Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC, RGPIN-2019-04658); השקת NSERC גילוי תוספת עבור חוקרים קריירה מוקדמת (DGECR-2019-00081) ועל ידי אוניברסיטת מקגיל.

1. ניתוח החלבונים של IP או PI-מחייב על ידי כרומטוגרפיה של אהדה ובלוק מערבי
<ol><li>צמיחת תאים, לליזה וכרומטוגרפיה של זיקה
	<ol><li>הגדל תאים T. brucei לשלב באמצע היומן ולפקח על הכדאיות וצפיפות התא. סך של 5.0 x 107 תאים מספיק עבור שיטת מחייב אחת.<ol>
<li>עבור טפסים במחזור הדם, לגדול תאים בתקשו?...

הזיהוי של חלבונים התאגד ל-IPs או לפיס הוא קריטי להבנת התפקוד התאי של מטבוליטים אלה. כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן החשופה המערבית או לספקטרומטר מסה מציעה הזדמנות לזהות את החלבונים באינטראקציה של IP או PI ומכאן לקבל תובנות על התפקוד הרגולטורי שלהם. שב ס או פיס כימית מתויג [למשל, Ins (1, 4, 5) P3 כימי...

אינוסיטול פוספטים (IPs) ו פוספהונוסידים (פיס) לשחק תפקיד מרכזי בביולוגיה איקריוטים באמצעות התקנה של תהליכים סלולריים כגון השליטה בביטוי הגנים1,2,3, שלפוחית הסחר 4, שינוי האותות של5,6, מטבוליזם7,8,9, ופיתוח8,10. הפונקציה התקינה של מטבוליטים אלה תוצאות מהיכולת שלהם אינטראקציה עם חלבונים ובכך לווסת את תפקוד החלבון. עם כריכה על ידי חלבונים, IPs ו-פיס עשויים לשנות את היווצרות חלבון11, פעילות קטליטי12, או אינטראקציות13 ומכאן להשפיע על הפונקציה התאית. שב ס ו-פיס מופצים בתאי משנה מרובים, כגון: גרעין2,3,14,15, אנפלזמית ברשת16,17, פלזמה ממברנה1 ו ציטוסול18, המשויכים לחלבונים3,19 או עם rnas20.
המחשוף של הממברנה המשויכת PI (4, 5) P2 ידי פוספוליפדאז C תוצאות בשחרור של Ins (1, 4, 5) P3, אשר יכול להיות זרחנים או deated על ידי הקיסים IP ו פוספאטטיות, בהתאמה. שב ס מולקולות מסיסים שיכולות לאגד חלבונים ולהפעיל פונקציות רגולטוריות. לדוגמה, Ins (1, 4, 5) P3 ב מטזוזה יכול לשמש כשליח השני על ידי מחייב IP3 קולטנים, אשר מעורר שינויים בקולטן ובכך לשחרר של Ca2 + מן חנויות תאיים11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 נקשר לקומפלקס הימרחליקלז ומסדיר הרכבה ופעילות של מורכבות חלבון13. דוגמאות אחרות של הפונקציה התקינה של IPs כוללות את השליטה של ארגון כרומטין21, rna תחבורה22,23, RNA עריכה24, ושעתוק1,2,3 . לעומת זאת, הפיס משויך לעתים קרובות לגיוס חלבונים לקרום הפלזמה או לקרומים האורגונל25. עם זאת, המאפיין המתעוררים של פיס הוא היכולת לקשר עם חלבונים בסביבה לא קרומי3,15,19,26. זהו המקרה של הגורם לקולטן גרעינית, אשר פונקציה שליטה ההמרה מוסדר על ידי PI (3, 4, 5) P319, ו-פולי פולימראז אשר פעילות אנזימטית מוסדר על ידי הגרעין PI (4, 5) P226. תפקיד רגולטורי עבור IPs ו-פיס הוצג באורגניזמים רבים כולל שמרים22,27, תאים מוחיים19,23, דרוסוהילה10 ותולעים28. המשמעות היא התפקיד של מטבוליטים אלה בטריאנוזומים, אשר התפצל מוקדם מן השושלת איקריוטית. מטבוליטים אלה לשחק תפקיד חיוני בטריאנוסומה ברוסייס1 בקרת שליטה,3, פיתוח8, ארגונית biogenesis ו חלבון התנועה 29,30 , מיכל בן 31 , 32, והם מעורבים גם פיתוח וזיהום של פתוגנים T. cruzi33,34,35, טוקסופלזמה36 ו פלמודיום מיכל 5 , 37. מכאן, הבנת התפקיד של IPs ו-הפיס בטריאנוזומים עשויים לסייע להבהיר פונקציה ביולוגית חדשה עבור מולקולות אלה ולזהות מטרות של סמים חדשניים.
