Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Dette arbeidet ble støttet av Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery lanseringen supplement for tidlig karriere forskere (DGECR-2019-00081) og ved McGill University.

1. analyse av IP-eller PI-bindende proteiner av affinitet kromatografi og vestlig blotting
<ol><li>Cellevekst, lyse og affinitet kromatografi
	<ol><li>Grow T. brucei celler til midten av loggen fase og overvåke celle levedyktighet og tetthet. Totalt 5,0 x 107 celler er tilstrekkelig for en bindende analysen.<ol>
<li>For blodbanen former, vokse celler i HMI-9 Media supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) ved 37 ° c og 5% CO2. Hold celle tetthet mellom 8,0 x 10...

Identifisering av proteiner som binder til IPs eller PIs er avgjørende for å forstå cellulære funksjon av disse metabolitter. Affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller masse massespektrometri gir en mulighet til å identifisere IP eller PI samspill proteiner og dermed få innsikt i sin regulatoriske funksjon. IPs eller PIs kjemisk merket [f. eks ins (1, 4, 5) P3 kjemisk knyttet til biotin] og krysskoblet til agarose perler via streptavidin eller fanget av streptavidin magnetiske perler tillater isolering a...

Inositol fosfater (IPS) og phosphoinositides (PIs) spiller en sentral rolle i eukaryote biologi gjennom regulering av cellulære prosesser som kontroll av genuttrykk1,2,3, vesicle smugling 4, signal Transduction5,6, metabolisme7,8,9og utvikling8,10. Den regulatoriske funksjon av disse metabolitter resultater fra deres evne til å samhandle med proteiner og dermed regulere protein funksjon. Ved binding av proteiner, kan IPs og PIs endre protein konformasjon11, katalysatorer aktivitet12, eller interaksjoner13 og dermed påvirker mobilnettet funksjon. IPS og PIs distribueres i flere subcellulære rom, for eksempel nucleus2,3,14,15, endoplasmatiske retikulum16,17, plasma membran1 og stoffer18, enten forbundet med proteiner3,19 eller med RNAs20.
Kløften av membranen-assosiert PI (4, 5) P2 ved fosfolipase C resulterer i utgivelsen av ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforylert eller dephosphorylated av IP kinaser og phosphatases, henholdsvis. IPs er løselige molekyler som kan bindes til proteiner og utøver regulatoriske funksjoner. For eksempel ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungere som en andre Messenger ved binding til IP3 reseptorer, som induserer reseptor conformational endringer og dermed utgivelsen av ca2 + fra intracellulære butikker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder seg til Histone deacetylase komplekse og regulerer protein kompleks montering og aktivitet13. Andre eksempler på IPS forskriftsmessig funksjon inkluderer kontroll av kromatin organisasjon21, RNA transport22,23, RNA redigering24, og transkripsjon1,2,3 . I kontrast, PIs er ofte forbundet med rekruttering av proteiner til plasma membranen eller organelle membraner25. Men en voksende egenskap av PIs er evnen til å assosiere med proteiner i et ikke-membranous miljø3,15,19,26. Dette er tilfelle av den kjernefysiske reseptor steroidogenic faktor, som transcriptional kontrollfunksjonen er regulert av PI (3, 4, 5) P319, og Poly-A polymerase som enzymatisk aktivitet er regulert av kjernefysiske PI (4, 5) P226. En regulerende rolle for IPS og PIs har blitt vist i mange organismer, inkludert gjær22,27, pattedyrceller19,23, Drosophila10 og Worms28. Av betydning er rollen til disse metabolitter i trypanosomes, som skilt tidlig fra eukaryote avstamning. Disse metabolitter spiller en viktig rolle i Trypanosoma brucei transcriptional kontroll1,3, utvikling8, organelle kognitiv og protein trafikk29,30 , 31 andre , 32, og er også involvert i å kontrollere utvikling og smitte i patogener T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 og Plasmodium 5 andre priser , 37. herav, forståelse rollen av IPS og PIs inne trypanosomes kanskje hjelpe å belyse ny Biological funksjonen for disse molekyler og å identifisere romersk bedøve mål.
