Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch Supplement для исследователей ранней карьеры (DGECR-2019-00081) и Университета Макгилла.

1. Анализ IP- или PI-связывающих белков по хроматографии сродства и западной промойки
<ol><li>Рост клеток, лиза и хроматография сродства
	<ol><li>Выращивайте клетки T. brucei до середины бревенчатого этапа и контролируйте жизнеспособность и плотность клеток. В общей сложности 5,0 х 10...

Идентификация белков, которые связываются с ИС или ИП имеет решающее значение для понимания клеточной функции этих метаболитов. Хроматография сродства в сочетании с западной помоткой или масс-спектрометрией дает возможность определить взаимодействующие белки ИС или ИП и, следовател?...

Инозитол фосфатов (IPs) и фосфоинозитидов (PIs) играют центральную роль в биологии эукариот через регулирование клеточных процессов, таких как контроль экспрессии генов1,2,3, везикул торговли 4,трансдукция сигнала 5,6,метаболизм7,8,9,и развитие8,10. Регулирующая функция этих метаболитов является результатом их способности взаимодействовать с белками и, таким образом, регулировать функцию белка. При связывании белками, ИС и ИП могут изменять конформацию белка11,каталитической активности12,или взаимодействия13 и, следовательно, влияют на клеточную функцию. ИП и ИП распределены в нескольких субклеточныхотсеках, таких как ядро 2,3,14,15,эндоплазмический ретикулум16,17,плазма мембрана1 и цитозол18, либо связанные с белками3,19 или с РНК20.
Расщепление мембраны, связанных PI (4,5)P2 фосфолипасы C приводит к освобождению Ins (1,4,5)P3, которые могут быть фосфорилированы или дефосфорилированы IP киназы и фосфатазы, соответственно. ИП являются растворимыми молекулами, которые могут связываться с белками и осуществлять регулятивные функции. Например, Ins (1,4,5)P3 в метазоане может выступать в качестве второго посланника, связывая с рецепторами IP3, что вызывает конформанформальные изменения рецепторов и, таким образом, высвобождение Ca2 "из внутриклеточных магазинов11. Ins (1,3,4,5)P4 связывается с комплексом деацетилазы гистона и регулирует сборку белкового комплекса и деятельность13. Другие примеры IPs регулирующая функция включают контроль хроматина организации21, РНК транспорт22,23, РНК редактирования24, и транскрипции1,2,3 . В отличие от этого, ИП часто связаны с набором белков в плазменную мембрану или органеллы мембраны25. Тем не менее, возникающим свойством ИП является способность ассоциироваться с белками в не-мембранной среде3,15,19,26. Это случай ядерного рецептора стероидогенный фактор, который транскрипционной функции управления регулируется PI (3,4,5)P319, и поли-Полимеразы, которая ферментативная деятельность регулируется ядерной PI (4,5)P226. Регулирующая роль для ИС и ИП была показана во многих организмах, включая дрожжи22,27, клетки млекопитающих19,23, Drosophila10 и червей28. Значение имеет роль этих метаболитов в трипаносомы, которые рано расходились от эукариотической линии. Эти метаболиты играют важную роль в Trypanosoma brucei транскрипционного контроля1,3, развитие8, органеллы биогенеза и протеинового движения29,30 , 31 год , 32, а также участвуют в контроле развития и инфекции в патогенных микроорганизмов T. cruzi33,34,35,Токсоплазма36 и Плазмодиум 5 , 37. Таким образом, понимание роли ИС и ИП в трипаносомы может помочь выяснить новую биологическую функцию для этих молекул и определить новые цели наркотиков.
