Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá (NSERC, RGPIN-2019-04658); Suplemento de lançamento de descoberta NSERC para pesquisadores de carreira precoce (DGECR-2019-00081) e pela Universidade McGill.

1. análise de proteínas de ligação IP ou PI por cromatografia de afinidade e western blotting
<ol><li>Crescimento celular, Lise e cromatografia de afinidade
	<ol><li>Cresça as células T. brucei para a fase do mid-log e monitore a viabilidade e a densidade das células. Um total de 5,0 x 107 células é suficiente para um ensaio de ligação.<ol>
<li>Para as formas de corrente sanguínea, cultivar células em meios HMI-9 suplementados com soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° c...

A identificação de proteínas que se ligam a IPs ou PIs é fundamental para compreender a função celular desses metabólitos. A cromatografia de afinidade acoplada ao borrão ocidental ou à espectrometria maciça oferece uma oportunidade de identificar IP ou PI que interagem proteínas e daqui obtêm introspecções em sua função regulamentar. IPs ou PIs quimicamente marcados [por exemplo, ins (1, 4, 5) P3 quimicamente ligados à biotina] e reticulados a grânulos de agarose via estreptavidina ou capturados por gr...

Fosfatos de inositol (IPS) e fosfoinositídeos (PIS) desempenham um papel central na biologia eucariote através da regulação de processos celulares como o controle da expressão gênica1,2,3, tráfico de vesículas 4, transdução de sinal5,6, metabolismo7,8,9e desenvolvimento8,10. A função reguladora destes metabolitos resulta da sua capacidade de interagir com proteínas e, assim, regular a função proteica. Após a ligação por proteínas, IPs e PIs podem alterar a conformação de proteínas11, atividade catalítica12, ou interações13 e, portanto, afetam a função celular. IPS e PIS são distribuídos em múltiplos compartimentos subcelulares, como o núcleo2,3,14,15, retículo endoplasmático16,17, plasma membrana1 e citosol18, ambas associadas com proteínas3,19 ou com RNAs20.
A clivagem do PI associado à membrana (4, 5) P2 pela fosfolipase C resulta na liberação de ins (1, 4, 5) P3, que podem ser fosforilados ou deposforilados por IP quinases e fosfatases, respectivamente. IPs são moléculas solúveis que podem se vincular a proteínas e exercer funções regulatórias. Por exemplo, ins (1, 4, 5) P3 no metazoano podem atuar como um segundo mensageiro ligando-se aos receptores IP3, o que induz alterações conformacionais do receptor e, assim, liberação de CA2 + de lojas intracelulares11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 liga-se ao complexo histona deacetilase e regula o conjunto complexo proteico e a atividade13. Outros exemplos de função regulatória de IPS incluem o controle da organização decromatina21, transporte de RNA22,23, edição de RNA24e transcrição1,2,3 . Em contrapartida, os pis estão frequentemente associados ao recrutamento de proteínas para a membrana plasmática ou membranas Organela25. No entanto, uma propriedade emergente do PIS é a capacidade de associar-se a proteínas em um ambiente não membranoso3,15,19,26. Este é o caso do fator esteroidogênicas do receptor nuclear, que a função de controle transcricional é regulada pelo PI (3, 4, 5) P319, e pela polimerase poli-A que a atividade enzimática é regulada pelo PI nuclear (4, 5) P226. Um papel regulatório para IPS e PIS foi demonstrado em muitos organismos, incluindolevedura 22,27, células demamíferos 19,23, Drosophila10 e worms28. De significância é o papel desses metabólitos em tripanossomas, que divergiram precocemente da linhagem eucariótica. Estes metabolitos desempenham um papel essencial no controlo transcripcional de Trypanosoma brucei 1,3, desenvolvimento8, biogênese organela e tráfego proteico29,30 , 31 de dezembro , 32, e também estão envolvidos no controle do desenvolvimento e infecção nos patógenos T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 e Plasmodium 5. º , 37. portanto, compreender o papel dos IPS e PIS em tripanossomas pode ajudar a elucidar a nova função biológica para essas moléculas e identificar novos alvos de drogas.