הספציפיות של חלבון ו-IP או כריכת PI תלוי בתחומים של אינטראקציה חלבונים ואת המצב זירחון של אינוזיטול13,38, למרות אינטראקציות עם החלק השומנים של פיס גם מתרחשת19. מגוון של כתובות ה-Ip ו-פיס ושינוי שלהם מספק מנגנון הסלולר גמיש לשליטה בתפקוד החלבון אשר מושפע על ידי זמינות מטבוליזם ושפע, המצב של זירחון של inositol, וחלבון אהדה של אינטראקציה1,3,13,38. למרות כמה תחומים חלבונים מאופיינים היטב39,40,41, למשל, pleckstrin הומולוגיה תחום42 ו SPX (SYG1/Pho81/XPR1) תחומים43 ,44,45, כמה חלבונים אינטראקציה עם IPs או הפיס על ידי מנגנונים שאינם ידועים. לדוגמה, חלבון activator 1 (RAP1) של T. brucei חסר הקאנוני התחומים מחייב pi אבל אינטראקציה עם pi (3, 4, 5) P3 ושליטה שעתוק של גנים המעורבים וריאציה אנטי הגניים3. כרומטוגרפיה וניתוח הספקטרומטר ההמוני של החלבונים בעלי אינטראקציה של ip או pi מתוך טריאנומין, שמרים או תאי מיונקים זיהו מספר חלבונים ללא מחשבים מבוססי IP או pi-כריכה מסוג8,46, 47. הנתונים מציעים מחשבים נוספים שאינם מאופיינים בחלבון שתאגד לאותם מטבוליטים. מכאן, הזיהוי של חלבונים האינטראקציה עם IPs או הפיס עשוי לחשוף מנגנונים חדשניים של האינטראקציה חלבון-מטבוליט ופונקציות חדשות הרגולציה הסלולר עבור אלה מולקולות קטנות.
השיטה המתוארת כאן מעסיקה כרומטוגרפיה של אהדה בשילוב עם הדגמים המערביים או ספקטרומטר המסה כדי לזהות חלבונים הקושרים ל-IPs או לפיס. הוא משתמש ב-IPs biotinylated או ב-"פיס" המקושרים לstreptavidin בעלי מבטים לחרוזים או לחילופין, שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin-מצוייביים (איור 1). השיטה מספקת זרימת עבודה פשוטה רגישה, לא רדיואקטיבית, ליפומי-חינם, והיא מתאימה לזיהוי הכריכה של חלבונים מתאי ליטים או חלבונים מטוהרים3 (איור 2). ניתן להשתמש בשיטה ללא תווית8,46 או מצמידים לחומצות אמינו ממותגים בעלי שמות מספרים מבוססי חומצה אמימטריה47 כדי לזהות חלבונים של IP או PI-מחייב מדגימות ביולוגיות מורכבות. מכאן, שיטה זו היא חלופה לכמה שיטות זמין ללמוד את האינטראקציה של IPs או הפיס עם חלבונים סלולריים יסייע להבין את התפקוד הרגולטורי של מטבוליטים אלה בטריאנוזומים ואולי eukaryotes אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

מלחי אינוזיטול ופוספוליזידים מווסת מספר תהליכים סלולריים ב-eukaryotes, כולל ביטוי גנטי, סחר בסמים, התמרה של אותות, חילוף חומרים, ופיתוח. מטבוליטים אלה לבצע פעילות תקינה זו על ידי איגוד לחלבונים, ובכך שינוי היווצרות חלבון, פעילות קטליטי, ו/או אינטראקציות. השיטה המתוארת כאן משתמשת בכרומטוגרפיה של זיקה בשילוב עם הספקטרומטר המסה או הכתמים המערביים כדי לזהות חלבונים הפועלים באינטראקציה עם מלחי אינוזיטול או פוספופנוסיידים. הפוספטים inositol או פוספיונוסיידים הם כימית מתויג עם biotin, אשר נלכד אז באמצעות streptavidin מצועם מעלה או חרוזים מגנטיים. חלבונים מבודדים על ידי הזיקה שלהם של קשירה המטולוליט, ולאחר מכן הודללו וזוהו על ידי ספקטרומטר המסה או בלוק המערבי. השיטה יש זרימת עבודה פשוטה רגיש, לא רדיואקטיבי, ליפומי-חינם, להתאמה אישית, תמיכה בניתוח של חלבון ואינטראקציה מטבלייט עם דיוק. גישה זו יכולה לשמש ללא תווית או בחומצה אמינית מתויג כמותית שיטות המסה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-מטבוליט בדגימות ביולוגיות מורכבות או באמצעות חלבונים מטוהרים. פרוטוקול זה מותאם במיוחד לניתוח של חלבונים מטריאנוסומה ברוסייבי, אך ניתן להתאים אותו לטפילים פרוטוזוקיים, שמרים או מהיונקים.

