Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Detta arbete stöddes av naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery lansering tillägg för tidiga karriär forskare (DGECR-2019-00081) och av McGill University.

1. analys av IP-eller PI-bindande proteiner genom affinitetskromatografi och Western blotting
<ol><li>Cell tillväxt, lys-och affinitetskromatografi
	<ol><li>Odla T. rhodesiense celler till mitten av log fas och övervaka cellernas lönsamhet och densitet. Totalt 5,0 x 107 celler räcker för en bindande analys.<ol>
<li>För blodomloppet former, växa celler i HMI-9 Media kompletteras med 10% foster bovin serum (FBS) vid 37 ° c och 5% CO2. Behåll CELLTÄTHETEN mellan 8,...

Identifieringen av proteiner som binder till IPs eller PIs är avgörande för att förstå den cellulära funktionen av dessa metaboliter. Affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri erbjuder en möjlighet att identifiera IP-eller PI-samverkande proteiner och därmed få insikter om deras reglerande funktion. IPS eller Pis kemiskt märkta [t. ex., ins (1, 4, 5) P3 kemiskt kopplad till biotin] och tvärbunden till Agros pärlor via konjugerat eller fångas av konjugerat magnetiska pärlor till?...

Inositol fosfater (IPS) och phosphoinositides (Pis) spelar en central roll i eukaryotebiologi genom regleringen av cellulära processer såsom kontroll av genuttryck1,2,3, vesikel trafficking 4, signaltransduktion5,6, metabolism7,8,9, och utveckling8,10. Reglerande funktion av dessa metaboliter resulterar från deras förmåga att interagera med proteiner och därmed reglera proteinfunktion. Vid bindning av proteiner, IPs och PIs kan förändra protein konformation11, katalytisk aktivitet12, eller interaktioner13 och därmed påverka cellulär funktion. IPS och Pis distribueras i flera subcellulära fack, såsom Nucleus2,3,14,15, endoplasmatiska Retikulum16,17, plasma membran1 och Cytosol18, antingen associerat med proteiner3,19 eller med rnas20.
Klyvning av membran-associerade PI (4,5) P2 av fosfolipas C resulterar i frisättning av ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforyleras eller defosforyleras genom IP-kinaser respektive fosfataser. IPs är lösliga molekyler som kan binda till proteiner och utöva reglerande funktioner. Till exempel, ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungera som en andra budbärare genom bindning till IP3-receptorer, som inducerar receptor överensstämmelser förändringar och därmed frisättning av ca2 + från intracellulära butiker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder till histondeacetylase-komplexet och reglerar proteinkomplex montering och aktivitet13. Andra exempel på IPS reglerande funktion omfattar kontroll av kromatin organisation21, RNA transport22,23, RNA redigering24, och transkription1,2,3 . Däremot är PIs ofta förknippade med rekrytering av proteiner till plasmamembranet eller organell membran25. En framväxande egenskap hos Pis är dock förmågan att associera med proteiner i en icke-membranös miljö3,15,19,26. Detta är fallet med den nukleära receptorn steroidogena Factor, som transkriptionella kontrollfunktion regleras av PI (3, 4, 5) P319, och Poly-A polymeras som enzymatisk aktivitet regleras av kärn-PI (4,5) P226. En reglerande roll för IPS och Pis har visats i många organismer, inklusive jäst22,27, däggdjursceller19,23, Drosophila10 och Worms28. Av betydelse är den roll som dessa metaboliter i trypanosomes, som divergerat tidigt från eukaryotiska härstamning. Dessa metaboliter spelar en viktig roll i Trypanosoma rhodesiense transkriptionella kontroll1,3, utveckling8, organell biogenes och protein trafik29,30 , 31 , 32, och är också involverade i att kontrollera utveckling och infektion i patogenerna T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 och Plasmodium ,5 , 37. att förstå betydelsen av IPS och Pis i innebörder kan därför bidra till att belysa ny biologisk funktion för dessa molekyler och identifiera nya läkemedelsmål.
