Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Dette arbejde blev støttet af Canadas naturvidenskabs-og ingeniør Forskningsråd (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch supplement til Early Career forskere (DGECR-2019-00081) og af McGill University.

1. analyse af IP-eller PI-bindende proteiner ved affinitets kromatografi og Western blotting
<ol><li>Cellevækst, lysis og affinitets kromatografi
	<ol><li>Grow T. brucei celler til mid-log fase og overvåge cellelevedygtighed og tæthed. I alt 5,0 x 107 celler er tilstrækkelig til en bindende analyse.<ol>
<li>For blodbanen former, dyrke celler i HMI-9 medier suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS) ved 37 °C og 5% CO2. Hold celletætheden mellem 8,0 x 105 t...

Identifikationen af proteiner, der binder sig til IPs eller Pi'er, er afgørende for at forstå disse metabolitters cellulære funktion. Affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri giver mulighed for at identificere IP-eller PI-interagerende proteiner og dermed få indsigt i deres reguleringsfunktion. IPS eller pi'er, der er kemisk mærkede [f. eks. ins (1, 4, 5) P3 kemisk forbundet med biotin] og tværbundet til aganerede perler via streptavidin eller fanget af streptavidin magnetiske perler ...

Inositol phosphater (IPS) og phosphoinositides (pi'er) spiller en central rolle i eukaryote biologi gennem regulering af cellulære processer såsom kontrol af genekspression1,2,3, vesikle handel 4, signaltransduktion5,6, metabolisme7,8,9, og udvikling8,10. Den regulerende funktion af disse metabolitter skyldes deres evne til at interagere med proteiner og dermed regulere protein funktion. Ved binding af proteiner kan IPs og Pi'er ændre protein konformationen11, katalytisk aktivitet12eller interaktioner13 og dermed påvirke cellulær funktion. IPS og pi'er distribueres i flere subcellulære rum, såsom Nucleus2,3,14,15, endoplasmatiske reticulum16,17, plasma membran1 og cytosol18, enten associeret med proteiner3,19 eller med RNAs20.
Spaltningen af membranen-associeret PI (4,5) P2 ved fosfolipase C resulterer i frigivelse af ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforyleres eller defosforyleres ved henholdsvis IP-kinaser og fosfataser. IPs er opløselige molekyler, der kan binde sig til proteiner og udøve regulerende funktioner. For eksempel, ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungere som en anden budbringer ved binding til IP3 receptorer, som inducerer receptoren konformationsmæssige ændringer og dermed frigivelse af ca2 + fra intracellulære butikker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder sig til Histon deacetylase-komplekset og regulerer protein kompleks montage og aktivitet13. Andre eksempler på IPS reguleringsfunktion omfatter kontrol af kromatin organisation21, RNA transport22,23, RNA redigering24, og transkriptionen1,2,3 . I modsætning hertil er pi'er ofte forbundet med rekruttering af proteiner til plasma membranen eller organelle membraner25. Men en ny ejendom af pi'er er evnen til at associere med proteiner i et ikke-membranøs miljø3,15,19,26. Dette er tilfældet med den nukleare receptor akut faktor, som transkriptional kontrolfunktion er reguleret af PI (3, 4, 5) P319, og poly-A polymerase hvilken enzymatisk aktivitet er reguleret af nukleare PI (4,5) P226. En regulerende rolle for IPS og pi'er er blevet vist i mange organismer, herunder gær22,27, pattedyrceller19,23, Drosophila10 og Worms28. Af betydning er disse metabolitters rolle i trypanosomer, som afveg tidligt fra den eukaryotiske afstamning. Disse metabolitter spiller en væsentlig rolle i Trypanosoma brucei transkriptional Control1,3, Development8, organelle Biogenese og protein Traffic29,30 , 31 , 32, og er også involveret i at kontrollere udvikling og infektion i patogener T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 og Plasmodium 5 , 37. derfor kan forståelse af IPS ' og pi's rolle i trypanosomer bidrage til at belyse nye biologiske funktioner for disse molekyler og identificere nye narkotikaprækursorer.
