Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원되었다 (NSERC, RGPIN-2019-04658); 초기 경력 연구원을위한 NSERC 디스커버리 출시 보충 (DGECR-2019-00081) 및 맥길 대학에 의해.

1. 친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅에 의한 IP- 또는 PI 결합 단백질 분석
<ol><li>세포 성장, 포해 및 친화성 크로마토그래피
	<ol><li>T. 브루시 세포를 중간 로그 단계로 성장시키고 세포 생존 가능성과 밀도를 모니터링합니다. 총 5.0 x 107 세포는 하나의 결합 분석에 충분하다.<ol>
<li>혈류 형태를 위해, HMI-9 매체에 있는 세포를 37°C 및 5% CO2에서 10% 태아소 혈...

IP 또는 PIs에 결합하는 단백질의 확인은 이 대사 산물의 세포 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 서양 얼룩 또는 질량 분석법에 결합된 친화성 크로마토그래피는 IP 또는 PI 상호 작용 단백질을 식별하고 따라서 그들의 규제 기능에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. IP 또는 IP는 화학적으로 태그 [예를 들어, Ins (1,4,5)P3는 화학적으로 비오틴에 연결] 스트렙타비딘을 통해 아가로즈 구슬?...

이노시톨 인산염(IP) 및 인산염(PIs)은 유전자 발현 1,2,3,소포 인신매매 등의 세포 과정의 조절을 통해 진핵생물 생물학에 중심적인 역할을 한다. 4, 신호 변환5,6, 신진 대사7,8,9, 개발8,10. 이 대사 산물의 규정 하는 기능은 단백질과 상호 작용 하 고 따라서 단백질 기능을 조절 하는 그들의 능력에서 발생. 단백질에 의해 결합하는 경우에, IP 및 PIs는 단백질 형태11,촉매 활동12,또는 상호 작용13를 바꿀 수 있고 그러므로 세포 기능에 영향을 미칩니다. IP 및 P는 핵 2,3,14,15,벤아증망상 16,17,플라즈마와 같은 다중 세포 내 구획에 분포됩니다. 막1 및 시토졸18,단백질과 관련된3,19 또는 RNAs20.
인지질 C에 의한 막 관련 PI(4,5)P2의 절단은 INS(1,4,5)P3의 방출을 초래하며, 이는 각각 IP 키나아제 및 인산아제에 의해 인산화 또는 탈인될 수 있다. IP는 단백질에 결합하고 규제 기능을 발휘할 수 있는 가용성 분자입니다. 예를 들어, 메타조안에서의 Ins(1,4,5)P3는 IP3 수용체에 결합함으로써 제2 메신저로서 작용할 수 있으며, 이는 수용체 형태 변화를 유도하고 따라서 세포내저장소(11)로부터Ca2+의 방출을 유도한다. Ins(1,3,4,5)P4는 히스톤 데아세틸라제 복합체에 결합하고 단백질 복합체 조립 및 활성을 조절한다13. IP 조절 기능의 다른 예로는 염색질 조직21,RNA 수송22,23,RNA 편집24,및 전사 1,2,3의 제어가 포함됩니다. . 대조적으로, PIs는 종종 혈장 막 또는 세포막(25)에 단백질의 모집과 연관된다. 그러나, PIs의 새로운 특성은 비 membranous 환경에서 단백질과 연관하는 능력3,15,19,26. 이는 핵수용체 스테로이드성 인자, 이는 전사 조절 기능이 PI(3,4,5)P319에의해 조절되고, 효소 활성이 핵 PI(4,5)P226에의해 조절되는 폴리-A 폴리머라제이다. IP 및 PIs에 대한 조절 역할은 효모22,27,포유류 세포19,23, 초파리10 및 웜28을포함하는 많은 유기체에서 나타났다. 중요한 것은 진핵 혈통에서 일찍 발산한 trypanosomes에 있는 이 대사 산물의 역할입니다. 이러한 대사산물은 트리파노소마 브루시 전사 대조군1,3,발달8,세포생체발생 및 단백질 트래픽29,30에서 필수적인 역할을 한다. , 31세 , 도 32,병원체 T. 크루시33,34,35,톡소플라즈마36 및 플라스모듐의 발달 및 감염 조절에도 관여하고 있다. 5개 , 37. 따라서, trypanosomes에 있는 IP 그리고 P의 역할을 이해하는 것은 이 분자를 위한 새로운 생물학 기능을 해명하고 새로운 약 표적을 확인하는 것을 도울 수 있습니다.
단백질 및 IP 또는 PI 결합의 특이성은 이노시톨(13,38)의단백질 상호작용 도메인 및 인산화 상태에 의존하지만, PI의 지질 부분과의 상호작용도19로발생한다. 다양한 IP 및 PIs 및 이들의 변형 키나아제 및 인산염은 대사 산물 가용성 및 풍부, 이노시톨의 인산화 상태 및 단백질에 의해 영향을 받는 단백질 기능을 제어하기 위한 유연한 세포 메커니즘을 제공합니다. 상호 작용의친화성 1,3,13,38. 일부 단백질 도메인은39,40,41,예를 들어, 플렉스트린 상모도메인(42 및SPX)(S YG1/P ho81/X PR1) 도메인43을 잘 특성화하지만 ,44,45, 일부 단백질은 알 수없는 남아있는 메커니즘에 의해 IP 또는 PIs와 상호 작용합니다. 예를 들어, T. brucei의 억압자-활성제 단백질 1(RAP1)은 정식 PI 결합 도메인이 부족하지만 PI(3,4,5)P3 및 항원 변이에 관여하는유전자의 전사 를 제어하기 위해 상호작용한다 3. 친화성 크로마토그래피 및 IP 또는 PI 상호 작용 단백질의 친화성 크로마토그래피 및 질량 분석 분석trypanosome, 효모,또는 포유류 세포로부터 알려진 IP-또는 PI 결합 도메인 없이 여러 단백질을 확인8,46, 47. 데이터는 이러한 대사 산물에 결합하는 추가의 특성화되지 않은 단백질 도메인을 제안합니다. 그러므로, IP 또는 PIs와 상호 작용하는 단백질의 확인은 이 작은 분자를 위한 단백질 대사 산물 상호 작용 그리고 새로운 세포 조절 기능의 새로운 기계장치를 제시할 수 있습니다.
여기에서 기술한 방법은 IP 또는 PIs에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 서쪽 blotting 또는 질량 분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피를 채택합니다. 그것은 아가로즈 구슬에 공액 된 스트렙타비딘에 가교 또는 대안으로, 스트렙 타비딘 - 공액 자기 구슬을 통해 캡처 중하나 생체 생물 IP 또는 PI를 사용합니다 (그림 1). 이 방법은 민감하고 비방사성, 리포솜이 없는 간단한 워크플로우를 제공하며 세포 용해물 또는 정제된 단백질로부터 단백질의 결합을 검출하는데 적합하다(도 2). 이 방법은 복잡한 생물학적 샘플로부터 IP 또는 PI 결합 단백질을 식별하기 위해 아미노산 표지된 정량 질량 분석법47에 라벨이 없는8,46 또는 결합된 것으로 사용될 수 있다. 따라서, 이 방법은 세포 단백질과 IP 또는 PA의 상호 작용을 연구하기 위해 사용할 수있는 몇 가지 방법에 대한 대안이며, trypanosomes 아마도 다른 진핵생물에서 이러한 대사 산물의 조절 기능을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

