Name: identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Bu çalışma Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC, RGPIN-2019-04658) tarafından destekleniyordu; Erken kariyer araştırmacılar için NSERC Discovery fırlatma eki (DGECR-2019-00081) ve McGill Üniversitesi tarafından.

1. yakınlık Kromatografi ve Batı lekeleme tarafından IP-veya PI-bağlayıcı proteinlerin Analizi
<ol><li>Hücre büyümesi, lizis ve yakınlık Kromatografi
	<ol><li>Orta günlük faz ve monitör hücre canlılığı ve yoğunluk T. brucei hücreleri büyümek. Toplam 5,0 x 107 hücre bir bağlayıcı tahlil için yeterlidir.<ol>
<li>Kan akışı formları için, 37 °C ve% 5 CO2' de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilen HMI-9 medyadaki hücreleri büyü...

IPS veya 'e bağlanan proteinlerin tanımlanması, bu metabolitlerin hücresel fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Batı leke veya kütle spektrometresi ile bağlantılı benzeşme kromatografi, IP veya PI etkileşimi olan proteinlerin belirlenmesi ve dolayısıyla düzenleyici fonksiyonları hakkında öngörüler elde etmek için bir fırsat sunar. IPS veya kimyasal olarak etiketlenmiş [örn., INS (1, 4, 5) P3 kimyasal olarak biotin bağlı] ve streptavidin yoluyla agaroz boncuklar için çapraz bağlı veya strept...

İnositol fosfat (IPS) ve phosphoinositides (PIS) gen ifadesi1,2,3, vezikül kaçakçılığı kontrolü gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesi yoluyla ökaryote biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır 4, sinyal dönüştürücü5,6, metabolizma7,8,9, ve geliştirme8,10. Bu metabolitlerin düzenleyici fonksiyonu proteinlerle etkileşim ve böylece protein fonksiyonunu düzenleyen yeteneğinden sonuçlanır. Proteinler tarafından bağlayıcı üzerine, IPS ve protein konformasyonu11değiştirebilir, katalitik aktivite12, veya etkileşimler13 ve dolayısıyla hücresel fonksiyonunu etkiler. IPS ve, Nucleus2,3,14,15, endoplazmik retikulum16,17, Plasma gibi birden fazla alt hücreli bölmeler halinde dağıtılır membran1 ve sitsol18, proteinlerle ilişkili3,19 veya Rnas20.
Membran ile ilişkili PI (4, 5) P2 fosfolipase C tarafından pedi (1, 4, 5) P3, hangi fosforilize edilebilir veya IP kinazları ve fosfatlar tarafından dephosphorylated, sırasıyla. IPS, proteinlere bağlanan ve düzenleyici fonksiyonları destekleyen çözünebilir moleküllerdir. Örneğin, INS (1, 4, 5) Metazoan P3 IP1 reseptörleri bağlayıcı tarafından ikinci bir haberci olarak hareket edebilir, hangi reseptör Konformasyonel değişiklikleri ve böylece CA serbest bırakmak2 + hücre içi mağazalardan11. INS (1, 3, 4, 5) P4 histon deasetilaz kompleksine bağlanır ve protein kompleksi montajı ve aktivite13düzenler. IPS düzenleyici fonksiyon diğer örnekler kromatin organizasyon21, RNA taşıma22,23, RNA düzenleme24ve transkripsiyon1,2,3 kontrolü içerir . Buna karşılık, genellikle plazma membranı veya organel membranlara protein alımı ile ilişkilidir25. Ancak, 'in gelişmekte olan bir özelliği, membran olmayan bir ortamda proteinleri ile ilişkilendirmek için yeteneğidir3,15,19,26. Bu nükleer reseptör steroidojenik faktör olduğunu, hangi transkripsiyonel kontrol fonksiyonu Pi tarafından düzenlenir (3, 4, 5) P319, ve poli-A polimeraz hangi enzimatik aktivite nükleer PI tarafından düzenlenir (4, 5) P226. IP 'ler ve için bir düzenleyici rol Maya22,27, mammalin hücreleri19,23, Drosophila10 ve Worms28dahil olmak üzere birçok organizmalarda gösterildi. Önemli olan bu metabolitlerin Tripanozomlar içinde rolüdür, bu da erken ökaryotik soydan uzaklaşır. Bu metabolitler tripanosoma brucei transkripsiyonel kontrol1,3, geliştirme8, organel Biyogenez ve protein trafiği önemli bir rol oynar29,30 , 31 , 32ve aynı zamanda patojenler T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 ve Plasmodium geliştirme ve enfeksiyon kontrol dahil edilir 5 , 37. bu nedenle, tripanosomlar içinde IPS ve rolünü anlamak bu moleküller için yeni biyolojik fonksiyon aydınlatmak ve Roman uyuşturucu hedeflerini belirlemek için yardımcı olabilir.