Specificiteten af protein og IP eller PI binding afhænger af protein interagere domæner og fosforylering tilstand af inositol13,38, selv om interaktioner med lipiddelen af pi'er også forekommer19. Variationen af IPs og Pi'er og deres modificerende kinaser og fosfataser giver en fleksibel cellulær mekanisme til kontrol af protein funktion, som påvirkes af metabolitten tilgængelighed og overflod, fosforylering tilstand af inositol, og protein affinitet af interaktion1,3,13,38. Selv om nogle protein domæner er velkarakteriserede39,40,41, fx pleckstrin homologi Domain42 og SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domæner43 ,44,45, nogle proteiner interagerer med IPS eller pi'er af mekanismer, der forbliver ukendte. For eksempel mangler den repressor-aktivator protein 1 (RAP1) af T. brucei CANONICAL pi-binding domæner, men INTERAGERER med PI (3, 4, 5) P3 og kontrol transkriptionen af gener involveret i antigen variation3. Affinitets kromatografi og massespektrometri-analyse af IP-eller PI-interagerende proteiner fra trypanosome, gær eller pattedyrsceller identificerede flere proteiner uden kendte IP-eller PI-bindings domæner8,46, 47. dataene tyder på yderligere ukarakteriserede protein domæner, der binder sig til disse metabolitter. Derfor, identifikation af proteiner, der interagerer med IPs eller Pi'er kan afsløre nye mekanismer af protein-metabolit interaktion og nye cellulære regulerende funktioner for disse små molekyler.
Den beskrevne metode beskæftiger sig med affinitets kromatografi koblet til Western blotting eller massespektrometri for at identificere proteiner, der binder sig til IPs eller Pi'er. Det bruger biotinylerede IPs eller Pi'er, der enten er tværbundet til streptavidin konjugeret til aganerede perler eller alternativt, fanget via streptavidin-konjugeret magnetiske perler (figur 1). Metoden giver en enkel arbejdsgang, der er følsom, ikke-radioaktiv, liposome-fri og er egnet til påvisning af binding af proteiner fra celle lysater eller renset proteiner3 (figur 2). Metoden kan anvendes i etiket-fri8,46 eller koblet til aminosyre-mærket kvantitativ massespektrometri47 til at identificere IP eller PI-bindende proteiner fra komplekse biologiske prøver. Derfor er denne metode et alternativ til de få metoder til rådighed til at studere samspillet mellem IPs eller Pi'er med cellulære proteiner og vil hjælpe med at forstå den regulerende funktion af disse metabolitter i trypanosomes og måske andre eukaryoter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

Inositol phosphater og phosphoinositides regulere flere cellulære processer i eukaryoter, herunder genekspression, vesikelprotein handel, signaltransduktion, metabolisme, og udvikling. Disse metabolitter udfører denne regulerings aktivitet ved at binde sig til proteiner og derved ændre protein konformationen, katalytisk aktivitet og/eller interaktioner. Den beskrevne metode bruger affinitets kromatografi koblet til massespektrometri eller Western blotting til at identificere proteiner, der interagerer med inositol phosphater eller phosphoinositides. Inositol phosphater eller phosphoinositides er kemisk mærket med biotin, som derefter fanges via streptavidin konjugeret til agopstået eller magnetiske perler. Proteiner isoleres ved deres affinitet af binding til metabolitten, derefter elueres og identificeres ved massespektrometri eller Western blotting. Metoden har en enkel arbejdsgang, der er følsom, ikke-radioaktiv, liposome-fri, og tilpasselig, støtte analyse af protein og metabolit interaktion med præcision. Denne fremgangsmåde kan anvendes i label-fri eller i aminosyre-mærkede kvantitative massespektrometri metoder til at identificere protein-metabolit interaktioner i komplekse biologiske prøver eller ved hjælp af rensede proteiner. Denne protokol er optimeret til analyse af proteiner fra Trypanosoma brucei, men det kan tilpasses til beslægtede protozoer parasitter, gær eller pattedyrceller.