이노시톨 인산염과 인산화효소는 진핵생물의 여러 세포 과정을 조절하며, 유전자 발현, 소포 인신매매, 신호 전염, 대사 및 발달을 포함합니다. 이 대사 산물은 단백질에 결합하여 이 규정하는 활동을 능력을 발휘합니다, 그로 단백질 형태, 촉매 활동 및/또는 상호 작용을 변경합니다. 여기에서 기술한 방법은 질량 분광법 또는 서쪽 blotting에 결합된 친화성 크로마토그래피를 사용하여 이노시톨 인산염 또는 인산화물과 상호 작용하는 단백질을 확인합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화물은 화학적으로 비오틴으로 태그가 지정되어 있으며, 이 제품은 아가로오스 또는 자기 구슬에 결합된 스트렙타비딘을 통해 포획됩니다. 단백질은 대사 산물에 결합하는 그들의 친화력에 의해 단리되고, 그 후 질량 분석법 또는 서쪽 얼룩에 의해 용출되고 확인됩니다. 이 방법은 민감하고 비방사성, 리포솜이 없고 사용자 정의 할 수있는 간단한 워크플로우를 가지고 있으며 단백질 및 대사 산물 상호 작용의 정밀도 분석을 지원합니다. 이 접근법은 복잡한 생물학적 샘플에서 단백질 대사 산물 상호 작용을 식별하거나 정제 된 단백질을 사용하는 아미노산 라벨이 붙은 정량질량 분석법에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Trypanosoma brucei에서단백질의 분석을 위해 최적화되어 있지만, 관련 원생 동물 기생충, 효모 또는 포유류 세포에 적응될 수 있다.