Protein ve IP veya PI bağlamanın özgüllüğü, protein etkileşimindeki etki alanlarına ve Inositol13'ün fosforilasyon durumuna bağlıdır,38, Ayrıca, lipid parçası ile etkileşimler de19oluşur. Çeşitli IPS ve ve onların değiştirme kinazlar ve fosfatları metabolit kullanılabilirliği ve bolluk, inositol fosforilasyon durumu ve protein etkilenir protein fonksiyonunu kontrol etmek için esnek bir hücresel mekanizma sağlar etkileşimin benzeşimi1,3,13,38. Bazı protein alanları iyi karakterize olmasına rağmen39,40,41, örn., pleckstrin Homoloji Domain42 ve SPX (SYG1/Pho81/XPR1) Domains43 ,44,45, bazı proteinler IPS veya ile bilinmeyen mekanizmalar tarafından etkileşimde. Örneğin, T. brucei 'nin baskıcı aktivatör proteini 1 (RAP1) standart Pi-bağlayıcı etki alanlarına sahip değildir, ancak Pi (3, 4, 5) P3 ile etkileşime girer ve antijenik varyasyona katılan genlerin kontrol transkripsiyonu3. Trypanosome, Maya veya memelilerin hücrelerinden IP veya Pi etkileşen proteinlerin benzeşme Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi, bilinen IP veya PI bağlama etki alanları olmadan çeşitli proteinleri tespit etti8,46, 47. Data, bu metabolitleri bağlayan ek karakterize olmayan protein alanları önerir. Bu nedenle, IPS veya ile etkileşim proteinlerin tanımlanması, bu küçük moleküller için protein-metabolit etkileşimi ve yeni hücresel düzenleyici fonksiyonların roman mekanizmaları ortaya çıkarabilir.
Burada açıklanan yöntem, IPS veya 'e bağlanan proteinleri belirlemek için Batı blo, veya kütle spektrometresi ile birleşen benzeşme Kromatografi kullanır. Bu ya da çapraz bağlı streptavidin agaroz boncuk ya da alternatif olarak, streptavidin-konjuik manyetik boncuklar üzerinden yakalanan konjuik olan biyotinlenmiş IPS veya kullanır (Şekil 1). Bu yöntem, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome içermeyen basit bir iş akışını sağlar ve proteinlerin hücre endoglikozidazları veya arıtılmış proteinleri3 'ü (Şekil 2) bağlamasını tespit etmek için uygundur. Yöntem, etiket içermeyen8,46 veya karmaşık biyolojik örneklerden IP veya PI bağlama proteinlerini tanımlamak için amino asit etiketli nicel Kütle Spektrometrisi47 ile birleştiğinde kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem birkaç Yöntemler hücresel proteinleri ile IPS veya etkileşimi incelemek için kullanılabilir bir alternatiftir ve bu metabolitlerin tripanosomlar ve belki de diğer Ökaryotlar düzenleyici işlevini anlamada yardımcı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetone</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650501</td>
			<td style="width:377px;">Ketone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td>Solvent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td>Inorganic salt</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge Avanti J6-MI</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Avanti J6-MI</td>
			<td>Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Centrifuge botles</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B1408</td>
			<td>Bottles for centrifugation of 1L of culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Control Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B000-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent - control</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td>Sugar, Added in PBS to keep cells viable</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610610</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">65305</td>
			<td>Streptavidin beads for binding to biotin ligands</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Electrophoresis running buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610732</td>
			<td style="width:377px;">25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430052</td>
			<td>To centrifuge 10 mL cultures</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Formic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">106526</td>
			<td>Acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Glycine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td>Amino acid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">HMI-9 cell culture medium</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ME110145P1</td>
			<td>Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Imperial Protein Stain</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24615</td>
			<td>Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ins(1,4,5)P3 Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">Q-B0145-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Instant&#160;Nonfat&#160;Dry&#160;Milk</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C837M64</td>
			<td>Blocking reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td>Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Lab&#160;Rotator</td>
			<td style="width:163px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1159Z92</td>
			<td>For binding assays</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-698-793</td>
