Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch Supplement for Early Career Researchers (DGECR-2019-00081) y por McGill University.

1. Análisis de proteínas de unión IP o PI mediante cromatografía de afinidad y hincha occidental
<ol><li>Crecimiento celular, lisis y cromatografía de afinidad
	<ol><li>Aumente las células de T. brucei hasta la fase de registro medio y supervise la viabilidad y densidad celular. Un total de 5.0 x 107 celdas es suficiente para un ensayo de unión.<ol>
<li>Para las formas del torrente sanguíneo, las células de crecimiento en medios hinmultimedia-9 complementadas con...

La identificación de proteínas que se unen a iPs o PIs es fundamental para entender la función celular de estos metabolitos. La cromatografía de afinidad acoplada a la mancha occidental o a la espectrometría de masas ofrece la oportunidad de identificar proteínas que interactúan con IP o PI y, por lo tanto, obtener información sobre su función reguladora. IPs o PIs químicamente etiquetados [por ejemplo, Ins(1,4,5)P3 químicamente vinculados a la biotina] y reticulados a cuentas agarose a través de estreptavidi...

Los fosfatos de inositol (IPs) y los fosfoinositidos (PI) desempeñan un papel central en la biologíadel eucariota a través de la regulación de los procesos celulares como el control de la expresión génica 1,2,3, tráfico de vesículas 4, transducción de señal5,6, metabolismo7,8,9, y desarrollo8,10. La función reguladora de estos metabolitos resulta de su capacidad para interactuar con las proteínas y así regular la función proteica. Tras la unión por proteínas, las IPs y los INDICADORes de usuario pueden alterar la conformación de proteínas11,la actividad catalítica12o las interacciones13 y, por lo tanto, afectar la función celular. Las IPs y pIs se distribuyen en múltiples compartimentos subcelulares, tales como núcleo2,3,14,15, retículo endoplasmático16,17, plasma membrana1 y citosol18,ya sea asociadas a proteínas3,19 o con ARN20.
El escote de la membrana asociada a PI(4,5)P2 por fosfolipasa C da como resultado la liberación de Ins(1,4,5)P3, que puede ser fosforilado o desfosforilado por quinasas IP y fosfatasas, respectivamente. Las IPs son moléculas solubles que pueden unirse a las proteínas y ejercer funciones reguladoras. Por ejemplo, Ins(1,4,5)P3 en metazoan puede actuar como un segundo mensajero mediante la unión a los receptores IP3, que induce los cambios de conformación de receptores y por lo tanto la liberación de Ca2 + de los almacenes intracelulares11. Ins(1,3,4,5)P4 se une al complejo histona deacetilasa y regula el ensamblaje y la actividad del complejo proteico13. Otros ejemplos de la función reguladora de IPs incluyen el control de la organización de la cromatina21, el transporte de ARN22,23, la edición de ARN24y la transcripción1,2,3 . Por el contrario, los indicadores de calidad a menudo se asocian con el reclutamiento de proteínas en la membrana plasmática u membranas orgánulos25. Sin embargo, una propiedad emergente de los PE es la capacidad deasociarse con proteínas en un entorno no membranoso 3,15,19,26. Este es el caso del factor esteroideogénico del receptor nuclear, que la función de control transcripcional está regulada por PI(3,4,5)P319, y poli-A polimerasa que la actividad enzimática está regulada por PI nuclear(4,5)P226. Se ha demostrado un papel regulador para las IPs y los INDICADORes de poder en muchos organismos, entre ellos la levadura22,27, las células de mamíferos19,23, Drosophila10 y los gusanos28. De importancia es el papel de estos metabolitos en los tripanosomas, que divergieron temprano del linaje eucariota. Estos metabolitos desempeñan un papel esencial en el control transcripcional de Trypanosoma brucei 1,3, desarrollo8, biogénesis de organélteme y tráfico proteico29,30 , 31 , 32, y también participan en el control del desarrollo y la infección en los patógenos T. cruzi33,34,35,Toxoplasma36 y Plasmodium 5 , 37. Por lo tanto, comprender el papel de las iP y los indicadores de rendimiento en los tripanosomas puede ayudar a dilucidar una nueva función biológica para estas moléculas e identificar nuevos objetivos farmacológicos.
La especificidad de la proteína y la unión IP o PI depende de los dominios de interacción de proteínas y el estado de fosforilación del inositol13,38, aunque las interacciones con la parte lipídica de los indicadores de rendimiento también se producen19. La variedad de IPs y PIs y sus quinasas modificadoras y fosfaplanas proporciona un mecanismo celular flexible para controlar la función proteica que está influenciado por la disponibilidad y abundancia de metabolitos, el estado de fosforilación del inositol, y la proteína afinidad de interacción1,3,13,38. Aunque algunos dominios proteicos están bien caracterizados39,40,41, por ejemplo, dominio de homología de pleckstrina42 y SPX (SYG1/Pho81/XPR1) dominios43 ,44,45, algunas proteínas interactúan con IPs o PIs por mecanismos que permanecen desconocidos. Por ejemplo, la proteína represor-activadora 1 (RAP1) de T. brucei carece de dominios canónicos de unión PI, pero interactúa con PI(3,4,5)P3 y controla la transcripción de genes implicados en la variación antigénica3. Cromatografía de afinidad y análisis de espectrometría de masas de proteínas de interacción IP o PI a partir de células tripanosomasas, de levadura o de mamíferos identificados varias proteínas sin dominios conocidos de unión IP o PI8,46, 47. Los datos sugieren dominios proteicos adicionales no caracterizados que se unen a estos metabolitos. Por lo tanto, la identificación de proteínas que interactúan con IPs o PIs puede revelar nuevos mecanismos de interacción proteína-metabolito y nuevas funciones reguladoras celulares para estas moléculas pequeñas.
El método descrito aquí emplea cromatografía de afinidad acoplada a la hincha occidental o espectrometría de masas para identificar proteínas que se unen a iPs o PIs. Utiliza IP biotiniadas o PIs que están reticuladas a estreptavidina conjugadas con cuentas de agarosa o, alternativamente, capturadas a través de cuentas magnéticas conjugadas con estreptavidina (Figura1). El método proporciona un flujo de trabajo simple que es sensible, no radioactivo, libre de liposomas y es adecuado para detectar la unión de proteínas de los lysatos celulares o proteínas purificadas3 (Figura 2). El método se puede utilizaren proteínas de masa cuantitativa 47 sin etiquetas 8,46 o acopladas a espectrometría cuantitativa de masas con etiqueta de aminoácidos47 para identificar proteínas IP o PI-binding a partir de muestras biológicas complejas. Por lo tanto, este método es una alternativa a los pocos métodos disponibles para estudiar la interacción de IPs o PI con proteínas celulares y ayudará a entender la función reguladora de estos metabolitos en los tripanosomas y tal vez otros eucariotas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