Специфика связывания белка и IP или PI зависит от взаимодействующих доменов белка и состояния фосфорилирования инозитол13,38, хотя взаимодействие с липидной частью ИП также происходит19. Разнообразие ИП и ИП и их изменение киназы и фосфатазы обеспечивает гибкий клеточный механизм для контроля функции белка, который зависит от наличия метаболита и изобилия, состояние фосфорилирования инозитол, и белок сродство взаимодействия1,3,13,38. Хотя некоторые белковые домены хорошо характеризуются39,40,41, например, плекстрин гомологический домен42 и SPX (SYG1/Pho81/XPR1) домены43 ,44,45, некоторые белки взаимодействуют с ИП или ИП механизмами, которые остаются неизвестными. Например, протеин репрессор-активатор 1 (RAP1) T. brucei не имеет канонических PI-связывающих доменов, но взаимодействует с PI (3,4,5)P3 и контролирует транскрипцию генов, участвующих в антигенной вариации3. Хроматография сродства и масс-спектрометрия анализ IP или PI взаимодействующих белков из трипаносомы, дрожжей или млекопитающих клеток определили несколько белков без известных IP- или PI-связывающих доменов8,46, 47. Данные свидетельствуют о дополнительных нехарактерных белковых доменах, которые связываются с этими метаболитами. Таким образом, выявление белков, которые взаимодействуют с ИС или ИП может выявить новые механизмы взаимодействия белково-метаболита и новые клеточные регуляторные функции для этих малых молекул.
Метод, описанный здесь, использует хроматографию сродства в сочетании с западной блоттингом или масс-спектрометрией для выявления белков, которые связываются с ИП или ИП. Он использует биоинтинилатированных ИП или ИП, которые либо кросс-связанные стрептавидин спряжение с агарозными бусинами или же, захваченных через стрептавидин-конъюгированные магнитные бусы (Рисунок 1). Метод обеспечивает простой рабочий процесс, который является чувствительным, нерадиоактивным, липосомы бесплатно и подходит для обнаружения связывания белков из клеточных лисатов или очищенных белков3 (Рисунок 2). Метод может быть использован вбез этикетке 8,46 или в сочетании с аминокислотой маркировки количественной масс-спектрометрии47 для выявления ИС или PI-связывающих белков из сложных биологических образцов. Таким образом, этот метод является альтернативой несколько методов, доступных для изучения взаимодействия ИС или ИП с клеточными белками и поможет в понимании регулирующую функцию этих метаболитов в трипаносомы и, возможно, другие эукариоты.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

Фосфаты инозитол и фосфоинозиты регулируют несколько клеточных процессов в эукариотах, включая экспрессию генов, торговлю везикулами, трансдукцию сигналов, обмен веществ и развитие. Эти метаболиты выполняют эту регулятивную деятельность путем связывания с белками, тем самым изменяя конформацию белка, каталитическую активность и/или взаимодействия. Метод, описанный здесь, использует сродство хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии или западной blotting для выявления белков, которые взаимодействуют с фосфатами инозитол или фосфоинозитидов. Инозитол фосфатов или фосфоинозитидов химически помечены биотин, который затем захватили с помощью стрептавидина сопряжены с агарозили и магнитных бусин. Белки изолированы их сродством связывания с метаболитом, затем eluted и определены масс-спектрометрии или западной blotting. Метод имеет простой рабочий процесс, который является чувствительным, нерадиоактивным, липосомы свободной, и настраиваемый, поддерживая анализ белка и метаболита взаимодействия с точностью. Этот подход может быть использован в без этике или в методах количественной спектрометрии, маркированных аминокислотами, для выявления белково-метаболитных взаимодействий в сложных биологических образцах или с использованием очищенных белков. Этот протокол оптимизирован для анализа белков из trypanosoma brucei,но он может быть адаптирован к родственным простейшие паразиты, дрожжи или млекопитающих клеток.

Анализ RAP1 и PI (3,4,5)P3 взаимодействия сродства хроматографии и западной blotting Этот пример иллюстрирует применение этого метода для анализа связывания ИП RAP1 от T. brucei lysate или рекомбинантным белком T. brucei RAP1. В связывающих анализах использовались личицы форм крови T. brucei, ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Этот протокол фокусируется на выявлении белков, которые связываются с фосфатами инозитол или фосфоинозитами. Он использует сродство хроматографии с биоинтинилатами инозитол фосфатов или фосфоинозитидов, которые обездвижены через стрептавидин агароз или магнитные бусы. Инозитол фосфат или фосфоинозид связывающие белки идентифицируются западной blotting или масс-спектрометрии.

Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Инозитол фосфат и фосфаты являются метаболитами, которые имеют несколько регулятивных функций в эукариот, в том числе контроль экспрессии генов, торговли белками, трансдукции сигналов и развития клеток. Они выполняют эти регулятивные функции, связываясь с белками, тем самым изменяя конформацию белка, каталитической активности или белковых взаимодействий. Выявление белков, которые связываются с инозитол фосфат или фосфаты имеет важное значение для понимания того, как эти метаболиты выполняют свою регулятивную функцию.Этот протокол имеет простой рабочий процесс, который чувствителен, нерадиоактивен, липосом бесплатно и использует реагенты, которые являются коммерчески доступными. В этом методе, законченная хроматография с биотинилированным инозитол фосфатом или фосфатамитидами, использована для того чтобы изолировать взаимодействуя протеины, они после этого определены западным пятном, или спектрометрией массы. Для форм кровотока, расти T.brucei клеток до середины фазы журнала в HMI-9 средств массовой информации, дополняется 10%FBS, при 37 градусов по Цельсию, с 5%Carbon Dioxide.Держите плотность клеток между 800 000 и 1,6 миллиона клеток на миллилитр. Когда он будет готов, центрифуга клетки в 1600 раз G, и при комнатной температуре в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и аккуратно повторно помеская гранулы в 10 миллилетах PBS-G предварительно нагретых при 37 градусах по Цельсию для мытья клеток.Центрифуга клетки в 1600 раз G и при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы завершить стирку. Повторите эту процедуру стирки в два раза больше. Затем повторное распределение гранул в один миллилитр PBS-G.Перенесите эту подвеску в одну точку пятимилитровую трубку, затем центрифугу при 1600 раз G в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и повторно посовестите гранулы в нулевой точке пять миллилитров буфера лиза, дополненные одной точкой пять X ингибитор ингибитора X, и один X ингибитор фосфатазы коктейль, который был предварительно охлажден на льду, чтобы подлизить клетки. Центрифуга лисировать при 1400 раз G и при четырех градусах По Цельсию в течение 10 минут.После этого соберите супернатант, который содержит извлеченные протеины паразита, в новую одну точку 5 миллилитровую пробку для связывающих анализов. Отложите 5% от общего количества лисата для анализа западных помарк. Соберите 50 микролитров инозитол фосфатов или фосфатов, конъюгированных в агарозные бусины, и добавьте в них 500 миллилитров связывающего буфера.Центрифуга при 1000 Г в течение одной минуты. Откажитесь от супернатанта и хвойте в 50 микролитров связывающего буфера, чтобы уравночные бусы. Используйте несопрягие бусы в качестве контроля, и использовать бисер с различными конфигурациями фосфатов, включая не фосфорилированные формы, для контроля для неспецифических взаимодействий.Затем добавьте 50 микролитров IP или PI шариков в лизат клетки или очищенные белки. Держите объем бисера в пределах 10% от общего количества лисата. При необходимости используйте связывающий буфер для регулировки объема реакции связывания.Инкубировать реакцию в течение одного часа или на ночь при четырех градусах по Цельсию, в то время как вращающиеся на 50rpm. После этого центрифугу смешивают при 1000 Г, а при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты. Удалите супернатант, и держать гранулы, убедившись, что держать 5% от supernatant для западного анализа помарки.Затем добавьте один миллилитр стирального буфера и нажмите или закружить трубку, чтобы повторно использовать смолу. Центрифуга реакции в 1000 раз G, и при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты, и отказаться от супернатанта. Повторите этот процесс в общей сложности пять моет.