			<td>Low protein binding tubes for mass spectrometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Nonidet&#160;P-40 (Igepal CA-630)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-3277</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td>Physiological buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Peroxidase substrate for chemiluminescence</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>Substrate for Western bloting detection of proteins</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B003a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B034a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-3908-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B345a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(3,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B035a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B004a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 diC8</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-4508-1mg</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(4,5)P2 PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B045a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PI(5)P PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B005a-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7170</td>
			<td>Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td>Potassium salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PtdIns PIP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Echelon</td>
			<td style="width:119px;">P-B001-1ml</td>
			<td>Affinity chromatography reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">PVDF Membrane</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1620177</td>
			<td>For Western blotting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5910 R</td>
			<td>Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">862010</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Sodium thiosulfate</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72049</td>
			<td>Chemical&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">SpeedVac Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD120-115</td>
			<td>Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">T175 flasks for cell culture&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">159910</td>
			<td>To grow 50 mL T. brucei culture</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Trypsin, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td style="width:163px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5280</td>
			<td>Trypsin for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Urea</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5128</td>
			<td>Denaturing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Vortex</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-215-418</td>
			<td>For mixing reactions</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Western blotting transfer buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610734</td>
			<td>25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">Whatman&#160;3 mm paper</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030861</td>
			<td>Paper for Wester transfer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2-mercaptoethanol (14.2 M)</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1610710</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN&#160;TGX Precast Protein Gels</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561094</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0747</td>
			<td>Protein loading buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of inositol phosphate or phosphoinositide interacting proteins by affinity chromatography coupled to western blot or mass spectrometry

İnositol Fosfatlar ve fosfoinositidler, gen ifadesi, vezikül kaçakçılığı, sinyal iletimi, metabolizma ve gelişim dahil olmak üzere Ökaryotlar içinde çeşitli hücresel süreçleri düzenler. Bu metabolitler proteinlere bağlayarak, böylece protein konformasyonu, katalitik aktivite ve/veya etkileşimleri değiştirerek bu düzenleyici aktivite gerçekleştirin. Burada açıklanan yöntem, Inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile etkileşimde bulunan proteinleri belirlemek için kütle spektrometresi veya Batı blomlamaya bağlı benzeşme Kromatografi kullanır. İnositol fosfatlar veya fosfoinositidler kimyasal olarak biotin ile etiketlenmiştir, bu da agaroz veya manyetik boncuklar için conjuated streptavidin aracılığıyla yakalanan. Proteinlerin metabolite bağlanması onların yakınlık tarafından izole edilir, sonra elüe ve kütle spektrometresi ya da Batı lekeleme tarafından tanımlanır. Yöntem hassasiyet ile protein ve metabolit etkileşimi analizini destekleyen, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome-ücretsiz ve özelleştirilebilir basit bir iş akışı vardır. Bu yaklaşım, kompleks biyolojik örneklerde veya arıtılmış proteinleri kullanarak protein-metabolit etkileşimlerini belirlemek için etiketsiz veya amino asit etiketli nicel kütle spektrometresi yöntemlerinde kullanılabilir. Bu protokol tripanosoma bruceiproteinleri analizi için optimize edilmiştir, ancak ilgili protozoon parazitleri, Maya veya memeliyen hücrelere adapte edilebilir.

RAP1 ve PI Analizi (3, 4, 5) yakınlık Kromatografi ve Batı lekesi ile P3 etkileşimi Bu örnek, RAP1 tarafından t. brucei lysate veya rekombinant t. brucei RAP1 proteini tarafından bağlama çözümlemek için bu yöntemin uygulama gösterilmektedir. Hemagglutinin (HA) ifade eden T. brucei kan akışı formları Lysates-RAP1 etiketli bağlayıcı olarak kullanıldı. RAP1 varyant yüzey glikoprotein transkripsiyonel kontrol dahil olan bir protein (VSG) genler<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry at JoVE.