Specificiteten hos protein och IP eller PI bindning beror på protein samverkande domäner och fosforylering tillstånd av inositol13,38, även interaktioner med lipiddelen av Pis förekommer också19. Mångfalden av IPs och PIs och deras modifiera kinaser och fosfataser ger en flexibel cellulär mekanism för att kontrollera proteinfunktion som påverkas av metabolit tillgänglighet och överflöd, den fosforylering tillstånd av inositol, och protein interaktion1,3,13,38. Även om vissa protein domäner är väl kännetecknas39,40,41, t. ex., pleckstrin homologi domän42 och SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domäner43 ,44,45, vissa proteiner interagerar med IPS eller Pis genom mekanismer som förblir okända. Till exempel, den repressor-Activator protein 1 (RAP1) av T. rhodesiense saknar kanoniska PI-bindande domäner men interagerar med PI (3, 4, 5) P3 och kontrollera transkription av gener inblandade i antigen variation3. Affinitetskromatografi och masspektrometri analys av IP-eller PI-interagerande proteiner från trypanosome, jäst eller däggdjursceller identifierade flera proteiner utan kända IP-eller PI-bindande domäner8,46, 47. data tyder på ytterligare okarakteriserade protein domäner som binder till dessa metaboliter. Därför kan identifieringen av proteiner som interagerar med IPs eller PIs avslöja nya mekanismer för interaktion med proteinmetabolit och nya cellulära reglerande funktioner för dessa små molekyler.
Den metod som beskrivs här använder affinitetskromatografi kopplad till västerländsk blotting eller masspektrometri för att identifiera proteiner som binder till IPs eller PIs. Den använder biotinylerade IPS eller Pis som är antingen tvärbunden till konjugerat konjugerat till agarpärlor eller alternativt, fångas via konjugerat-konjugerade magnetiska pärlor (figur 1). Metoden ger ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, Liposome-fritt och lämpar sig för att detektera bindningen av proteiner från cell celllysat eller renade proteiner3 (figur 2). Metoden kan användas i etikettfria8,46 eller kopplad till aminosyramärkt kvantitativ masspektrometri47 för att identifiera IP-eller PI-bindande proteiner från komplexa biologiska prover. Därför är denna metod ett alternativ till de få metoder som finns för att studera samspelet mellan IPS eller Pis med cellulära proteiner och kommer att bidra till att förstå reglerande funktion av dessa metaboliter i innebörder och kanske andra eukaryotes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

Inositol fosfater och phosphoinositides reglera flera cellulära processer i eukaryotes, inklusive genuttryck, vesikel trafficking, signaltransduktion, metabolism, och utveckling. Dessa metaboliter utföra denna reglerande aktivitet genom bindning till proteiner, därmed förändrade protein konformation, katalytisk aktivitet, och/eller interaktioner. Den metod som beskrivs här använder affinitetskromatografi kopplad till masspektrometri eller Western blotting att identifiera proteiner som interagerar med inositol fosfater eller phosphoinositides. Inositol fosfater eller phosphoinositides är kemiskt märkta med biotin, som sedan fångas via konjugerat konjugerat till aguppstod eller magnetiska pärlor. Proteiner isoleras genom sin affinitet av bindning till metaboliten, sedan eluerade och identifieras genom masspektrometri eller Western blotting. Metoden har ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, Liposome-fritt, och anpassningsbara, stödja analys av protein och metabolit interaktion med precision. Denna metod kan användas i etikettfri eller i aminosyremärkta kvantitativa masspektrometrimetoder för att identifiera interaktioner med proteinmetabolit i komplexa biologiska prover eller med hjälp av renade proteiner. Detta protokoll är optimerat för analys av proteiner från Trypanosoma rhodesiense, men det kan anpassas till relaterade protozoer parasiter, jäst eller däggdjursceller.