После этого добавьте в бисер 50 микролитров буфера 2X Laemmli, дополненных 710 миллимолярной 2-меркаптоэтанол. Нажмите или вихрь, чтобы смешать, и разбавить белки. Далее, тепло при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, и центрифуга на 10000 раз G в течение одной минуты.Соберите супернатант и либо заморозьте элуат при температуре минус 80 градусов по Цельсию, либо приступайте к анализу западной помарки. Представленный здесь метод используется для анализа связывания ИП репрессорно-активаторным белком 1 из лизата T.brucei или рекомбинантным белком T.brucei-репрессором-активатором 1 белка. Поскольку RAP1 не имеет канонических доменов связывания PI, связывающие анализы выполняются с ИП, которые не фосфорилированы, или которые фосфорилированы в разных положениях кольца инозитол, и с несопряганными бусинами агарозы.Западный анализ показывает, что RAP1 преимущественно связывается с бисером PI(3, 4, 5)P3, но также в меньшей степени связывается с бисером PI (4, 5)P2. Тем не менее, он не привязывается к любым другим ИП или агарозы бисера. Чтобы проверить, связывается ли RAP1 непосредственно с ИП, C терминально помеченный рекомбинантный белок RAP1 6XHis выражается и очищается от однородности от E.Coli.Западные blotting показывает, что увеличение концентрации PI (3, 4, 5)P3, но не PI (4, 5)P2, препятствует взаимодействию рекомбинантных RAP1 с PI(3, 4, 5)P3 шариков. Добавление T.brucei очищенного фермента PIP5Pase к реакции восстановлено PI(3, 4, 5)P3 связывания рекомбинантным RAP1. Это связано с PIP5Pase дефосфорилирования свободного PI(3, 4, 5)P3, и, таким образом, указывает на то, что фосфорилирование шаблон этого метаболита имеет важное значение для нашего RAP1 связывания.Белки T.brucei, которые связываются с Ins(1, 4, 5)P3, затем идентифицируются по хроматографии сродства с последующим масс-спектрометрией. Анализ SDS-PAGE показывает обогащение белков, выхлытых из бусин Ins (1, 4, 5)P3, по сравнению с белками, вымытыми из бусинок агарозы. Масс-спектрометрический анализ эластимовых белков выявил более 250 белков, из которых 84 были обогащены бисером Ins (1, 4, 5)P3, по сравнению с контрольными бусинами.Обогащение белков, связанных с Ins (1, 4, 5)P3, по сравнению с контрольными бусинами, коррелирует с белковым сигналом, обнаруженным SDS-PAGE. Важным шагом в этом протоколе является использование соответствующих элементов управления для дискриминации конкретных от неспецифических взаимодействий. Мы рекомендуем использовать несопрягие бусы агарозы, а также бисер, спрягаемый с инозитол фосфатами или фосфатами, используя различные конфигурации фосфатов, в том числе не фосфорилированные формы.Этот метод может быть применен к другим одноклеточным простейшим паразитам, таким как Трипаносома крузи, лейшмания или плазмодий. Он также может быть легко адаптирован к другим организмам, в том числе дрожжей или клеток млекопитающих. Этот метод может быть соединен с количественной масс-спектрометрией, такой как SILAC, для выявления динамических взаимодействий белков с инозитол фосфатами или фосфатами.В также может быть объединена с субклеточной фракциотации, для выявления органеллы конкретных белков, которые связываются с этими метаболитами. Этот подход помог определить белки, которые связываются с инозитол фосфатами и фосфатами в T.brucei, клетках млекопитающих и дрожжах. Это помогло определить новые белковые домены, которые связываются с фосфоинозитидами.Это проложило путь к понимание регулятивной функции этих метаболитов, их роли в экспрессии генов, развитии клеток и трансдукции сигнала в эукариотах. Некоторые из реагентов в этом протоколе являются токсичными или легковоспламеняющимися. Используйте средства индивидуальной защиты, и при необходимости, работа в дымовой капот.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...