Fosfatos de inositol y fosfoinosítidos regulan varios procesos celulares en eucariotas, incluyendo la expresión génica, tráfico de vesículas, transducción de señal, metabolismo, y el desarrollo. Estos metabolitos realizan esta actividad reguladora uniéndose a proteínas, cambiando así la conformación de proteínas, la actividad catalítica y/o las interacciones. El método descrito aquí utiliza cromatografía de afinidad acoplado a espectrometría de masas o hincha occidental para identificar proteínas que interactúan con fosfatos de inositol o fosfoinositidas. Fosfatos de inositol o fosfoinositidas se etiquetan químicamente con biotina, que luego se captura a través de la estreptavidina conjugada con agarosa o cuentas magnéticas. Las proteínas se aíslan por su afinidad de unión al metabolito, luego se eluyen e identifican mediante espectrometría de masas o hincha occidental. El método tiene un flujo de trabajo simple que es sensible, no radioactivo, libre de liposomas y personalizable, apoyando el análisis de la interacción de proteínas y metabolitos con precisión. Este enfoque se puede utilizar en métodos de espectrometría cuantitativa de masas sin etiquetas o en aminoácidos para identificar interacciones proteína-metabolito en muestras biológicas complejas o utilizando proteínas purificadas. Este protocolo está optimizado para el análisis de proteínas de Trypanosoma brucei,pero se puede adaptar a parásitos protozoarios relacionados, levaduras o células de mamíferos.