RAP1 및 PI 분석 (3,4,5)친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅에 의한 P3 상호 작용 이 예는 T. brucei 용해또는 재조합 T. brucei RAP1 단백질에 의해 RAP1에 의한 PI의 결합을 분석하기 위한 이 방법의 적용을 예시한다. Hemagglutinin (HA)태그 RAP1를 발현하는 T. brucei 혈류 량 형태의 Lysates 결합 검정에서 사용 되었다. RAP1은 변이체 표면 당단백질(VSG) 유전자의 전사<sup class="xref"...

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Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

이노시톨 인산염 및 인산조류는 진핵생물에 여러 가지 조절 기능이 있는 대사산물로, 유전자 발현, 단백질 인신매매, 신호 트랜스듀션 및 세포 발달의 조절을 포함한다. 그(것)들은 단백질에 결합하여, 그로 단백질 형성, 촉매 활동, 또는 단백질 상호 작용을 변화시킴으로써 이 규정 기능을 능력을 발휘합니다. 이노 시 톨 인산염 또는 인포이 노 시 티드에 바인딩 하는 단백질의 식별 은 그 대사 산물 그들의 규제 기능을 수행 하는 방법을 이해 하는 데 필수적이다.이 프로토콜은 민감하고 방사능이 없고 리포솜이 없는 간단한 워크플로우를 가지고 있으며 시판되는 시약을 사용합니다. 이 방법에서, 생물요시톨 인산염 또는 인광조류를 가진 완성된 크로마토그래피는 상호 작용하는 단백질을 분리하는 데 사용되며, 그 후 서양 얼룩또는 질량 분석법에 의해 식별된다. 혈류 형태의 경우, HMI-9 미디어에서 T.brucei 세포를 중간 로그 단계로 성장시키고, 10%의 FBS를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 보충합니다.밀리리터당 800, 000 및 160만 개의 세포 사이의 세포 밀도를 유지합니다. 준비가 되면 세포를 1600배 G로 원심분리하고 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고, 부드럽게 세포를 세척하기 위해 섭씨 37도에서 사전 가열 PBS-G의 10 밀리레에서 펠릿을 다시 중단.세포를 1600배 G로, 실온에서 5분간 심혈을 완료합니다. 이 세탁 절차를 두 번 더 반복하십시오. 그런 다음 PBS-G의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.이 서스펜션을 1점 5밀리리터 튜브로 옮긴 다음 원심분리기를 1600회 G로 5분간 전송합니다. 상체를 버리고, 용해 버퍼의 제로 포인트 5 밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고, 1점 5 X 프로테아제 억제제 칵테일과 세포를 용액하기 위해 얼음에 미리 냉각된 X 포스파타제 억제제 칵테일 1개를 보충한다. 1400회 G와 섭씨 4도에서 10분간 리자테를 원심분리합니다.이 후에 추출한 기생충 단백질을 포함하는 상체를 결합된 assays를 위한 새로운 1점 5 밀리리터 튜브로 수집합니다. 서부 얼룩 분석을 위해 총 lysate의 5 %를 따로 둡니다. 아가로즈 비드에 공인이노시톨 인산염 또는 인광증제 50마이크로리터를 수집하고 500밀리리터의 결합 버퍼를 추가합니다.원심분리기는 1분 동안 1000배 G로 원심분리기. 상체를 버리고 50 마이크로리터의 바인딩 버퍼로 다시 일시 중지하여 구슬을 평형화합니다. 비공액 구슬을 컨트롤로 사용하고 비인산 형태를 포함한 다른 인산염 구성을 가진 구슬을 사용하여 특이하지 않은 상호 작용을 제어합니다.다음으로, 세포 용액 또는 정제 된 단백질에 IP 또는 PI 구슬 50 마이크로 리터를 추가합니다. 구슬의 볼륨을 전체 lysate의 10% 이내로 유지합니다. 필요한 경우 바인딩 버퍼를 사용하여 바인딩 반응의 볼륨을 조정합니다.50rpm에서 회전하는 동안 1 시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 반응을 배양하십시오. 그 후, 원심 분리는 1000 시간 G에서, 그리고 1 분 동안 섭씨 4도에서 믹스를 분리합니다. 상체를 제거하고 펠릿을 유지하여 서부 얼룩 분석을 위해 상체의 5 %를 유지하십시오.그런 다음 세척 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 튜브를 탭하거나 소용돌이어 수지를 다시 중단합니다. 