Analys av RAP1 och PI (3, 4, 5) P3 interaktion genom affinitetskromatografi och Western blotting Detta exempel illustrerar tillämpningen av denna metod för att analysera bindningen av Pis genom RAP1 från t. rhodesiense lysate eller med rekombinant t. rhodesiense RAP1 protein. Lysates av T. rhodesiense blodomloppet bildar det uttryckligt hemagglutinin (ha)-märkta RAP1 användes i bindande analyser. RAP1 är ett protein som deltar i transkriptionell kontroll av variant yta...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Detta protokoll fokuserar på identifiering av proteiner som binder till inositol fosfater eller phosphoinositides. Den använder affinitetskromatografi med biotinylerade inositol fosfater eller phosphoinositides som immobiliseras via konjugerat till aguppstod eller magnetiska pärlor. Inositol fosfat eller fosfoinositid bindande proteiner identifieras genom Western blotting eller masspektrometri.

Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Inositol fosfat och fosfositider är metaboliter som har flera reglerande funktioner i eukaryoter, inklusive kontroll av genuttryck, proteinhandel, signaltransduktion, och cellutveckling. De utför dessa reglerande funktion genom att binda till proteiner, vilket ändrar proteinkonformation, katalytisk aktivitet, eller protein interaktioner. Identifiering av proteiner som binder till inositolfosfat eller fosfositider är avgörande för att förstå hur dessa metaboliter utför sin reglerande funktion.Detta protokoll har ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, lyposome gratis och använder reagenser som är kommersiellt tillgängliga. I denna metod, en färdig kromatografi med biotinylerat inositolfosfat eller fosfositides, används för att isolera interagerande proteiner, de identifieras sedan av västra blot, eller masspektrometri. För blodomloppsformer, odla T.brucei celler till mitten log fas i HMI-9 media, kompletterat med 10%FBS, vid 37 grader Celsius, med 5%Koldioxid.Håll celltätheten mellan 800, 000 och 1,6 miljoner celler per milliliter. När du är klar centrifugera cellerna vid 1600 gånger G, och i rumstemperatur i 10 minuter. Kasta supernatanten och försiktigt återanvänd pelleten i 10 millileter PBS-G föruppvärmd i 37 grader Celsius för att tvätta cellerna.Centrifugera cellerna vid 1600 gånger G och vid rumstemperatur i fem minuter för att slutföra tvätten. Upprepa denna tvättprocedur två gånger till. Sedan återanvänder du pelleten i en milliliter av PBS-G.Överför denna suspension till en en punkt fem milliliter rör, sedan centrifug vid 1600 gånger G i fem minuter. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i nollpunkt fem milliliter av lysbuffert, kompletterat med en punkt fem X proteashämmare cocktail, och en X fosfasmedelscocktail som har förkylts på is för att lysa cellerna. Centrifugera lysate på 1400 gånger G och vid fyra grader Celsius i 10 minuter.Efter detta samla supernatanten, som innehåller de extraherade parasitproteinerna, in i ett nytt en punkt fem milliliterrör för bindningsanalyserna. Avsätt 5%av den totala lysate för Western blot analys. Samla in 50 mikroliter av inositolfosfater eller fosfositider konjugerade till agarose pärlor, och lägg till dem 500 milliliter av bindande buffert.Centrifugera vid 1000 gånger G i en minut. Kassera supernatanten och resuspend i 50 mikroliter av bindande buffert för att balansera pärlorna. Använd icke-konjugerade pärlor som en kontroll, och använd pärlor med olika fosfatkonfigurationer inklusive icke-fosforylerade former, för att kontrollera för ospecifik interaktion.Därefter lägger du till 50 mikroliter av IP- eller PI-pärlor till cellen lysate eller de renade proteinerna. Håll volymen av pärlor inom 10%av den totala lysate. Använd vid behov bindningsbuffert för att justera bindningsreaktionens volym.Inkubera reaktionen för antingen en timme eller över natten vid fyra grader Celsius, medan roterande vid 50rpm. Efter detta centrifugera blandningen vid 1000 gånger G, och vid fyra grader Celsius i en minut. Ta bort supernatanten och behåll pelleten och se till att hålla 5%av supernatanten för western blot-analys.Tillsätt sedan