Det spesielle ved protein og IP eller PI bindende avhenger protein samspill domener og fosforylering staten Inositol13,38, selv om interaksjoner med lipid delen av PIs oppstår også19. Variasjonen av IPs og PIs og deres modifisere kinaser og phosphatases gir en fleksibel cellulær mekanisme for å kontrollere protein funksjon som er påvirket av metabolitten tilgjengelighet og overflod, den fosforylering tilstanden til Inositol, og protein affinitet av samspill1,3,13,38. Selv om noen protein domener er godt preget39,40,41, f. eks, pleckstrin homologi domene42 og SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domener43 ,44,45, noen proteiner samhandle med IPS eller PIs av mekanismer som forblir ukjent. For eksempel, hemmende-aktivator protein 1 (RAP1) av T. brucei mangler kanoniske PI-bindende domener, men SAMHANDLER med PI (3, 4, 5) P3 og kontroll transkripsjon av gener involvert i antigen variasjon3. Affinitet kromatografi og masse massespektrometri analyse av IP eller PI samhandler proteiner fra trypanosome, gjær eller pattedyrceller identifisert flere proteiner uten kjente IP-eller PI-bindende domener8,46, 47. dataene tyder på flere uncharacterized protein domener som binder til disse metabolitter. Derfor, identifisering av proteiner som samhandler med IP eller PIs kan avdekke romanen mekanismer av protein-metabolitten interaksjon og nye cellulære regulatoriske funksjoner for disse små molekyler.
Metoden beskrevet her sysselsetter affinitet kromatografi koplet til vestlige blotting eller masse massespektrometri å identifisere proteiner som binder til IPs eller PIs. Den bruker biotinylated IP-adresser eller behandlingsinstruksjoner som enten er krysskoblet til streptavidin som bøyes likt til agarose perler eller alternativt, tatt opp via streptavidin magnetiske perler (figur 1). Metoden gir en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktivt, liposome og er egnet for å oppdage bindingen av proteiner fra celle lysater eller renset proteiner3 (figur 2). Metoden kan brukes i etikett-Free8,46 eller koplet til amino acid-merket kvantitative masse massespektrometri47 å identifisere IP eller PI-bindende proteiner fra komplekse biologiske prøver. Derfor er denne metoden et alternativ til de få metodene som er tilgjengelige for å studere samspillet av IPs eller PIs med cellulære proteiner og vil bidra til å forstå regulatoriske funksjon av disse metabolitter i trypanosomes og kanskje andre Landplantenes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

Inositol fosfater og phosphoinositides regulerer flere cellulære prosesser i Landplantenes, inkludert genuttrykk, vesicle smugling, signal Transduction, metabolisme og utvikling. Disse metabolitter utføre denne regulatoriske aktiviteten ved binding til proteiner, og dermed endre protein konformasjon, katalysator og/eller interaksjoner. Metoden beskrevet her bruker affinitet kromatografi koplet til masse massespektrometri eller vestlige blotting å identifisere proteiner som samhandler med Inositol fosfater eller phosphoinositides. Inositol fosfater eller phosphoinositides er kjemisk merket med biotin, som deretter fanges via streptavidin bøyd til agarose eller magnetiske perler. Proteiner er isolert av deres affinitet av binding til metabolitten, deretter eluert og identifisert av masse massespektrometri eller vestlig blotting. Metoden har en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktivt, liposome, og passelig, støtter analyse av protein og metabolitten interaksjon med presisjon. Denne tilnærmingen kan brukes i etikett-fri eller i amino acid-merket kvantitative masse massespektrometri metoder for å identifisere protein-metabolitten interaksjoner i komplekse biologiske prøver eller ved hjelp av renset proteiner. Denne protokollen er optimalisert for analyse av proteiner fra Trypanosoma brucei, men det kan tilpasses til relaterte protozoan parasitter, gjær eller pattedyrceller.

