Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

نشكر الدكتور مايكل ستيرن ومختبره على رؤىهم وملاحظاتهم حول المشاريع ذات الصلة بالأتلاستين. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة [R01GM101377] والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية [R01NS102676].

1. تنقية ضريبة السلع والخدمات -DAtl-His8
<ol><li>
التعبير عن البروتين وإعداد lysate
	<ol>
<li>تحويل BL21 (DE3) E. القولونية مع بناء GST-DAtl-His8 في pGEX4-T32 وحدد على لوحة أمبيسلين.</li>
		<li>حدد تحويل واحد والتلقيح 5 مل من LB + أمبيسيلين (5 μL من 100 ملغ / مل أمبيسيلين) في أنبوب ثقافة 14 مل واحتضان في 25 درجة مئوي?...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

الطرق هنا تحدد طريقة فعالة لتنقية, إعادة تشكيل, وقياس نشاط الانصهار من التاستين المؤتلف. لضمان عوائد عالية من التاستين وظيفية يجب النظر في بعض الخطوات الحاسمة. يجب أن يتم التعبير عن الأتلاستين في درجات حرارة منخفضة (16 درجة مئوية) لتجنب التجميع، وينبغي أن يهدف المرء إلى التركيز النهائي بين 0...

انصهار الغشاء هو عملية حاسمة في العديد من التفاعلات البيولوجية. في ظل الظروف البيولوجية، والانصهار غشاء ليست عفوية ويتطلب البروتينات الانصهار المتخصصة لحفز مثل هذه التفاعلات1. يتم التوسط في الانصهار الغشاء HOMOTYPIC ER في الحيوانات من قبل الدينامين ذات الصلة GTPase atlastin2. دور Atlastin في الانصهار التجانسي أساسي لتقاطعات ثلاثية في ER الطرفية، والتي تشكل شبكة كبيرة مترابطة من الأنابيب التي تمتد في جميع أنحاء الخلية. الأتلاستين لديها مورفولوجيا مجال محفوظة تتكون من GTPase كبيرة، وثلاثة الحلزون حزمة المجال الأوسط، ومرساة غشاء رهاب الماء، وقصير سيتوبلازميك C-المحطة الطرفية الذيل3. وقد أظهرت الدراسات في المختبر مع المؤتلف Drosophila atlastin أنه عند إعادة تشكيلها إلى liposomesomes, فإنه يحافظ على خصائصه فوسوجينيك. atlastins أخرى، بما في ذلك homologs الإنسان لم تكن قادرة على تلخيص الانصهار في المختبر. نحن نوصف هنا منهجية لتنقية ضريبة السلع والخدمات وبولي هيستيدين الموسومة المؤتلف Drosophila atlastin، وإعادة تشكيلها إلى liposomes، ودمج.
دراسة انصهار الغشاء في المختبر يمثل تحديا كما البروتينات fusogenic وعادة ما يكون مرساة غشاء. من أجل دراستها، فمن الضروري إعادة تشكيلها إلى ثنائيي الطبقات الدهون نموذج. الحويصلات أحادية كبيرة (LUV) هي أداة مفيدة لدراسة تفاعلات البروتين الدهون. نحن نقدم هنا نظام لجعل LUVs من التراكيب الدهون المختلفة لإعادة تشكيل البروتين واختبارات الانصهار. إعادة تشكيل البروتينات المتكاملة في LUVs يمكن أن يتحقق عن طريق مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك، العضوية المذيبات بوساطة إعادة تشكيل، والآليات الميكانيكية، أو المنظفات ساعد إعادة تشكيل4. نحن نقدم هنا طريقة لإعادة تشكيل Drosophila atlastin في liposomesomes مسبقة عن طريق إزالة المنظفات. مزايا هذه الطريقة إعادة تشكيل تشمل الغلة إعادة تشكيل عالية والتوجه السليم للالتاستين في طبقة الدهون. بالإضافة إلى ذلك، من خلال هذه الطريقة، لا يتم تجفيف البروتين أو تعرضه للمذيبات العضوية وبالتالي الحفاظ على الهيكل والوظيفة. من بين مساوئه، قد لا يكون وجود المنظفات مثالية لجميع البروتينات والبروتيوليبوسومات النهائية قد يكون بعض المنظفات المدرجة في طبقة الدهون. ويمكن استخدام مزيد من غسيل الكلى للقضاء على المزيد من المنظفات. ومع ذلك، قد يستغرق غسيل الكلى وقتاً طويلاً، وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى فقدان نشاط البروتين.