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

İnositol fosfat ve fosfoinositititler ökaryotlarda gen ekspresyonu, protein ticareti, sinyal transdüksiyonu ve hücre gelişimi gibi çeşitli düzenleyici işlevlere sahip metabolitlerdir. Proteinlere bağlanarak bu düzenleyici işlevi yerine getirirler, bu nedenle protein konformasyonunu, katalitik aktiviteyi veya protein etkileşimlerini değiştirirler. İnositol fosfat veya fosfoinosititlere bağlanan proteinlerin tanımlanması, bu metabolitlerin düzenleyici işlevlerini nasıl yerine getirtiklerini anlamak için gereklidir.Bu protokol, hassas, radyoaktif olmayan, liposome ücretsiz basit bir iş akışı vardır ve ticari olarak kullanılabilir reaktifler kullanır. Bu yöntemde, biyotinylated inositol fosfat veya fosfoinositititler ile bitmiş bir kromatografi, etkileşimproteinleri izole etmek için kullanılır, daha sonra batı leke ile tanımlanır, veya kütle spektrometresi. Kan akımı formları için, HMI-9 medya orta günlük fazT T.brucei hücreleri büyümek, ile takviye 10%FBS, 37 derece Santigrat, ile 5%Karbondioksit.Hücre yoğunluğunu mililitre başına 800, 000 ve 1,6 milyon hücre arasında tutun. Hazır olduğunuzda, hücreleri 1600 kez G'de ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve yavaşça pbs-G önceden ısıtılan 10 mililetre hücreleri yıkamak için 37 santigrat derece de ısıtılan pelet yeniden askıya.Yıkamayı tamamlamak için hücreleri 1600 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin. Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Sonra pbs-G bir mililitre pelet resuspend.Bu süspansiyonu bir nokta beş mililitrelik tüpe aktarın, sonra 1600 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın, ve lysis tampon sıfır noktası beş mililitre pelet resuspend, bir nokta beş X proteaz inhibitör kokteyl ile takviye, ve hücreleri lyse buz üzerinde önceden soğutulmuş olan bir X fosfataz inhibitörü kokteyl. 1400 kez G ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede lysate santrifüj.Bu supernatant toplamak sonra, hangi çıkarılan parazit proteinleri içerir, bağlayıcı tahliller için yeni bir nokta beş mililitre tüp içine. Batı leke analizi için toplam lysate% 5 ayırın. Agarose boncuklar için konjuge inositol fosfatveya fosfoinositititler 50 mikrolitre toplamak ve bağlayıcı tampon 500 mililitre ekleyin.Bir dakika lığına 1000 kat G'de santrifüj. Supernatant atın ve boncukları dengelemek için bağlama tampon 50 mikrolitre resuspend. Konjuge olmayan boncukları kontrol etmek için kullanın ve spesifik olmayan etkileşimleri kontrol etmek için fosforilasyonsuz formlar da dahil olmak üzere farklı fosfat konfigürasyonlarına sahip boncuklar kullanın.Daha sonra, hücre lysate veya saflaştırılmış proteinler e 50 mikrolitre IP veya PI boncuk ekleyin. Boncuk hacmini toplam lysate%10 içinde tutun. Gerekirse, bağlama reaksiyonunun hacmini ayarlamak için bağlama arabelleği kullanın.50rpm dönerken, dört santigrat derece ya bir saat veya bir gecede için reaksiyon kuluçka. Bundan sonra, karışımı 1000 kez G'de santrifüj edin ve bir dakika boyunca dört derece santigrat derecede. Supernatant çıkarın ve pelet tutmak, batı leke analizi için supernatant% 5 tutmak için emin olun.Sonra yıkama tampon bir mililitre ekleyin ve dokunun veya reçin yeniden askıya almak için tüp girdap. Reaksiyonu 1000 kez G'de ve dört santigrat derecede bir dakika için santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Toplam beş yıkama için bu işlemi tekrarlayın.Bundan sonra, boncuklar için 710 milimolar 2-mercaptoetanol ile takviye 2X Laemmli tampon 50 