Analyse av RAP1 og PI (3, 4, 5) P3 interaksjon ved affinitet kromatografi og vestlig blotting Dette eksemplet illustrerer anvendelsen av denne metoden for å analysere bindingen av PIs av RAP1 fra T. brucei lysat eller ved rekombinant t. brucei RAP1 protein. Lysater av T. brucei blodbanen former som uttrykker HEMAGGLUTININ (ha)-Tagged RAP1 ble brukt i bindende analyser. RAP1 er et protein som er involvert i transcriptional kontroll av variant overflaten glykoprotein (VSG) ge...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Denne protokollen fokuserer på identifisering av proteiner som binder til Inositol fosfater eller phosphoinositides. Den bruker affinitet kromatografi med biotinylated Inositol fosfater eller phosphoinositides som er immobilisert via streptavidin til agarose eller magnetiske perler. Inositol fosfat eller fosfoinositid bindende proteiner identifiseres av vestlig blotting eller masse massespektrometri.

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Inositol fosfat og fosfositider er metabolitter som har flere regulatoriske funksjoner i eukaryoter, inkludert kontroll av genuttrykk, proteinhandel, signaltransduksjon og celleutvikling. De utfører disse regulatoriske funksjonen ved å binde seg til proteiner, og dermed endre proteinkonformasjon, katalytisk aktivitet eller proteininteraksjoner. Identifisering av proteiner som binder seg til inositolfosfat eller fosfositider er avgjørende for å forstå hvordan disse metabolittene utfører sin regulatoriske funksjon.Denne protokollen har en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktiv, lyposom gratis og bruker reagenser som er kommersielt tilgjengelige. I denne metoden brukes en ferdig kromatografi med biotinylert inositolfosfat eller fosfositider, til å isolere interagerende proteiner, de identifiseres deretter av vestlig flekk eller massespektrometri. For blodstrømformer, vokse T.brucei celler til midten av loggfasen i HMI-9 media, supplert med 10% FBS, ved 37 grader Celsius, med 5% karbondioksid.Hold celletettheten mellom 800, 000 og 1,6 millioner celler per milliliter. Når du er klar, sentrifuger cellene ved 1600 ganger G, og ved romtemperatur i 10 minutter. Kast den overnaturlige, og forsiktig resuspend pellet i 10 milliletres av PBS-G forvarmet ved 37 grader Celsius å vaske cellene.Sentrifuger cellene ved 1600 ganger G og ved romtemperatur i fem minutter for å fullføre vasken. Gjenta denne vaskeprosedyren to ganger til. Deretter gjenbruker pellet i en milliliter PBS-G.Overfør denne suspensjonen til ett punkt fem milliliter rør, deretter sentrifuge på 1600 ganger G i fem minutter. Kast den supernatante, og resuspend pellet i null punkt fem milliliter lysis buffer, supplert med ett punkt fem X protease inhibitor cocktail, og en X fosfatase inhibitor cocktail som har blitt pre-kjølt på is for å lyse cellene. Sentrifuger lysatet ved 1400 ganger G og ved fire grader Celsius i 10 minutter.Etter dette samler det supernatante, som inneholder de ekstraherte parasittproteinene, inn i et nytt ett punkt fem milliliter rør for bindingsanalysene. Sett av 5% av den totale lysate for vestlige blot analyse. Samle 50 mikroliter inositol fosfater eller fosfositider konjugert til agarose perler, og tilsett dem 500 milliliter bindingsbuffer.Sentrifuge ved 1000 ganger G i ett minutt. Kast den overnaturlige, og resuspend i 50 mikroliter med bindingsbuffer for å likevekte perlene. Bruk ikke-konjugerte perler som en kontroll, og bruk perler med forskjellige fosfatkonfigurasjoner, inkludert ikke-fosforyler, for å kontrollere for uspesifik interaksjoner.Deretter legger du til 50 mikroliter IP- eller PI-perler til cellelylat eller de rensede proteinene. Hold volumet av perler innen 10% av den totale lysate. Bruk eventuelt bindingsbufferen til å justere volumet på bindingsreaksjonen.Inkuber reaksjonen i enten en time eller over natten ved fire grader Celsius, mens du roterer ved 50rpm. Etter dette sentrifuger blandingen ved 1000 ganger G, og ved fire grader Celsius i ett minutt. Fjern supernatant, og hold