Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC,RGPIN-2019-04658)的支持;NSERC 发现发布早期职业研究人员补充 (DGECR-2019-00081) 和由麦吉尔大学。

1. 通过亲和色谱和西方印迹分析IP或PI结合蛋白
<ol><li>细胞生长、致莱和亲和色谱
	<ol><li>将T.布鲁氏细胞生长到中日志阶段,并监测细胞的存活性和密度。总共 5.0 x 107个细胞足以进行一次结合测定。<ol>
<li>对于血液形式,在HMI-9培养基中生长细胞,在37°C和5%CO2下辅以10%的胎儿牛血清(FBS)。使细胞密度保持在 8.0 x 105至 1.6 x 106细胞/mL 之间。 注:密度?...

识别与IP或P结合的蛋白质对于理解这些代谢物的细胞功能至关重要。与西印体或质谱结合的亲和色谱提供了识别IP或PI相互作用蛋白的机会,从而获得对其调节功能的见解。IP 或 P 化学标记 [例如,Ins(1,4,5)P3 化学上与生物蛋白相关]并通过链球蛋白与腺糖珠交联,或由链球蛋白磁珠捕获,从而可以分离相互作用的蛋白质,然后通过质量识别这些蛋白光谱学或西方污点。这里描述的修饰已经被用来识别来?...

肌醇磷酸盐 (IP) 和磷酸磷酸(PIs) 通过调节细胞过程(如控制基因表达1、2、3、囊泡贩运)在真核生物中起着核心作用4,信号转导5,6,代谢7,8,9,和发育8,10。这些代谢物的调节功能源于它们与蛋白质相互作用的能力,从而调节蛋白质功能。当蛋白质结合后,IP和P可能改变蛋白质构象11,催化活性12,或相互作用13,从而影响细胞功能。IP 和 P 分布在多个亚细胞室中,如核2、3、14、15、内质神经质16、17、等离子体膜1和细胞醇18,要么与蛋白质3,19或与RNA20相关。 
磷脂酶C的膜相关PI(4,5)P2的裂解导致Ins(1,4,5)P3的释放,该P3可分别通过IP激酶和磷酸酶进行磷酸化或脱磷。IP 是可溶性分子,可与蛋白质结合并发挥调节功能。例如,元群中的Ins(1,4,5)P3可以通过与IP3受体结合,作为第二信使,诱导受体构象变化,从而从细胞内存储11释放Ca2+。Ins(1,3,4,5)P4与组蛋白脱乙酰酶复合物结合,并调节蛋白质复合组装和活性13。IP调节功能的其他例子包括染色质组织控制21、RNA传输22、23、RNA编辑24和转录1、2、3.相反,PIs通常与血浆膜或细胞膜25中蛋白质的招募有关。然而,PIs的一个新兴特性是在非膜环境中与蛋白质关联的能力3,15,19,26。这是核受体类固醇因子的情况,其转录控制功能受PI(3,4,5)P319和聚A聚合酶的酶,酶活性由核PI(4,5)P226调节。IP和P的调节作用已在许多生物体中显现出来,包括酵母22,27,哺乳动物细胞19,23,果蝇10和蠕虫28。重要的是这些代谢物在锥体中的作用,它很早就偏离了真核系。这些代谢物在锥虫细胞瘤布鲁氏转录控制1,3,发育8,细胞器生物发生和蛋白质流量29,30中起重要作用,31,32,还参与控制病原体T.cruzi33、34、35、弓形虫36和疟原虫的发育和感染5,37.因此,了解IP和P在锥体中的作用可能有助于阐明这些分子的新生物功能,并确定新的药物靶点。
蛋白质和IP或PI结合的特异性取决于蛋白质相互作用域和肌醇13、38的磷酸化状态,尽管与PI脂质部分的相互作用也发生19。I 和 P 的种类及其修饰的激酶和磷酸酶为控制蛋白质功能提供了灵活的细胞机制,该机制受代谢物可用性和丰度、肌醇磷酸化状态和蛋白质的影响交互的亲和力 1,3,13,38。虽然某些蛋白质域具有很好的特征39、40、41, 例如, 普列克斯特林同源域42和 SPX (S YG1/Pho81/XPR1) 域43 ,44,45,一些蛋白质与IP或P通过机制仍然未知相互作用。例如,T.Brucei的抑制剂激活蛋白1(RAP1)缺乏规范的PI结合域,但与PI(3,4,5)P3相互作用,并控制与抗原变异3有关的基因的转录。对来自锥体、酵母或哺乳动物细胞的IP或PI相互作用蛋白的亲和色谱和质谱分析,确定了几种没有已知IP或PI结合域的几种蛋白质8,46。47.数据表明,与这些代谢物结合的其他未定性蛋白质域。因此,识别与IP或P相互作用的蛋白质可能会揭示蛋白质-代谢物相互作用的新机制,以及这些小分子的新细胞调节功能。
此处描述的方法采用亲和色谱与西方印迹或质谱相结合,以识别与 IP 或 P 结合的蛋白质。它使用生物回位化 IP 或 P,它们要么与链球菌珠联结成交结,要么通过链球蛋白结合的磁珠捕获(图 1)。该方法提供了一个简单的工作流程,是敏感的,非放射性的,无脂素体,适合检测来自细胞泄漏或纯化蛋白质3的蛋白质结合(图2)。该方法可用于无标签8、46或与氨基酸标签定量质谱47耦合,以识别复杂生物样品中的IP或PI结合蛋白。因此,这种方法是研究IP或P与细胞蛋白相互作用的少数方法的替代方法,将有助于了解这些代谢物在锥体中,也许在其他真核生物中的调节功能。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

