدم الطريقة الموضحة هنا الكروماتوغرافيا المتقاربة إلى جانب النشاف الغربي أو قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتينات التي ترتبط بـ IPs أو PIs. ويستخدم الإيماء في الكائنات الحية أو PIs التي هي إما مرتبطة عبر streptavidin مترافقة مع حبات أغاروز أو بدلا من ذلك، التي تم التقاطها عن طريق الخرز المغناطيسي streptavidin المترافقة (الشكل1). توفر هذه الطريقة سير عمل بسيط حساس وغير مشع وخال ٍ من الدهون ومناسب للكشف عن ربط البروتينات من الليسات الخلوية أو البروتينات النقية3 (الشكل2). ويمكن استخدام هذه الطريقةفي 8أو46 أو إلى جانب قياس الطيف الكتلي الكمي المسمى بالأحماض الأمينية47 لتحديد البروتينات الملزمة للملكية الفكرية أو PI من العينات البيولوجية المعقدة. وبالتالي، فإن هذه الطريقة هي بديل للأساليب القليلة المتاحة لدراسة تفاعل النقاط التنفيذية أو مؤشرات ويب مع البروتينات الخلوية، وسوف تساعد في فهم الوظيفة التنظيمية لهذه الأيض في التربانوسوم وربما eukaryotes أخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

ينظم فوسفات الإينوزيتول وفوسفينيوسيتيدس العديد من العمليات الخلوية في eukaryotes، بما في ذلك التعبير الجيني، والاتجار بين الحويصلات، ونقل الإشارة، والتمثيل الغذائي، والتنمية. هذه الأيض أداء هذا النشاط التنظيمي عن طريق ربط للبروتينات، وبالتالي تغيير المطابقة البروتين، والنشاط الحفاز، و / أو التفاعلات. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم الكروماتوغرافيا تقارب إلى جانب قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربية لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. يتم تمييز فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات كيميائيا مع البيوتين، الذي يتم التقاطه بعد ذلك عن طريق streptavidin مترافقمع مع أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم عزل البروتينات من خلال تقاربها من ملزمة للالمستقلب، ثم تُقطَّع وتُحدَّد عن طريق قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربي. هذه الطريقة لديها سير عمل بسيط حساس، غير مشع، خاليمن الدهون، وقابل للتخصيص، ودعم تحليل تفاعل البروتين والمستقلب بدقة. ويمكن استخدام هذا النهج في أساليب قياس الطيف الكتلي الكمي التي تحمل علامة الأحماض الأمينية لتحديد تفاعلات البروتين المستقلب في العينات البيولوجية المعقدة أو باستخدام البروتينات النقية. تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل البروتينات من التريبانوسوما بروسي، ولكن يمكن تكييفه مع الطفيليات البروتوزوان ذات الصلة ، الخميرة أو خلايا الثدييات.

تحليل RAP1 و PI(3,4,5)P3 التفاعل بواسطة الكروماتوغرافيا التقارب ية والنشاف الغربي يوضح هذا المثال تطبيق هذا الأسلوب لتحليل ربط PIs بواسطة RAP1 من T. بروسي lysate أو عن طريق البروتين T. brucei RAP1 المؤتلف T. brucei. Lysates من T. بروسي أشكال مجرى الدم التي تعبر عن الهيماغلوتينين (HA) الموسومة RAP1...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

يركز هذا البروتوكول على تحديد البروتينات التي تربط فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. ويستخدم الكروماتوغرافيا تقارب مع فوسفات الإينوزيتول biotinylated أو فوسفوينوسيتيدات التي يتم تعطيلها عن طريق streptavidin إلى أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم تحديد فوسفات الإينوزيتول أو البروتينات الملزمة phosphoinositide عن طريق النشاف الغربية أو قياس الطيف الكتلي.