يمكن تحديد تقييم نشاط التاستين في الانصهار عن طريق اختبار خلط الدهون كما سبق وصفه2. هنا، نحن تحديد طريقة لقياس الاتاستين بوساطة الانصهار من خلال N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (رودامين) المسمى الدهون. هذا التقييم يتطلب انصهار البروتيوليبوسومات المانحة (المسمى) والبروتيوليبوسومات (غير المسمى). ويمكن قياس الإفراج عن FRET أثناء رد الفعل كما تخفيف زوج المانحة- مقبول من "المسمى" liposomes إلى "غير المسمى" liposomes نتيجة لخلط الدهون أثناء انصهار الغشاء (الشكل 1)5. في حين أن هذا الإسراف بمثابة وكيل للانصهار غشاء، فإنه يقتصر في التمييز بين الانصهار الغشاء وhemifusion، وهي حالة حيث فقط المنشورات الخارجية مزيج. لمعالجة هذه المشكلة، بديل هو نشرة الخارجي إرواء من بنك دبي الوطني من قبل ديثيونيت. باتباع نفس المنهجية مثل بنك دبي الوطني / رودامين الدهون خلط الاختبارات، عند إرواء النشرة الخارجية أي الإفراج عن FRET بنك دبي الوطني عن طريق الانصهار سيكون بسبب نشرة الداخلية خلط8.
الاختبارات الانصهار البديل ة من قبل محتوى مائي داخلي خلط عنوان الانصهار الكامل فقط5. ومن أمثلة ذلك اختبارات التربيوم (Tb)/حمض الديفيكولينيك (DPA) واختبارات حمض الترايسولفونيك (ANTS) /p-xylene bis(pyridinium) (DPX) من بروميد البيريدينيوم. في اختبارات السل/إدارة الشؤون السياسية، يتم خلط مجموعة من الليبوسومات مع السل المغلفة ودمجها مع الليبوسومات مع مغلفة إدارة الشؤون السياسية؛ عند الانصهار، يتم زيادة الفلورسنت عن طريق نقل الطاقة الداخلية منإدارة الشؤون السياسية إلى السل داخل [Tb(DPA) 3]3- مجمع التشيليشن6. وعلى النقيض من ذلك، بالنسبة للفحوصات التي أجرتها شركة ANTS/DPX، يتم إخماد فلورون ANTS بواسطة DPX7. في حين أن هذه النظم تعالج خلط المحتوى الداخلي، مطلوب إعداد أكثر تعمقا من اليبوسومات لإزالة الكواشف غير مغلفة، فضلا عن التفاعل غير المقصود من الفلوروفوريات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

انصهار الغشاء هو عملية حاسمة في الخلية eukaryotic. البروتينات المتخصصة ضرورية لحفز الانصهار. الأتلاستين هي البروتينات المقيمة في البروتينات المقيمة في الانصهار المتجانس للER. نحن هنا بالتفصيل طريقة لتنقية الجلوتاثيون S-ترانسفيراز (GST) وبولي هيستيدين الموسومة Drosophila atlastin من قبل جولتين من الكروماتوغرافيا التقارب. دراسة تفاعلات الانصهار في المختبر يتطلب البروتينات الانصهار تنقية لإدراجها في طبقة الدهون. الليبوسومات هي أغشية نموذجية مثالية، كما يمكن تعديل تكوين الدهون وحجمها. ولهذه الغاية، فإننا نوصف طريقة إعادة تشكيل بواسطة إزالة المنظفات لDrosophila atlastin إلى يبوسومات مُسبقة. في حين تتوفر عدة طرق إعادة تشكيل, إعادة تشكيل هاته إزالة المنظفات لها العديد من المزايا التي تجعل هاته مناسبة للاللاستين والبروتينات الأخرى المماثلة. ميزة هذه الطريقة تشمل العائد إعادة تشكيل عالية والتوجه الصحيح للبروتين المعاد تشكيله. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى البروتينات الغشاء الأخرى والتطبيقات الأخرى التي تتطلب البروتيوليبوسومات. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نوصف دراسة خلط الدهون القائمة على FRET من البروتيوليبوسومات المستخدمة كقياس للانصهار الغشاء.