mikrolitre ekleyin. Karıştırmak için dokunun veya girdap, ve proteinleri seyreltmek. Sonra, 95 derecede beş dakika ısı, ve bir dakika için 10,000 kez G santrifüj.Supernatant toplamak ve ya eksi 80 santigrat derece eluate dondurmak, ya da batı leke analizi devam edin. Burada sunulan yöntem, PI'lerin T.brucei lysate'den represör-aktivatör protein 1 veya rekombinant T.brucei repressor-aktivatör protein 1 proteini ile bağlanmasını analiz etmek için kullanılır. RAP1 kanonik PI bağlayıcı etki alanlarından yoksun olduğundan, bağlayıcı tahliller fosforile olmayan veya inositol halkasının farklı konumlarında fosforilasyon adedi olan pi'ler ve konjuge olmayan agarose boncuklarla gerçekleştirilir.Batı analizi RAP1'in tercihen PI(3, 4, 5)P3 boncuklara bağladığını, ancak aynı zamanda PI(4, 5)P2 boncuklarına daha az bağladığını göstermektedir. Ancak, başka bir veya agarose boncuk bağlamak vermedi. RAP1'in doğrudan PI'lere bağlanıp bağlanmadığını test etmek için, C ölümcül etiketli 6XHis rekombinant RAP1 proteini E.Coli'den homojenliğe doğru ifade edilir ve saflaştırılır.Batı lekeleme pi konsantrasyonu artan gösterir (3, 4, 5)P3, ama PI(4, 5)P2, PI (3, 4, 5)P3 boncuk ile rekombinant RAP1 etkileşimini inhibe. Reaksiyona T.brucei saflaştırılmış PIP5Pase enziminin eklenmesi pi(3, 4, 5)P3 bağlanmasını rekombinant RAP1 ile geri yükledi. Bunun nedeni serbest PI(3, 4, 5)P3'ün PIP5Pase defosforilasyondur ve bu nedenle bu metabolitin fosforilasyon paterninin RAP1 bağlamamız için gerekli olduğunu gösterir.İns'e bağlanan T.brucei proteinleri (1, 4, 5)P3 daha sonra kütle spektrometresi ile afinite kromatografisi ile tanımlanır. SDS-PAGE analizi, Ins(1, 4, 5)P3 boncuklarından elde edilen proteinlerdeki zenginleşmeyi, kontrol agarose boncuklarından elde edilen proteinlere kıyasla göstermektedir. Eluted proteinlerin kütle spektrometresi analizi 250'den fazla protein tespit edilmiştir ve bunların 84'ü Ins(1, 4, 5)P3 boncuklarla zenginleştirilmiştir.İns(1, 4, 5)P3'e bağlı proteinlerin zenginleşmesi, kontrol boncuklarıyla karşılaştırıldığında, SDS-PAGE tarafından saptanan protein sinyali ile ilişkilidir. Bu protokoldeki kritik bir adım, belirli olmayan etkileşimlerden belirli bir ayrım yapmak için uygun denetimlerin kullanılmasıdır. Konjuge olmayan agarose boncuklar ve inositol fosfat veya fosfoinosititlerle konjuge boncuklar kullanarak fosforilasyonsuz formlar da dahil olmak üzere çeşitli fosfat konfigürasyonları kullanmanızı öneririz.Bu yöntem, Trypanosoma cruzi, leishmania veya plazmodyum gibi diğer tek hücreli protozoon parazitlerine uygulanabilir. Ayrıca kolayca maya veya memeli hücreleri de dahil olmak üzere diğer organizmalar, adapte edilebilir. Bu yöntem, inositol fosfat veya fosfoinosid ile proteinlerin dinamik etkileşimlerini belirlemek için SILAC gibi kantitatif kütle spektrometresi ile birleşebilir.Ayrıca subsellüler fraksiyonu ile kombine edilebilir, Bu metabolitlere bağlamak organel özgü proteinleri tanımlamak için. Bu yaklaşım, T.brucei, memeli hücreleri ve mayainin inositol fosfat ve fosfoinositititlerine bağlanan proteinlerin belirlenmesine yardımcı olmuştur. Fosfoinosititides'e bağlanan yeni protein alan adlarının belirlenmesine yardımcı oldu.Bu metabolitlerin düzenleyici işlevini, gen ekspresyonundaki rollerini, hücre gelişimini ve ökaryotlarda sinyal iletimini anlamanın yolunu açmıştır. Bu protokoldeki bazı reaktifler zehirli veya yanıcıdır. Kişisel koruyucu ekipman kullanın ve gerektiğinde, bir duman başlık içinde çalışmak.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...