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

إن فوسفات إينوزيتول والفوسفوينوسيتيدات هي مستقلبات لها وظائف تنظيمية عديدة في نوى نياريوتي، بما في ذلك التحكم في التعبير الجيني، والاتجار بالبروتين، وإشارات نقل البيانات، وتطوير الخلايا. أنها تؤدي هذه الوظيفة التنظيمية عن طريق ربط البروتينات، وبالتالي تغيير بروتين التشكل، والنشاط الحفاز، أو التفاعلات البروتين. تحديد البروتينات التي ترتبط فوسفات إينوزيتول أو فوسفينوسيتيدس ضروري لفهم كيفية أداء تلك الأيضات وظيفتها التنظيمية.يحتوي هذا البروتوكول على سير عمل بسيط حساس وغير مشع ومجاني ويستخدم الكواشف المتاحة تجاريًا. في هذه الطريقة، يتم استخدام التصوير اللوني الانتهاء مع الفوسفات إينوزيتول biotinylated أو فوسفينوسيتيديسيد، لعزل البروتينات التفاعل، ثم يتم تحديدها بواسطة لطخة الغربية، أو قياس الطيف الشامل. لأشكال مجرى الدم، تنمو الخلايا T.brucei إلى منتصف مرحلة السجل في وسائل الإعلام HMI-9، تكملها 10٪ FBS، في 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.الحفاظ على كثافة الخلية بين 800، 000 و 1.6 مليون خلية لكل ملليلتر. عندما تكون جاهزة، الطرد المركزي الخلايا في 1600 مرات G، وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تجاهل supernatant، وإعادة بلطف بيليه في 10 milliletres من برنامج تلفزيوني-G ساخنة مسبقا في 37 درجة مئوية لغسل الخلايا.الطرد المركزي الخلايا في 1600 مرات G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لإكمال الغسيل. كرر هذا الإجراء غسل مرتين أكثر. ثم إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني-G.نقل هذا التعليق إلى نقطة واحدة أنبوب 5 ملليلتر، ثم الطرد المركزي في 1600 مرات G لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant، وssuspend بيليه في نقطة الصفر خمس ملليلتر من العازلة تحلل، تستكمل مع نقطة واحدة خمسة X protease المانع كوكتيل، واحد X فوسفاتاز المانع كوكتيل التي تم تبريدها مسبقا على الجليد لتحلل الخلايا. الطرد المركزي في 1400 مرة G وعند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.بعد هذا جمع المابير، الذي يحتوي على البروتينات الطفيلية المستخرجة، في نقطة واحدة جديدة أنبوب خمسة ملليلتر للمقايس ملزمة. جانبا 5٪ من lysate الإجمالي لتحليل البقع الغربية. جمع 50 ميكرولترات من الفوسفات إينوزيتول أو فوسفينوسيتيدات مترافق إلى الخرز agarose, وإضافة 500 ملليلتر من العازلة ملزمة.جهاز طرد مركزي في 1000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. تجاهل supernatant ، وإعادة الربط في 50 ميكرولترات من العازلة ملزمة لتكبيل الخرز. استخدام الخرز غير مترافق كتحكم، واستخدام الخرز مع تكوينات فوسفات مختلفة بما في ذلك أشكال غير الفوسفورية، للسيطرة على التفاعلات غير محددة.بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من الخرز IP أو PI إلى الخلية أو البروتينات النقية. الحفاظ على حجم الخرز في حدود 10٪ من lysate الإجمالي. إذا لزم الأمر، استخدم المخزن المؤقت الملزم لضبط حجم رد فعل الربط.احتضان رد الفعل لمدة ساعة واحدة أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية، في حين تدور في 50rpm. بعد هذا، الطرد المركزي في مزيج 1000 مرات G، وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة عظمى، والحفاظ على بيليه، مع التأكد من الحفاظ على 5٪ من supernatant لتحليل البقعة الغربية.ثم إضافة ملليلتر واحد من العازلة الغسيل والصنبور أو دوامة الأنبوب لإعادة تعليق الراتنج. الطرد المركزي رد الفعل في 1000 مرة G، وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة، والتخلص من الفائق. كرر هذه العملية لما مجموعه خمسة يغسل.