Análisis de la interacción RAP1 y PI(3,4,5)P3 por cromatografía de afinidad y hincha occidental Este ejemplo ilustra la aplicación de este método para analizar la unión de PIs por RAP1 de T. brucei lysate o por proteína recombinante T. brucei RAP1. Los lysates de T. brucei formas del torrente sanguíneo que expresan rap1 con etiqueta de hemaglutinina (HA) se utilizaron en ensayos de unión. RAP1 es una proteína implicada en el control transcripcional de genes de glic...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Este protocolo se centra en la identificación de proteínas que se unen a fosfatos de inositol o fosfoinosítidos. Utiliza cromatografía de afinidad con fosfatos de inositol biotinylados o fosfoinositidos que se inmovilizan a través de estreptavidina a agarosa o cuentas magnéticas. Las proteínas de unión de fosfato de inositol o fosfoinositida se identifican por la hincha occidental o espectrometría de masas.

Identificación de fosfato de inositol o proteínas que interactúan con fosfoinositida por cromatografía de afinidad acoplada a Western Blot o espectrometría de masas

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Fosfato de inositol y fosfoinositides son metabolitos que tienen varias funciones reguladoras en eucariotas, incluyendo el control de la expresión génica, tráfico de proteínas, transducción de señales, y el desarrollo celular. Realizan estas funciones reguladoras mediante la unión a proteínas, cambiando así la conformación proteica, la actividad catalítica o las interacciones proteicas. La identificación de proteínas que se unen a fosfato de inositol o fosfoinositides es esencial para entender cómo esos metabolitos realizan su función reguladora.Este protocolo tiene un flujo de trabajo simple que es sensible, no radioactivo, libre de lisos y utiliza reactivos que están disponibles comercialmente. En este método, una cromatografía terminada con fosfato de inositol biotinilado o fosfoinositides, se utiliza para aislar las proteínas que interactúan, a continuación, se identifican por mancha occidental, o espectrometría de masas. Para las formas de flujo sanguíneo, hacer crecer las células T.brucei a la fase de registro medio en medios HMI-9, complementados con 10%FBS, a 37 grados Celsius, con 5% dióxido de carbono.Mantenga la densidad celular entre 800.000 y 1,6 millones de células por mililitro. Cuando esté listo, centrifugar las células a 1600 veces G, y a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet en 10 mililitros de PBS-G precalentado a 37 grados centígrados para lavar las células.Centrifugar las células a 1600 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos para completar el lavado. Repita este procedimiento de lavado dos veces más. A continuación, resuspender el pellet en un mililitro de PBS-G.Transfiera esta suspensión a un tubo de un punto y cinco mililitros, luego centrifugar a 1600 veces G durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante, y resuspender el pellet en cero punto cinco mililitros de tampón de lysis, complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa de cinco puntos, y un cóctel inhibidor de la fosfatasa X que se ha enfriado previamente en hielo para alcear las células. Centrifugar el lysate a 1400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Después de esto recoger el sobrenadante, que contiene las proteínas del parásito extraído, en un nuevo tubo de un punto cinco mililitros para los ensayos de unión. Reserva el 5% del total de lysate para el análisis de manchas occidentales. Recoger 50 microlitros de fosfatos de inositol o fosfoinositides conjugados a cuentas de agarosa, y añadirlos 500 mililitros de tampón de unión.Centrifugar a 1000 veces G durante un minuto. Deseche el sobrenadante y resusppend en 50 microlitros de tampón de unión para equilibrar las perlas. Utilice perlas no conjugadas como control y utilice perlas con diferentes configuraciones de fosfato, incluidas las formas no fosforiladas, para controlar las interacciones inespecíficas.A continuación, agregue 50 microlitros de perlas IP o PI al licato celular o a las proteínas purificadas. Mantenga el volumen de cuentas dentro del 10% del total de lysate. Si es necesario, utilice el búfer de enlace para ajustar el volumen de la reacción de enlace.Incubar la reacción durante una hora o durante la noche a cuatro grados centígrados, mientras gira a las 50 rpm. Después de esto, centrifugar la mezcla a 1000 veces G, y a cuatro grados Celsius durante un minuto. Retire el sobrenadante, y mantenga el pellet, asegurándose de mantener