אנליזה של RAP1 ו-PI (3, 4, 5) P3 אינטראקציה באמצעות כרומטוגרפיה של אהדה ובלוק מערבי דוגמה זו ממחישה את היישום של שיטה זו כדי לנתח את הכריכה של RAP1 מ t. brucei ליפוסט או על ידי רקומביננטי t. brucei RAP1 חלבון. ליזוטים של T. brucei מחזור הדם צורות לבטא hemagglutinin (HA)-מתויגים RAP1 שימשו בכריכה assays. RA...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

אינוזיטול פוספט ופוספוינוזיטידים הם מטבוליטים שיש להם מספר פונקציות רגולטוריות באוקריוטים, כולל שליטה בביטוי גנים, סחר בחלבון, התמרת אותות ופיתוח תאים. הם מבצעים את התפקוד הרגולטורי הזה על ידי קשירה לחלבונים, ובכך משנים את קונפורמציית החלבון, הפעילות הקטאליטית או אינטראקציות החלבון. זיהוי חלבונים שנקשרים אינוזיטול פוספט או phosphoinositides חיוני כדי להבין כיצד מטבוליטים אלה לבצע את תפקידם הרגולטורי.פרוטוקול זה כולל זרימת עבודה פשוטה, שאינה רדיואקטיבית, נטולת ליפוזום ומשתמשת בריאגנטים הזמינים מסחרית. בשיטה זו, כרומטוגרפיה מוגמרת עם אינוזיטול פוספט ביוטינול או phosphoinositides, משמש כדי לבודד חלבונים אינטראקציה, הם מזוהים לאחר מכן על ידי כתם מערבי, או ספקטרומטריית מסה. לצורות זרם דם, לגדל תאי T.brucei לשלב יומן אמצע במדיה HMI-9, בתוספת 10% FBS, ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני.שמור על צפיפות התאים בין 800, 000 ל-1.6 מיליון תאים למיליליטר. כאשר מוכן, צנטריפוגה התאים ב 1600 פעמים G, ו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו בעדינות את גלולת הכדור ב-10 מיליליטר של PBS-G מחוממים מראש ב-37 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את התאים.צנטריפוגה התאים ב 1600 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להשלים את הכביסה. חזור על הליך כביסה זה פעמיים נוספות. ואז תן שימוש חוזר את גלולה במיליליטר אחד של PBS-G.העבר השעיה זו לנקודה אחת חמש צינור מיליליטר, אז צנטריפוגה ב 1600 פעמים G במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את גלולת האפס בנקודה אפסית חמישה מיליליטר של חיץ תיזה, בתוספת נקודה אחת חמש קוקטייל מעכבי פרוטאז X, וקוקטייל מעכב פוספטאז X אחד שהוקרן מראש על הקרח כדי לתפור את התאים. צנטריפוגה ליאזט ב 1400 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר מכן לאסוף את supernatant, אשר מכיל את חלבוני הטפיל שחולצו, לתוך נקודה אחת חדשה חמש מיליליטר צינור עבור משגיחי מחייב. הניחו בצד 5% מסך ה-lysate לניתוח כתם מערבי. לאסוף 50 microliters של אינוזיטול פוספטים או phosphoinositides גדמו חרוזים אגרוז, ולהוסיף להם 500 מיליליטר של חיץ מחייב.צנטריפוגה ב 1000 פעמים G לדקה אחת. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש ב-50 מיקרוליטרים של חיץ מחייב כדי לצייד את חרוזים. השתמש חרוזים שאינם נדנוד כפקד, ולהשתמש חרוזים עם תצורות פוספט שונות כולל צורות שאינן פוספוריאט, כדי לשלוט עבור אינטראקציות ספציפיות.לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חרוזי IP או PI לתא ליאזט או לחלבונים המטוהרים. שמור את נפח חרוזים בטווח של 10% מסך ה- lysate. במידת הצורך, השתמש במאגר איגוד כדי לכוונן את עוצמת הקול של תגובת האיגוד.הדגירה את התגובה במשך שעה אחת או לילה בארבע מעלות צלזיוס, תוך סיבוב בשעה 50 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת ב 1000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. הסר את supernatant, ולשמור את גלולה, הקפד לשמור על 5% של supernatant לניתוח כתם מערבי.לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ כביסה והקש או ערבב את הצינור כדי להשתמש שוב בסרף. צנטריפוגה התגובה ב 1000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת, ולהשליך את העל טבעי. חזור על תהליך זה עבור סך של חמש שטיפות.לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של חיץ 2X Laemmli בתוספת 710 מילימולר 2-mercaptoethanol כדי חרוזים. הקש או מערבולת כדי לערבב, ולדלל את החלבונים. לאחר מכן, מחממים ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, וצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת.לאסוף את supernatant, או להקפיא את eluate במינוס 80 מעלות צלזיוס, או להמשיך לניתוח כתם המערבי. השיטה המוצגת כאן משמשת לניתוח הכריכה של PIs על ידי חלבון מפעיל מדכא 1 מ T.brucei lysate, או על ידי חלבון רקומביננטי T.brucei מדכא-activator 1 חלבון. כמו RAP1 חסר תחומים מחייב PI קנוני, בדיקות מחייב מבוצעות עם PIs שאינם זרחן, או כי הם זרחן בעמדות שונות של טבעת אינוזיטול, ועם חרוזים עלה שאינם גדומים.ניתוח מערבי מראה כי RAP1 נקשר באופן מועדף על חרוזי PI(3, 4, 5)P3, אך הוא גם נקשר במידה פחותה ל- PI(4, 5)P2 חרוזים. עם זאת, הוא לא נקשר לכל PIs אחרים או גם חרוזים. כדי לבדוק אם RAP1 נקשר ישירות PIs, C מתויג סופני 6XHis חלבון RAP1 רקומביננטי מבוטא ומטוהר הומוגניות מ E.Coli.כתמים מערביים מראים כי הגדלת הריכוז של PI(3, 4, 5)P3, אך לא PI(4, 5)P2, מעכבת את האינטראקציה של RAP1 רקומביננטי עם חרוזים PI(3, 4, 5)P3. התוספת של אנזים PIP5Pase מטוהר T.brucei לתגובה משוחזר PI(3, 4, 5)P3 מחייב על ידי RAP1 רקומביננטי. זאת בשל PIP5Pase dephosphorylation של PI חינם(3, 4, 5)P3, ולכן מציין כי דפוס זרחון של מטבוליט זה חיוני עבור RAP1 שלנו מחייב.חלבוני T.brucei שנקשרים ל- Ins(1, 4, 5)P3 מזוהים לאחר מכן על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ואחריה ספקטרומטריית מסה. ניתוח SDS-PAGE מראה העשרה בחלבונים שחמקו חטוזי Ins(1, 4, 5)P3, בהשוואה לחלבונים שחמקו מקרני הבקרה. ניתוח ספקטרומטריית מסה של החלבונים האלוטים זיהה מעל 250 חלבונים מהם 84 הועשרו ב- Ins(1, 4, 5)P3, בהשוואה לחרוזי בקרה.העשרת חלבונים הקשורים Ins(1, 4, 5)P3, לעומת חמוזי בקרה, בקורלציה עם אות החלבון שזוהה על ידי SDS-PAGE. שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא השימוש בפקדים מתאימים, כדי להפלות ספציפי מאינטראקציות לא ספציפיות. אנו ממליצים להשתמש גם פדרוזים שאינם גדומים, וחרוזים עם אינוזיטול פוספט או פוספוינוזיטידים, תוך שימוש בתצורות פוספט שונות, כולל צורות שאינן פוספוסוריאטים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על טפילי פרוטוזואן חד-תאיים אחרים, כגון טריפאנוסומה קרוזי, לישמניה או פלסמודיום. זה יכול גם להיות מותאם בקלות אורגניזמים אחרים, כולל שמרים או תאים יונקים. שיטה זו יכולה להיות מצמד ספקטרומטריית מסה כמותית, כגון SILAC, כדי לזהות אינטראקציות דינמיות של חלבונים עם אינוזיטול פוספט או phosphoinostides.ב יכול גם להיות משולב עם שבר תת תאי, כדי לזהות חלבונים ספציפיים organelle להיקשר מטבוליטים אלה. גישה זו סייעה לזהות חלבונים שנקשרים אינוזיטול פוספט ופוספוינוזיטידים ב T.brucei, תאים יונקים, ושמרים. היא סייעה בזיהוי תחומי חלבון חדשים שנקשרים לפוספוינוזיטידים.היא סללה את הדרך להבנת הפונקציה הרגולטורית של מטבוליטים אלה, תפקידם בביטוי גנים, התפתחות תאים והתמרת אותות באוקריוטים. חלק מהריגנסים בפרוטוקול זה רעילים, או דליקים. השתמש בציוד מגן אישי, ובמידת הצורך, לעבוד ברדס אדים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...