肌醇磷酸盐和磷酸磷化物调节真核细胞中的多个细胞过程,包括基因表达、囊泡贩运、信号转导、代谢和发育。这些代谢物通过与蛋白质结合来执行此调节活性,从而改变蛋白质构象、催化活性和/或相互作用。此处描述的方法使用与质谱或西方印迹耦合的亲和色谱法来识别与磷酸肌醇或磷酸磷酸醇相互作用的蛋白质。肌醇磷酸盐或磷酸磷酸剂与生物锡在化学上标记,然后通过链球菌与甘蔗或磁珠结合捕获。蛋白质通过与代谢物结合的亲和力进行分离,然后通过质谱或西方印迹进行洗脱和识别。该方法具有一个简单的工作流程,是敏感的,非放射性的,无脂质体,可定制的,支持蛋白质和代谢物相互作用的精确分析。这种方法可用于无标签或氨基酸标签的定量质谱方法,以识别复杂生物样品中的蛋白质-代谢物相互作用或使用纯化蛋白质。该协议针对分析来自锥虫病的布鲁氏蛋白进行了优化,但可以适应相关的原生动物寄生虫、酵母或哺乳动物细胞。

亲和力色谱与西方印迹对RAP1和PI(3,4,5)P3相互作用的分析 此示例说明了此方法的应用,通过T. 布鲁氏酸酶或重组T. 布鲁比RAP1 蛋白分析 RAP1 对 PI 的结合。T. 布鲁西亚血流形式的流合物形成表达血凝素 (HA) 标记 RAP1 用于结合测定.RAP1是一种参与转录控制变异表面糖蛋白(VSG)基因3,48的蛋白质,它编码了抗原变异49中参与寄生虫?...

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Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

该协议侧重于识别与磷酸肌醇或磷酸磷酸剂结合的蛋白质。它使用亲和色谱与生物异化异酸醇磷酸盐或磷酸磷酸酯,通过链球菌固定到胶质或磁珠。磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸二醇结合蛋白通过西方印迹或质谱法鉴定。