بعد هذا، إضافة 50 ميكروليترس من 2X Laemmli العازلة تكملها 710 ميليمولار 2-mercaptoethanol إلى الخرز. اضغط أو دوامة لخلط، وتمييع البروتينات. بعد ذلك، الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، والطرد المركزي في 10،000 مرات G لمدة دقيقة واحدة.جمع المابير، وإما تجميد الوميروز في ناقص 80 درجة مئوية، أو المضي قدما في تحليل البقع الغربية. الأسلوب المعروض هنا يستخدم لتحليل ربط PIs بواسطة بروتين الكبت المنشط 1 من T.brucei lysate ، أو عن طريق T.brucei المؤتلفة T.brucei قمع المنشط البروتين 1 البروتين. كما تفتقر RAP1 المجالات ملزمة PI الكنسي, يتم تنفيذ عمليات الفحص الملزمة مع PIs التي هي غير الفوسفورية, أو التي phosphorylated في مواقف مختلفة من حلقة إينوزيتول, ومع الخرز agarose غير متقارنة.التحليل الغربي يبين أن RAP1 يرتبط بشكل تفضيلي إلى PI (3، 4، 5) خرزات P3، ولكن أيضا أنه يربط إلى حد أقل إلى PI(4، 5) خرز P2. ومع ذلك، فإنه لم يرتبط بأي PIs أخرى أو الخرز agarose. لاختبار ما إذا كان RAP1 يرتبط مباشرة بـ PIs ، يتم التعبير عن بروتين 6XHis المؤتلف من 6XHis المؤتلف وتنقيته إلى تجانس من E.Coli.يظهر النشاف الغربي أن زيادة تركيز PI (3، 4، 5) P3، ولكن ليس PI(4، 5)P2، يمنع التفاعل من RAP1 المؤتلف مع PI(3، 4، 5) خرز P3. إضافة T.brucei تنقية انزيم PIP5Pase إلى رد فعل استعادة PI (3، 4، 5) P3 ملزمة من قبل RAP1 المؤتلف. ويرجع ذلك إلى PIP5Pase dephosphorylation من PI الحرة (3, 4, 5) P3, وبالتالي يشير إلى أن نمط الفوسفور من هذا المستقلب ضروري لراب1 لدينا ملزمة.البروتينات التي ترتبط بـ Ins(1، 4، 5) P3 يتم تحديدها بعد ذلك بواسطة اللوني المتقاربة متبوعة بالمسح الطيفي الكتلي. تحليل SDS-PAGE يظهر الإثراء في البروتينات مائل من Ins(1، 4، 5) خرزات P3، مقارنة مع البروتينات مائل من الخرز agarose السيطرة. تحليل الطيف الكتلي للبروتينات المائلة حددت أكثر من 250 البروتينات منها 84 المخصب مع Ins (1، 4، 5) خرز P3، مقارنة مع الخرز التحكم.إن إثراء البروتينات المرتبطة بـ Ins(1, 4, 5)P3, مقارنة مع الخرز التحكم, يرتبط مع إشارة البروتين التي اكتشفتها SDS-PAGE. ومن الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول استخدام الضوابط المناسبة، للتمييز بين التفاعلات غير المحددة. نوصي باستخدام الخرز agarose غير مترافق, والخرز المقترنة مع فوسفات إينوزيتول أو فوسفوينوزيتيديس, باستخدام تكوينات الفوسفات المختلفة, بما في ذلك أشكال غير الفوسفورية.يمكن تطبيق هذه الطريقة على الطفيليات البروتوزوانية أحادية الخلية الأخرى ، مثل تريبانوزوما كروزي ، الليشمانيا ، أو البلازموديوم. ويمكن أيضا أن تتكيف بسهولة مع الكائنات الحية الأخرى، بما في ذلك الخميرة أو خلايا الثدييات. ويمكن أن يقترن هذا الأسلوب إلى القياس الطيفي الكتلة الكمية, مثل سيلاك, لتحديد التفاعلات الديناميكية من البروتينات مع فوسفات إينوزيتول أو فوسفوينوستيدات.في يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع تجزئة تحت الخلية, لتحديد البروتينات العضوية محددة التي ترتبط هذه الأيض. وقد ساعد هذا النهج لتحديد البروتينات التي ترتبط الفوسفات إينوزيتول وفوسفينوسيتيديس في T.brucei, خلايا الثدييات, والخميرة. وقد ساعد في تحديد مجالات البروتين الجديدة التي ترتبط فوسفينوسيتيدس.وقد مهدت الطريق لفهم الوظيفة التنظيمية لهذه الأيضات، ودورها في التعبير الجيني، وتطوير الخلايا، وإشارات نقل في eukaryotes. بعض الكواشف في هذا البروتوكول سامة، أو قابلة للاشتعال. استخدام معدات الحماية الشخصية، وعند الضرورة، والعمل في غطاء الدخان.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...