Analyse af RAP1 og PI (3, 4, 5) P3 interaktion ved affinitets kromatografi og Western blotting Dette eksempel illustrerer anvendelsen af denne metode til at analysere bindingen af pi'er ved RAP1 fra t. brucei lysat eller ved rekombinant T. brucei RAP1 protein. Lysates af T. brucei blodbanen former, der udtrykker hemagglutinin (ha)-Tagged RAP1 blev brugt i bindende assays. RAP1 er et protein, der er involveret i transkriptional kontrol af variant overflade glykoprotein (VSG) ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Denne protokol fokuserer på identifikation af proteiner, der binder sig til inositol phosphater eller phosphoinositides. Det bruger affinitets kromatografi med biotinylerede inositol phosphater eller phosphoinositides, der er immobiliseret via streptavidin til agopstået eller magnetiske perler. Inositol fosfat eller phosphoinositide binding proteiner er identificeret ved Western blotting eller massespektrometri.

Identifikation af inositol fosfat eller Phosphoinositide interagerende proteiner ved affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Inositolphosphat og fosforinositider er metabolitter, der har flere regulerende funktioner i eukaryoter, herunder kontrol af genekspression, proteinhandel, signaltransduktion og celleudvikling. De udfører disse regulerende funktion ved at binde sig til proteiner, og dermed ændre protein kropsbygning, katalytisk aktivitet, eller protein interaktioner. Identifikation af proteiner, der binder sig til inositolfosfat eller fosforinositider, er afgørende for at forstå, hvordan disse metabolitter udfører deres regulerende funktion.Denne protokol har en simpel arbejdsgang, der er følsom, ikke-radioaktiv, lyposome gratis og bruger reagenser, der er kommercielt tilgængelige. I denne metode, en færdig kromatografi med biotinyleret inositolphosphat eller fosforinositider, bruges til at isolere interagerende proteiner, de er derefter identificeret ved vestlige blot, eller massespektrometri. For blodbanen former, vokse T.brucei celler til midten log fase i HMI-9 medier, suppleret med 10% FBS, på 37 grader Celsius, med 5% kuldioxid.Hold celletætheden mellem 800, 000 og 1,6 millioner celler pr. milliliter. Når du er klar, centrifuge cellerne på 1600 gange G, og ved stuetemperatur i 10 minutter. Kassér supernatanten, og opsvar forsigtigt pellet i 10 millileter PBS-G forvarmet ved 37 grader Celsius for at vaske cellerne.Centrifuge cellerne ved 1600 gange G og ved stuetemperatur i fem minutter for at fuldføre vasken. Gentag denne vaskeprocedure to gange mere. Derefter resuspend pellet i en milliliter PBS-G.Denne suspension overføres til et 5 milliliterrør med et punkt fem milliliterrør, hvortil centrifugeres ved 1600 gange G i fem minutter. Kassér supernatanten, og opsvar pellet i nulpunkt fem milliliter lysis buffer, suppleret med et punkt fem X proteasehæmmer cocktail, og en X fosfatase hæmmer cocktail, der er blevet forkølet på is til lyse cellerne. Centrifuge lysatet ved 1400 gange G og ved fire grader Celsius i 10 minutter.Efter dette indsamle supernatant, som indeholder de ekstraherede parasit proteiner, i en ny et punkt fem milliliter rør til bindende assays. Der er afsat 5% af det samlede lysat til western blot-analyse. Saml 50 mikroliter inositolfosfater eller fosforinositides konjugeret til agaroseperler, og tilsæt dem 500 milliliter bindende buffer.Centrifuge ved 1000 gange G i et minut. Kassér supernatanten, og resuspend i 50 mikroliter af bindende buffer for at lyvne perlerne. Brug ikke-konjugerede perler som et kontrolelement, og brug perler med forskellige fosfatkonfigurationer, herunder ikke-fosforylerede former, til at styre for uspecifik interaktioner.Dernæst tilsættes 50 mikroliter IP eller PI perler til cellen lysate eller de rensede proteiner. Hold mængden af perler inden for 10% af det samlede lysate. Brug om nødvendigt bindingsbufferen til at justere bindingsreaktionens volumen.Inkuber reaktionen i enten en time eller natten over ved fire grader Celsius, mens du roterer ved 50 omdr./min. Efter dette, centrifuge blandingen på 1000 gange G, og ved fire grader Celsius i et minut. Fjern supernatant, og