通过亲和色谱与西布洛特或质谱结合的亲致色谱,识别磷酸磷酸磷酸磷酸醇或磷酸蛋白

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

肌醇磷酸盐和磷酸磷酸是代谢物，在真核生物中具有多种调节功能，包括控制基因表达、蛋白质贩运、信号转导和细胞发育。它们通过与蛋白质结合来执行这些调节功能，从而改变蛋白质的构象、催化活性或蛋白质相互作用。识别与磷酸肌醇或磷酸西肽结合的蛋白质对于了解这些代谢物如何执行其调节功能至关重要。该协议具有一个简单的工作流程，是敏感，非放射性的，无光体，并使用商业上可用的试剂。在这种方法中，用生物基化肌醇磷酸盐或磷酸酯完成色谱，用于分离相互作用的蛋白质，然后由西方印迹或质谱仪识别。对于血流形式，在HMI-9介质中将T.brucei细胞生长到中生期，辅以10%FBS，温度为37摄氏度，二氧化碳含量为5%。保持细胞密度在80万到160万细胞每毫升之间。准备就绪后，在1600倍G下将细胞离心，在室温下离心10分钟。丢弃上一液，轻轻将颗粒重新在 10 毫安的 PBS-G 中，在 37 摄氏度下预热，以清洗细胞。在 1600 倍 G 和室温下将细胞离心五分钟，以完成洗涤。再重复两次此洗涤程序。然后将颗粒重新在一毫升PBS-G中重新暂停。将此悬浮液转移到一点五毫升管，然后在 1600 次 G 下离心五分钟。丢弃上流剂，将颗粒重新在零点五毫升的解液缓冲液中，辅以一点五 X蛋白酶抑制剂鸡尾酒，以及一种在冰上预冷却的X磷酸酶抑制剂鸡尾酒，以解液细胞。在1400倍G和4摄氏度下离心10分钟。在此收集上清液，其中含有提取的寄生虫蛋白，到一个新的一点五毫升管结合测定。留出5%的总莱酸盐用于西部印迹分析。收集50微升的肌醇磷酸盐或磷酸西肽结合到琼糖珠，并添加他们500毫升的结合缓冲液。在 1000 倍 G 下离心一分钟。丢弃上流水，重新在50微升的结合缓冲器中平衡珠子。使用非偶联珠作为控制，并使用具有不同磷酸盐配置的珠子（包括非磷酸化形式）来控制非特异性相互作用。接下来，在细胞糖酸盐或纯化蛋白质中加入50微升IP或PI珠。将珠子的体积控制在总落酸的10%以内。如有必要，使用绑定缓冲器调整绑定反应的体积。在4摄氏度下孵育反应一小时或过夜，同时以50rpm旋转。在此之后，将混合物在1000倍G下离心，在4摄氏度下离心1分钟。取出上一液，并保留颗粒，确保保持5%的上半液进行西印分析。然后加入一毫升的洗涤缓冲液，然后敲击或旋转管子以重新暂停树脂。在1000倍G下离心反应，在4摄氏度下离心1分钟，然后丢弃上一代。重复此过程，总共进行五次洗涤。在此之后，加入50微升的2X莱姆利缓冲液，并辅以710毫摩尔2-甲醇到珠子。点击或涡流混合，稀释蛋白质。接下来，在95摄氏度下加热5分钟，在10，000次G下离心1分钟。收集上一液，或在零下80摄氏度冻结水线，或进行西部印迹分析。本文介绍的方法用于分析从T.brucei赖解物的抑制剂活化蛋白1或重组T.brucei抑制剂-活化蛋白1蛋白的PI结合。由于 RAP1 缺乏规范 PI 绑定域，结合测定使用非磷酸化的 PI 执行，或在肌醇环的不同位置进行磷酸化，以及使用非结合的琼糖珠进行。西方分析表明，RAP1优先绑定到PI（3，4，5）P3珠子，但它也绑定到PI（4，5）P2珠子的程度较小。然而，它并没有绑定到任何其他PI或红玫瑰珠。为了测试RAP1是否直接与PI结合，从E.Coli将表达并纯化为均匀性C端标记的6XHis重组RAP1蛋白。西方印迹表明，增加PI（3，4，5）P3的浓度，但不是PI（4，5）P2，抑制重组RAP1与PI（3，4，5）P3珠的相互作用。T.brucei纯化PIP5Pase酶加入反应恢复PI（3，4，5）P3结合重组RAP1。这是因为PIP5Pase脱磷脱磷基的免费PI（3，4，5）P3，因此表明这种代谢物的磷酸化模式是必不可少的，我们的RAP1结合。与 Ins（1，4，5）P3 结合的 T.brucei 蛋白随后通过亲和色谱法进行识别，然后进行质谱法测定。SDS-PAGE分析显示，从因斯（1，4，5）P3珠子中分出的蛋白质富含，而从控制糖珠中分出的蛋白质则具有丰富的含量。与控制珠相比，对发现超过250种蛋白质的洗样蛋白质进行质谱分析，其中84种蛋白质富含因斯（1、4、5）P3珠。与控制珠相比，与 Ins（1、4、5）P3 结合的蛋白质的富集与SDS-PAGE检测到的蛋白质信号相关。此协议的一个关键步骤是使用适当的控件，以区分特定和非特定交互。我们建议使用非偶联琼珠，使用与肌醇磷酸盐或磷酸酯结合的珠子，使用各种磷酸盐配置，包括非磷酸化形式。此方法可应用于其他单细胞原生动物寄生虫，如锥虫瘤、利什曼病或疟原虫。它也可以很容易地适应其他生物体，包括酵母或哺乳动物细胞。此方法可与定量质谱法（如SILAC）耦合，以识别蛋白质与磷酸肌醇或磷酸酶的动态相互作用。在中也可以与亚细胞分馏相结合，以识别与这些代谢物结合的细胞器特异性蛋白质。这种方法有助于识别与磷酸肌醇和磷酸磷酸酶结合的蛋白质，包括哺乳动物细胞和酵母中的磷酸磷酸盐。它帮助识别了与磷脂结合的新蛋白质域。它为了解这些代谢物的调控功能、它们在基因表达、细胞发育和真核生物信号转导中的作用铺平了道路。该协议中的一些试剂是有毒的，或易燃的。使用个人防护设备，必要时在烟罩中工作。

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

方法可视化和用透射电子显微镜分析膜蛋白的相互作用

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Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

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Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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