el 5% del sobrenadante para el análisis de manchas occidentales.A continuación, agregue un mililitro de tampón de lavado y toque o gire el tubo para resuspender la resina. Centrifugar la reacción a 1000 veces G, y a cuatro grados Celsius durante un minuto, y desechar el sobrenadante. Repita este proceso para un total de cinco lavados.Después de esto, añadir 50 microlitros de 2X Laemmli tampón complementado con 710 milimolar 2-mercaptoetanol a las cuentas. Toque o vórtice para mezclar y diluir las proteínas. A continuación, calienta a 95 grados centígrados durante cinco minutos, y centrifuga a 10.000 veces G durante un minuto.Recoger el sobrenadante, y congelar el eluido en menos 80 grados Celsius, o proceder al análisis de manchas occidentales. El método presentado aquí se utiliza para analizar la unión de losP mediante la proteína represor-activador 1 del lysate T.brucei, o por proteína recombinante T.brucei repressor-activator protein 1. Como RAP1 carece de dominios de enlace PI canónicos, los ensayos vinculantes se realizan con PI que no son fosforilados, o que se fosforilan en diferentes posiciones del anillo de inositol, y con cuentas de agarosa no conjugadas.El análisis occidental muestra que rap1 se une preferentemente a las cuentas PI(3, 4, 5)P3, pero que también se une en menor medida a las perlas PI(4, 5)P2. Sin embargo, no se une a ningún otroP o perlas de agarosa. Para comprobar si RAP1 se une directamente a los rendimientos, se expresa y purifica una proteína RAP1 recombinante 6XHis etiquetada terminalmente con etiqueta C y purificada a la homogeneidad de E. coli.La hinchazón occidental muestra que el aumento de la concentración de PI(3, 4, 5)P3, pero no PI(4, 5)P2, inhibe la interacción de RAP1 recombinante con cuentas PI(3, 4, 5)P3. La adición de la enzima PIP5Pase purificada de T.brucei a la reacción restaurada PI(3, 4, 5)P3 unión por RAP recombinante1. Esto se debe a la desfosforilación PIP5Pase de PI libre(3, 4, 5)P3, y por lo tanto indica que el patrón de fosforilación de este metabolito es esencial para nuestra unión RAP1.Las proteínas T.brucei que se unen a Ins(1, 4, 5)P3 se identifican entonces mediante cromatografía de afinidad seguida de espectrometría de masas. El análisis SDS-PAGE muestra el enriquecimiento en proteínas eluidas de las perlas Ins(1, 4, 5)P3, en comparación con las proteínas eluidas de las cuentas de agarosa de control. El análisis de espectrometría de masas de las proteínas eluidas identificó más de 250 proteínas de las cuales 84 se enriquecieron con perlas Ins(1, 4, 5)P3, en comparación con las perlas de control.El enriquecimiento de proteínas unidas a Ins(1, 4, 5)P3, en comparación con las perlas de control, se correlaciona con la señal proteica detectada por SDS-PAGE. Un paso crítico en este protocolo es el uso de controles adecuados, para discriminar específicamente de interacciones no específicas. Recomendamos el uso de cuentas de agarosa no conjugadas, y cuentas conjugadas con fosfato de inositol o fosfoinositides, utilizando varias configuraciones de fosfato, incluyendo formas no fosforiladas.Este método se puede aplicar a otros parásitos protozoarios unicelulares, como Trypanosoma cruzi, leishmania o plasmodium. También se puede adaptar fácilmente a otros organismos, incluyendo levaduras o células de mamíferos. Este método se puede acoplar a espectrometría de masas cuantitativa, como SILAC, para identificar interacciones dinámicas de proteínas con fosfato de inositol o fosfoinostidos.In también se puede combinar con fraccionamiento subcelular, para identificar proteínas específicas de organelo que se unen a estos metabolitos. Este enfoque ha ayudado a identificar las proteínas que se unen a fosfato de inositol y fosfoinositides en T.brucei, células de mamíferos, y levadura. Ha ayudado a identificar nuevos dominios proteicos que se unen a los fosfoinositides.Ha allanado el camino para entender la función reguladora de estos metabolitos, su papel en la expresión génica, el desarrollo celular y la transducción de señales en eucariotas. Algunos de los reactivos de este protocolo son tóxicos o inflamables. Utilice equipo de protección personal y, cuando sea necesario, trabaje en una campana de humos.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Investigación

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caracterización de proteínas por cromatografía de exclusión de tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolómica cuantitativa de Saccharomyces cerevisiae mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...