holde pellet, og sørg for at holde 5% af supernatant for vestlige blot analyse.Derefter tilsættes en milliliter vask buffer og tryk eller hvirvle røret til resuspendre harpiksen. Centrifuge reaktionen ved 1000 gange G, og ved fire grader Celsius i et minut, og kassér supernatant. Gentag denne proces for i alt fem vaske.Derefter tilsættes 50 mikroliter 2X Laemmli buffer suppleret med 710 millimolar 2-mercaptoethanol til perlerne. Tryk eller vortex at blande, og fortyndes proteiner. Dernæst varme ved 95 grader Celsius i fem minutter, og centrifuge på 10,000 gange G i et minut.Saml supernatant, og enten fryse eluat ved minus 80 grader Celsius, eller gå videre til vestlige blot analyse. Den metode, der præsenteres her, bruges til at analysere bindingen af PI'er ved repressor-aktivatorprotein 1 fra T.brucei lysat eller ved rekombinant T.brucei repressor-aktivatorprotein 1 protein. Da RAP1 mangler kanoniske PI-bindingsdomæner, udføres de bindende analyser med PI'er, der ikke er fosforylerede, eller som er fosforyleret på forskellige positioner i inositolringen, og med ikke-konjugerede agaroseperler.Vestlige analyser viser, at RAP1 fortrinsvis binder sig til PI(3, 4, 5)P3 perler, men at det også binder sig i mindre grad til PI(4, 5)P2 perler. Men det ikke binder sig til andre PU'er eller agarose perler. For at teste, om RAP1 binder direkte til PI'er, udtrykkes og renses et C-terminalt mærket 6XHans rekombinant RAP1-protein udtrykkes og renses til homogenitet fra E.Coli.Western blotting viser, at en forøgelse af koncentrationen af PI(3, 4, 5)P3, men ikke PI(4, 5)P2, hæmmer samspillet mellem rekombinant RAP1 med PI(3, 4, 5)P3 perler. Tilsætning af T.brucei renset PIP5Pase enzym til reaktionen restaureret PI(3, 4, 5)P3 bindende ved rekombinant RAP1. Dette skyldes PIP5Pase dephosphorylation af fri PI(3, 4, 5)P3, og indikerer således, at fosforylationsmønsteret for denne metabolit er afgørende for vores RAP1 binding.T.brucei proteiner, der binder sig til Ins(1, 4, 5)P3 identificeres derefter ved affinitetkromatografi efterfulgt af massespektrometri. SDS-PAGE analyse viser berigelse af proteiner eluted fra Ins (1, 4, 5)P3 perler, sammenlignet med proteiner eluted fra kontrol agarose perler. Massespektrometrianalyse af de eluterede proteiner identificerede over 250 proteiner, hvoraf 84 blev beriget med ins(1, 4, 5)P3 perler, sammenlignet med kontrolperler.Berigelse af proteiner bundet til Ins(1, 4, 5)P3, sammenlignet med kontrolperler, korrelerer med proteinsignalet, der detekteres af SDS-PAGE. Et kritisk skridt i denne protokol er brugen af passende kontroller, at diskriminere specifikke fra ikke-specifikke interaktioner. Vi anbefaler at bruge ikke-konjugerede agaroseperler og perler konjugeret med inositolphosphat eller fosforinositider ved hjælp af forskellige fosfatkonfigurationer, herunder ikke-fosforylerede former.Denne metode kan anvendes på andre encellede protozoparasitter, såsom Trypanosoma cruzi, leishmania eller plasmodium. Det kan også nemt tilpasses til andre organismer, herunder gær eller pattedyrceller. Denne metode kan kobles sammen med kvantitativ massespektrometri, såsom SILAC, for at identificere dynamiske interaktioner mellem proteiner med inositolphosphat eller fosforinostides.I kan også kombineres med subcellulær fraktionering, at identificere organelle specifikke proteiner, der binder sig til disse metabolitter. Denne fremgangsmåde har bidraget til at identificere proteiner, der binder sig til inositolphosphat og fosforinositides i T.brucei, pattedyrceller og gær. Det har hjulpet med at identificere nye proteindomæner, der binder sig til fosforinositider.Det har banet vejen for at forstå den regulerende funktion af disse metabolitter, deres rolle i genekspression, celleudvikling, og signal transduktion i eukaryoter. Nogle af reagenserne i denne protokol er giftige eller brandfarlige. Brug personlige værnemidler, og hvor det er nødvendigt, arbejde i en røghætte.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering af proteiner efter størrelse-eksklusions kromatografi koblet til multi-vinkel Light spredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...