en milliliter tvättbuffert och knacka eller snurra röret för att återanvända hartset. Centrifugera reaktionen vid 1000 gånger G, och vid fyra grader Celsius i en minut, och kasta supernatanten. Upprepa denna process för totalt fem tvättar.Efter detta, tillsätt 50 mikroliter av 2X Laemmli buffert kompletterad med 710 millimolar 2-merkaptoetanol till pärlorna. Peka eller virvel för att blanda, och späda ut proteinerna. Därefter värmer du vid 95 grader Celsius i fem minuter, och centrifug vid 10 000 gånger G i en minut.Samla supernatant, och antingen frysa eluat vid minus 80 grader Celsius, eller gå vidare till västra blot analys. Den metod som presenteras här används för att analysera bindningen av PIs genom repressor-activator protein 1 från T.brucei lysate, eller genom rekombinant T.brucei repressor-activator protein 1 protein. Som RAP1 saknar kanoniska PI bindande domäner, är de bindande analyser som utförs med PIs som är icke-fosforylerat, eller som är fosforyleras vid olika positioner av inositol ringen, och med icke-konjugerade agarose pärlor.Av den västerländska analysen framgår att RAP1 företrädesvis binder till PI(3, 4, 5)P3-pärlor, men att det också i mindre utsträckning binder till PI(4, 5)P2-pärlor. Det binder dock inte till några andra PIs eller agarose pärlor. För att testa om RAP1 binder direkt till PIs, uttrycks ett C terminally taggade 6XHis rekombinant RAP1 protein och renas till homogenitet från E.Coli.Western blotting visar att en ökning av koncentrationen av PI(3, 4, 5)P3, men inte PI(4, 5)P2, hämmar interaktionen av rekombinanta RAP1 med PI(3, 4, 5)P3 pärlor. Tillsats av T.brucei renat PIP5Pase-enzym till reaktionen återställd PI(3, 4, 5)P3-bindning genom rekombinant RAP1. Detta beror på PIP5Pase dephosphorylation av fri PI(3, 4, 5)P3, och därmed anger att fosforyleringsmönstret för denna metabolit är avgörande för vår RAP1-bindning.T.brucei-proteiner som binder till Ins(1, 4, 5)P3 identifieras sedan genom affinitetkromatografi följt av masspektrometri. SDS-PAGE-analys visar anrikning i proteiner som eluteras från Ins(1, 4, 5)P3-pärlor, jämfört med proteiner som eluteras från kontrollarosspärlorna. Masspektrometrianalys av de eluterade proteinerna som identifierats över 250 proteiner av vilka 84 berikades med Ins(1, 4, 5)P3-pärlor, jämfört med kontrollpärlor.Anrikningen av proteiner bundna till Ins(1, 4, 5)P3, jämfört med kontrollpärlor, korrelerar med den proteinsignal som detekteras av SDS-PAGE. Ett kritiskt steg i detta protokoll är användningen av lämpliga kontroller, för att diskriminera specifika från icke-specifika interaktioner. Vi rekommenderar att du använder icke-konjugerade agarose pärlor, och pärlor konjugerade med inositol fosfat eller fosfositider, med hjälp av olika fosfat konfigurationer, inklusive icke-fosforylerade former.Denna metod kan tillämpas på andra encelliga protozoiska parasiter, såsom Trypanosoma cruzi, leishmania, eller plasmodium. Det kan också lätt anpassas till andra organismer, inklusive jäst eller däggdjursceller. Denna metod kan kopplas till kvantitativ masspektrometri, såsom SILAC, för att identifiera dynamiska interaktioner av proteiner med inositolfosfat eller fosfoinoides.I kan också kombineras med subcellulär fraktionering, att identifiera organelle specifika proteiner som binder till dessa metaboliter. Detta tillvägagångssätt har bidragit till att identifiera proteiner som binder till inositol fosfat och fosfositides i T.brucei, däggdjursceller, och jäst. Det har hjälpt till att identifiera nya proteindomäner som binder till fosfoinositider.Det har banat väg för att förstå den reglerande funktionen av dessa metaboliter, deras roll i genuttryck, cellutveckling, och signaltransduktion i eukaryoter. Några av reagenserna i detta protokoll är giftiga, eller brandfarliga. Använd personlig skyddsutrustning, och vid behov arbeta i en rökhuva.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analys av peptidoglykan genom vätskekromatografi, masspektrometri och bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomik av sackaromyces Cerevisiae med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...