ويرد في الشكل 2مدى كفاءة إعادة تشكيل التاستين. تم طرح البروتيوليبوسومات المعاد تشكيلها في تدرج iohexol متقطع. وترسب البروتين غير المدمج في الطبقة السفلية (B) أو في الطبقة الوسطى (M). البروتين المعاد تشكيله سوف تطفو على الطبقة العليا (T). تم حصاد عينات من التدرج وتحليلها من قبل SDS-PAGE...

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

يتم تحفيز الانصهار الغشاء البيولوجي من قبل البروتينات الانصهار المتخصصة. قياس خصائص البروتينات الفوسوجينية يمكن أن يتحقق عن طريق اختبار خلط الدهون. نقدم طريقة لتنقية المؤتلف Drosophila atlastin، وهو البروتين الذي يتوسط الانصهار التجانسي من ER، وإعادة تشكيله إلى اليبوسومات الجاهزة، واختبار لقدرة الانصهار.

إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

بروتوكول إعادة تشكيل والانصهار مفصلة هنا هو وسيلة فعالة لدراسة البروتينات المرتبطة بالغشاء في ثنائي الدهون نموذج وخلط الدهون عن طريق البروتينات الانصهار. هنا نصف إعادة تشكيل بمساعدة المنظفات من الدوزوفيليا أطلستين المؤتلف، وهو بروتين الانصهار ER، في ليبوسومات فوسفاتيديل كولين سابقة. ثم يتم قياس الانصهار من البروتيوليبوسات أطلستين من قبل مقايسة خلط الدهون القائم على فريت.واحدة من المزايا الرئيسية لإعادة تشكيل بمساعدة المنظفات هو أن البروتين في المنظفات لا يتعرض للتجفيف أو المذيبات. كما نظهر هنا أن إعادة تشكيل اتجاه أطلستين فعال للغاية. ميزة أخرى من المقايسة الدهون الاختلاط فريت القائم هو أن liposomes لا تحتاج إلى أن تكون محملة بأي صبغة، وليس هناك حاجة لأي خطوات dialyses إضافية.لبدء هذا الإجراء، وإعداد الأسهم مزيج الدهون في الكلوروفورم، كما هو مبين في بروتوكول النص. إضافة ميكروكوري واحد لكل ملليلتر من DPPC إلى يمزج الدهون، مع التأكد من حجز ما لا يقل عن ثمانية ميكرولترات من هذا المخزون. نقل المبلغ المطلوب من الدهون يمزج في أنابيب الزجاج الصوان.ثم يجف الدهون يمزج تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين لمدة 10 دقائق تقريبا حتى لا يكون أكثر من الكلوروفورم مرئية. تجفيف الفيلم الدهون الناتجة كذلك في desiccator عن طريق كنس لمدة 30 دقيقة. بعد هذا، إضافة ما يكفي A100 مع 10٪ الجلسرين، 2-mercaptoethanol 2-ميليمولار، وEDTA واحد ميليمولار إلى فيلم الدهون لإعادة التركيز إلى 10 ملليمولار.Resuspend فيلم الدهون من خلال دوامة طفيفة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجميد الدهون رطب في النيتروجين السائل. لإذابة الدهون، والسماح للمحلول الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، ثم نقلها مرة أخرى إلى الماء لذوبان أسرع.كرر هذه الدورة تجميد ذوبان ما مجموعه 10 مرات. بعد هذا، استخدم طارد صغير لتمرير الدهون من خلال مرشحات البولي، مع حجم المسام من 100 نانومتر، 19 مرة. لتحديد تركيز الدهون الكلي للليبوسومات، إضافة أربعة ميكرولترات من الأسهم الدهون وlysosomes إلى ثلاثة ملليلتر من كوكتيل التلألؤ.