A especificidade da ligação proteína e IP ou PI depende dos domínios de interação protéica e do estado de fosforilação do inositol13,38, embora as interações com a parte lipídica do PIS também ocorra19. A variedade de IPs e PIs e suas cinases modificadoras e fosfatases fornece um mecanismo celular flexível para controlar a função protéica que é influenciada pela disponibilidade e abundância do metabolito, o estado de fosforilação do inositol e proteínas afinidade da interação1,3,13,38. Embora alguns domínios proteicos sejam bem caracterizados39,40,41, por exemplo, domínio de homologia de homologia42 e SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domínios43 ,44,45, algumas proteínas interagem com IPS ou PIS por mecanismos que permanecem desconhecidos. Por exemplo, a proteína 1 (RAP1) do repressor-ativador de T. brucei carece de domínios de vinculação de PI canônicos, mas interage com pi (3, 4, 5) P3 e controle de transcrição de genes envolvidos na variação antigênica3. A cromatografia de afinidade e a análise de espectrometria de massas de proteínas IP ou PI que interagem de trypanosome, levedura ou células de mamíferos identificaram várias proteínas sem domínios de ligação IP ou PI conhecidos8,46, 47. os dados sugerem domínios proteicos não caracterizados adicionais que se ligam a estes metabolitos. Assim, a identificação de proteínas que interagem com IPs ou PIs pode revelar novos mecanismos de interação proteína-metabólito e novas funções reguladoras celulares para essas pequenas moléculas.
O método descrito aqui emprega a cromatografia de afinidade acoplada à mancha ocidental ou à espectrometria maciça para identificar as proteínas que ligam ao IPs ou ao PIs. Utiliza IPs biotinilados ou PIs que estão ligados a streptavidina conjugados a grânulos de agarose ou, alternativamente, capturados através de grânulos magnéticos conjugados com streptavidina (Figura 1). O método fornece um fluxo de trabalho simples que é sensível, não radioativo, Liposome-livre e é adequado para detectar a ligação de proteínas de lisados celulares ou proteínas purificadas3 (Figura 2). O método pode ser usado em Label-Free8,46 ou acoplado a espectrometria de massas quantitativa com rótulo de aminoácido47 para identificar proteínas de ligação IP ou PI de amostras biológicas complexas. Assim, este método é uma alternativa aos poucos métodos disponíveis para estudar a interação de IPs ou PIs com proteínas celulares e ajudará na compreensão da função regulatória desses metabólitos em tripanossomas e talvez outros eucariontes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

Fosfatos de inositol e fosfoinositídeos regulam vários processos celulares em eucariontes, incluindo expressão gênica, tráfico de vesículas, transdução de sinal, metabolismo e desenvolvimento. Estes metabolitos realizam esta atividade regulamentar ligando-se a proteínas, alterando assim a conformação proteica, a atividade catalítica e/ou as interações. O método descrito aqui utiliza cromatografia de afinidade acoplada à espectrometria de massas ou western blotting para identificar proteínas que interagem com fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos são quimicamente marcados com biotina, que é então capturado via estreptavidina conjugados para agarose ou grânulos magnéticos. As proteínas são isoladas por sua afinidade de ligação ao metabolito, então eluída e identificada por espectrometria de massas ou western blotting. O método tem um fluxo de trabalho simples que é sensível, não-radioativo, Liposome-livre, e customizável, suportando a análise da interação da proteína e do metabolito com precisão. Esta abordagem pode ser usada em métodos de espectrometria de massas quantitativas rotuladas com rótulo livre ou em aminoácidos para identificar interações proteína-metabólito em amostras biológicas complexas ou usando proteínas purificadas. Este protocolo é otimizado para a análise de proteínas do Trypanosoma brucei, mas pode ser adaptado a parasitas relacionados com protozoários, leveduras ou células de mamíferos.