pellet, sørg for å holde 5% av supernatant for vestlig flekk analyse.Tilsett deretter en milliliter vaskebuffer og trykk eller virvle røret for å gjenbruke harpiksen. Sentrifuger reaksjonen ved 1000 ganger G, og ved fire grader Celsius i ett minutt, og kast det overnaturlige. Gjenta denne prosessen for totalt fem vasker.Etter dette, tilsett 50 mikroliter 2X Laemmli buffer supplert med 710 millimolar 2-mercaptoetanol til perlene. Trykk eller vortex for å blande, og fortynne proteinene. Deretter varme på 95 grader Celsius i fem minutter, og sentrifuge på 10,000 ganger G i ett minutt.Samle supernatant, og enten fryse eluate på minus 80 grader Celsius, eller gå videre til vestlige blot analyse. Metoden som presenteres her brukes til å analysere bindingen av PIer ved repressoraktivatorprotein 1 fra T.brucei lysate, eller ved rekombinant T.brucei repressor-aktivatorprotein 1 protein 1 protein. Siden RAP1 mangler kanoniske PI-bindingsdomener, utføres bindingsanalysene med PIer som ikke er fosforyler, eller som er fosforylert i forskjellige posisjoner av inositolringen, og med ikke-konjugerte agaroseperler.Vestlig analyse viser at RAP1 binder seg fortrinnsvis til PI (3, 4, 5) P3 perler, men at det også binder seg i mindre grad til PI (4, 5) P2 perler. Det binder seg imidlertid ikke til noen andre PIer eller agarose perler. For å teste om RAP1 binder seg direkte til PIer, er et C-terminalt merket 6XHis rekombinant RAP1-protein uttrykt og renset til homogenitet fra E.Coli.Vestlig blotting viser at å øke konsentrasjonen av PI(3, 4, 5)P3, men ikke PI(4, 5)P2, hemmer samspillet mellom rekombinant RAP1 med PI(3, 4, 5)P3 perler. Tilsetning av T.brucei renset PIP5Pase enzymet til reaksjonen gjenopprettet PI (3, 4, 5) P3 binding ved rekombinant RAP1. Dette skyldes PIP5Pase defosforylering av gratis PI (3, 4, 5) P3, og indikerer dermed at fosforyleringsmønsteret til denne metabolitten er avgjørende for vår RAP1-binding.T.brucei proteiner som binder seg til Ins (1, 4, 5) P3 blir deretter identifisert av affinitetkromatografi etterfulgt av massespektrometri. SDS-PAGE analyse viser berikelse i proteiner som er eluted fra Ins (1, 4, 5) P3 perler, sammenlignet med proteiner som er eluted fra kontrollen agarose perler. Massespektrometrianalyse av de eluterte proteinene identifisert over 250 proteiner hvorav 84 ble beriket med Ins (1, 4, 5) P3 perler, sammenlignet med kontrollperler.Berikelsen av proteiner bundet til Ins (1, 4, 5)P3, sammenlignet med kontrollperler, korrelerer med proteinsignalet som oppdages av SDS-PAGE. Et kritisk trinn i denne protokollen er bruk av passende kontroller, for å diskriminere spesifikke fra ikke-spesifikke interaksjoner. Vi anbefaler at du bruker ikke-konjugerte agaroseperler, og perler konjugert med inositolfosfat eller fosfositider, ved hjelp av ulike fosfatkonfigurasjoner, inkludert ikke-fosforylerte former.Denne metoden kan brukes på andre encellede protozoparasitter, som Trypanosoma cruzi, leishmania eller plasmodium. Det kan også lett tilpasses andre organismer, inkludert gjær eller pattedyrceller. Denne metoden kan koples til kvantitativ massespektrometri, som SILAC, for å identifisere dynamiske interaksjoner av proteiner med inositolfosfat eller fosfoinostider.I kan også kombineres med subcellulær fraksjonering, for å identifisere organelle spesifikke proteiner som binder seg til disse metabolittene. Denne tilnærmingen har bidratt til å identifisere proteiner som binder seg til inositolfosfat og fosfositider i T.brucei, pattedyrceller og gjær. Det har bidratt til å identifisere nye proteindomener som binder seg til fosfositider.Det har banet vei for å forstå regulatorisk funksjon av disse metabolittene, deres rolle i genuttrykk, celleutvikling og signaltransduksjon i eukaryoter. Noen av reagensene i denne protokollen er giftige eller brannfarlige. Bruk personlig verneutstyr, og om nødvendig, arbeid i en røykhette.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner etter størrelses-ekskludering kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...