원심 분리는 1000 배 G에서 반응을, 그리고 1 분 동안 섭씨 4도에서, 상체를 폐기. 총 5개의 세시에 대해 이 프로세스를 반복합니다.그 후, 구슬에 710 밀리몰러 2-mercaptoethanol으로 보충 된 2X Laemmli 버퍼의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 혼합을 누르거나 소용돌이를 혼합하고 단백질을 희석시다. 다음으로, 5분간 섭씨 95도에서 가열하고 원심분리기는 10, 000회 G에서 1분간 가열합니다.상체를 수집하고, 영하 80도에서 용액을 동결하거나, 서부 얼룩 분석을 진행한다. 여기에 제시된 방법은 T.brucei lysate로부터 억압자 활성제 단백질 1또는 재조합 T.brucei 억압자-활성제 단백질 1 단백질에 의해 오피의 결합을 분석하는 데 사용된다. RAP1에는 정식 PI 결합 도메인이 없기 때문에, 결합 분석법은 비인성, 또는 이노시톨 링의 다른 위치에서 인포로 인포화되는 피전에, 그리고 비공액아가로즈 비드와 함께 수행됩니다.서양 분석에 따르면 RAP1은 PI(3, 4, 5)P3 구슬에 우선적으로 바인딩되지만 PI(4, 5)P2 구슬에 덜 바인딩됩니다. 그러나 다른 피처 나 아가로즈 구슬에 결합하지 않았습니다. RAP1이 피전에 직접 결합하는지 여부를 테스트하기 위해, C 말단 태그 6XHis 재조합 RAP1 단백질은 E.Coli에서 균질성으로 표현되고 정제됩니다.서양 블로팅은 PI(3, 4, 5)P3의 농도를 증가시키지만 PI(4, 5)P2는 PI(3, 4, 5)P3 구슬을 가진 재조합 RAP1의 상호 작용을 억제하는 것을 보여준다. T.브루시 정제 PIP5Pase 효소를 첨가하여 재조합 RAP1에 의한 PI(3, 4, 5)P3 결합을 복원하였다. 이것은 무료 PI (3, 4, 5)P3의 PIP5Pase dephosphorylation 때문이며, 따라서 이 대사 산물의 인광 패턴이 우리의 RAP1 바인딩에 필수적임을 나타냅니다.Ins (1, 4, 5)P3에 결합하는 T.brucei 단백질은 질량 분석다음에 친화성 크로마토그래피에 의해 확인됩니다. SDS-PAGE 분석은 Ins (1, 4, 5)P3 구슬에서 출루된 단백질의 농축을 대조군 아가로즈 구슬에서 용출한 단백질과 비교하여 보여줍니다. 250개 이상의 단백질을 확인한 용출단백질의 질량 분석 분석은 84개의 단백질이 대조구에 비해 Ins(1, 4, 5)P3 구슬로 농축되었다.Ins(1, 4, 5)P3에 결합된 단백질의 농축은 대조구에 비해 SDS-PAGE에서 검출된 단백질 신호와 상관관계가 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 컨트롤을 사용하여 비특정 상호 작용에서 특정한 것을 구별하는 것입니다. 비인산염 형태를 포함한 다양한 인산염 구성을 사용하여 비공액 아가로즈 구슬과 이노시톨 인산염 또는 인광성으로 결합된 구슬을 사용하는 것이 좋습니다.이 방법은 Trypanosoma cruzi, leishmania, 또는 plasmodium과 같은 그밖 단세포 원생동물 기생충에 적용될 수 있습니다. 또한 효모 또는 포유류 세포를 포함한 다른 유기체에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 방법은 SILAC와 같은 정량질량 분석법에 결합하여 이노시톨 인산염 또는 인광조류를 가진 단백질의 동적 상호 작용을 식별할 수 있다.또한 세포 외 분획과 결합될 수 있으며, 이러한 대사 산물에 결합하는 세포세포 특이적 단백질을 식별할 수 있습니다. 이 접근법은 T.brucei, 포유류 세포 및 효모에 있는 이노시톨 인산염 및 인포이노시티드에 결합하는 단백질을 확인하는 것을 도왔습니다. 그것은 인포이노시티드에 결합하는 새로운 단백질 도메인을 확인하는 데 도움이되었습니다.그것은 이 대사 산물의 조절 기능, 유전자 발현에 있는 그들의 역할, 세포 발달 및 진핵생물에 있는 신호 전염을 이해하는 쪽을 포장했습니다. 이 프로토콜의 일부 시약은 독성 또는 인화성입니다. 개인 보호 장비를 사용하고 필요한 경우 연기 후드에서 작업하십시오.

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방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

다각형 광 산란에 결합된 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단백질의 특성 (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...