Análise da interação RAP1 e PI (3, 4, 5) P3 por cromatografia de afinidade e western blotting Este exemplo ilustra a aplicação deste método para analisar a ligação de PIS por RAP1 de t. brucei lisado ou por t. brucei recombinante proteína RAP1. Lisados de T. brucei formas de corrente sanguínea que expressam hemaglutinina (ha)-Tagged RAP1 foram utilizados em ensaios de ligação. RAP1 é uma proteína envolvida no controle transcricional de genes de glicoproteína d...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Fosfato inositol e fosfoinositos são metabólitos que têm várias funções regulatórias em eucariotes, incluindo o controle da expressão genética, tráfico de proteínas, transdução de sinais e desenvolvimento celular. Eles executam essas funções regulatórias ligando-se às proteínas, alterando assim a conformação proteica, atividade catalítica ou interações proteicas. A identificação de proteínas que se ligam ao fosfato inositol ou fosfoinositos é essencial para entender como esses metabólitos desempenham sua função regulatória.Este protocolo tem um fluxo de trabalho simples que é sensível, não radioativo, livre de lyposome e usa reagentes que estão disponíveis comercialmente. Neste método, uma cromatografia finalizada com fosfato inositol biotinilado ou fosfoinositos, é usada para isolar proteínas interativas, elas são então identificadas por mancha ocidental, ou espectrometria de massa. Para formas de corrente sanguínea, cresça células T.brucei até a fase de registro médio em mídia HMI-9, complementada com 10% FBS, a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono.Mantenha a densidade celular entre 800.000 e 1,6 milhões de células por mililitro. Quando estiver pronto, centrifufique as células a 1600 vezes G, e à temperatura ambiente por 10 minutos. Descarte o supernasciente e resuspenja suavemente a pelota em 10 mililitros de PBS-G pré-aquecido a 37 graus Celsius para lavar as células.Centrifugar as células a 1600 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos para completar a lavagem. Repita este procedimento de lavagem mais duas vezes. Em seguida, resuspend a pelota em um mililitro de PBS-G.Transfira esta suspensão para um tubo de um ponto cinco mililitros, depois centrífuga a 1600 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernasciente, e resuspenque a pelota em zero ponto cinco mililitros de tampão de lise, complementados com um coquetel inibidor de protease de cinco pontos X, e um coquetel inibidor de fosfatase X que foi pré-refrigerado no gelo para lise as células. Centrifugar o lysate a 1400 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos.Depois disso, colete o supernascido, que contém as proteínas parasitas extraídas, em um novo tubo de um ponto cinco mililitro para os ensaios de ligação. Reserve 5% do total de lise para análise de manchas ocidentais. Colete 50 microlitadores de fosfatos inositol ou fosfoinositos conjugados a contas de agarose, e adicione-os 500 mililitros de tampão de ligação.Centrifugar a 1000 vezes G por um minuto. Descarte o supernasciente e resuspenque em 50 microliters de tampão de ligação para equilibrar as contas. Use contas não conjugadas como controle e use contas com diferentes configurações de fosfato, incluindo formas não fosfoiladas, para controlar interações inespecíficas.Em seguida, adicione 50 microliters de contas IP ou PI ao liseto celular ou às proteínas purificadas. Mantenha o volume de contas dentro de 10% do total de lysate. Se necessário, use o tampão de ligação para ajustar o volume da reação de ligação.Incubar a reação por uma hora ou durante a noite a quatro graus Celsius, enquanto gira a 50rpm. Depois disso, centrifugar a mistura a 1000 vezes G, e a quatro graus Celsius por um minuto. Remova o supernasciente e mantenha a pelota, certificando-se de manter 5% do supernaente para análise de manchas ocidentais.Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem e toque ou gire o tubo para resuspensar a resina. Centrifugar a reação a 1000 vezes G, e a quatro graus Celsius por um minuto, e descartar o supernatante. Repita este processo para um total de cinco lavagens.Depois disso, adicione 50 microliters de tampão 2X Laemmli suplementados com 710 milimonas de 2 mercaptoetanol às contas. Toque ou vórtice para misturar e dilua as proteínas. Em seguida, aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos, e centrífuga a 10.000 vezes G por um minuto.Colete o supernante, e congele o elunato a menos 80 graus Celsius, ou prossiga para a análise da mancha ocidental. O método aqui apresentado é usado para analisar a vinculação de PIs pela proteína repressora-ativadora 1 de T.brucei lysate, ou pela proteína repressora recombinante T.brucei 1 protein 1. Como o RAP1 carece de domínios canônicos de ligação pi, os ensaios de vinculação são realizados com PIs que não são fosforiladas, ou que são fosforiladas em diferentes posições do anel inositol, e com contas agarose não conjugadas.A análise ocidental mostra que o RAP1 se liga preferencialmente às contas PI(3, 4, 5)P3, mas que também se liga em menor grau às contas PI(4, 5)P2. No entanto, não se vinculou a nenhum outro PIs ou contas de ágarose. Para testar se o RAP1 se liga diretamente aos IEs, uma proteína RAP1 recombinante 6XHis marcada terminalmente é expressa e purificada à homogeneidade da E.Coli.A mancha ocidental mostra que o aumento da concentração de PI(3, 4, 5)P3, mas não PI(4, 5)P2, inibe a interação do RAP1 recombinante com pi(3, 4, 5)P3 contas. A adição de T.brucei purificada enzima PIP5Pase à reação restaurou pi(3, 4, 5)P3 vinculação por RAP1 recombinante. Isso se deve à desfosforilação PIP5Pase de PI livre(3, 4, 5)P3, e assim indica que o padrão de fosforilação deste metabólito é essencial para a nossa ligação RAP1.As proteínas T.brucei que se ligam ao Ins(1, 4, 5)P3 são então identificadas pela cromatografia de afinidade seguida de espectrometria de massa. A análise SDS-PAGE mostra enriquecimento em proteínas elucidadas a partir de contas ins(1, 4, 5)P3, em comparação com proteínas elucidadas a partir das contas de controle agarose. A análise da espectrometria em massa das proteínas elucidas identificou mais de 250 proteínas das quais 84 foram enriquecidas com contas ins(1, 4, 5)P3, em comparação com contas de controle.O enriquecimento de proteínas vinculadas ao Ins(1, 4, 5)P3, em comparação com as contas de controle, correlaciona-se com o sinal de proteína detectado pelo SDS-PAGE. Um passo crítico neste protocolo é o uso de controles apropriados, para discriminar especificamente a partir de interações não específicas. Recomendamos o uso de contas de agarose não conjugadas, e contas conjugadas com fosfato inositol ou fosfoinositos, utilizando várias configurações de fosfato, incluindo formas não fosfoiladas.Este método pode ser aplicado a outros parasitas protozoários unicelulares, como Trypanosoma cruzi, leishmania ou plasmodium. Também pode ser facilmente adaptado a outros organismos, incluindo leveduras ou células de mamíferos. Este método pode ser acoplado à espectrometria de massa quantitativa, como o SILAC, para identificar interações dinâmicas de proteínas com fosfato inositol ou fosforinostides.Também pode ser combinado com fracionamento subcelular, para identificar proteínas organelas específicas que se ligam a esses metabólitos. Essa abordagem ajudou a identificar proteínas que se ligam ao fosfato inositol e fosfoinositos em T.brucei, células mamíferas e leveduras. Ajudou a identificar novos domínios proteicos que se ligam a fosforinositídeos.Ele abriu o caminho para entender a função regulatória desses metabólitos, seu papel na expressão genética, desenvolvimento celular e transdução de sinais em eucariotes. Alguns dos reagentes neste protocolo são tóxicos, ou inflamáveis. Use equipamentos de proteção individual e, quando necessário, trabalhe em um capô de fumaça.

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