قياس متوسط عدد في الدقيقة للمخزون والليبوسومات، وحساب تركيز الليبوزومات، كما هو مبين في بروتوكول النص. تخزين الليبوزومات في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. أولاً، اخلط الكمية المناسبة من العازلة، والمنظفات الإضافية، والبروتين في أنبوب 0.5 ملليلتر، كما هو موضح في بروتوكول النص.إضافة بسرعة liposomes، ودوامة فورا لمدة خمس ثوان لتجانس الخليط. احتضان رد الفعل في nutator في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. خلال هذا الحضانة، تزن بها 0.2 غرام من حبات الممتزات البوليسترين ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge.إضافة ملليلتر واحد من الميثانول إلى الأنبوب، ويخلط لمدة دقيقة واحدة لفك حبات. ثم، pirate الميثانول مع إبرة قياس 21 أو أعلى. للبدء في غسل الخرز، إضافة الماء لهم.دع الخرز يخلط بالماء لمدة خمس دقائق، ثم استلهم الماء. كرر عملية غسل المياه هذه أربع مرات. بعد ذلك، إضافة الماء لجلب الطين حبة الممتز البوليسترين إلى حجم ملليلتر واحد، مع تركيز النهائي من 0.2 غرام لكل ملليلتر.حساب كمية من حبات الممتزة البوليسترين اللازمة لامتزاز جميع المنظفات في كل عينة، كما هو مبين في بروتوكول النص. قطع تلميح ماصة لجمع الطين حبة. نقل كمية محسوبة من الطين حبة إلى أنبوب 0.5 ملليلتر، وpireate الماء.إضافة العينات إلى أنبوب يحتوي على الخرز، واحتضان في nutator في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. نقل العينات إلى أنبوب جديد يحتوي على حبات جديدة، والتأكد من ترك الخرز القديم وراء. احتضان مرة أخرى باستخدام نفس الشروط.كرر هذه العملية لنقل واحتضان الخرز مرتين. بعد ذلك، نقل العينة إلى أنبوب جديد يحتوي على الخرز الطازجة واحتضان عن طريق اللحوم بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، وإزالة العينة من الخرز والطرد المركزي في 16،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه مجاميع البروتين غير قابلة للذوبان.استرداد افرانت، وتحديد تركيز الدهون النهائي عن طريق عد التلألؤ السائل، كما هو مبين في بروتوكول النص. للبدء، وجلب المتبرع والمتقبل بروتيوليبوسسومات إلى تركيز 0.15 ملليمولار كل في A100 التي تحتوي على الجلسرين، بيتا ميركاتوباتينول، EDTA، وكلوريد المغنيسيوم. نقل كل رد فعل إلى بئر في لوحة مسطحة 96-well مناسبة لقراءة الفلوريسنس، مع التأكد من إعداد ما لا يقل عن أربعة ردود فعل، بما في ذلك ثلاثية الاحتياز وعدم السيطرة السلبية GTP.ضع اللوحة في قارئ لوحة محمّى مسبقًا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. قياس الفلورية NBD كل دقيقة لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة جي تي بي خمسة ملليمتر للحث على الانصهار.قياس الفلورية NBD كل دقيقة لمدة ساعة واحدة باستخدام نفس الإثارة والانبعاثات كما كان من قبل. بعد ذلك، إضافة خمسة ميكروليتر من 2.5٪ ن-Ddecyl بيتا-D-مالتوسايد إلى الآبار إلى حل proteoliposomes، وقياس أقصى الفلوري NBD كل دقيقة لمدة 15 دقيقة باستخدام نفس الإثارة والانبعاثات. في هذه الدراسة، يتم تنقية الدوزوفيليا أطلستين المؤتلف وإعادة تشكيلها في ليبوسومات مسبقة.يتم تحديد كفاءة إعادة تشكيل أطلستين بواسطة proteoliposomes العائمة المعاد تشكيلها في التدرج iohexol discontinuous. يتم حصاد عينات من طبقات التدرج العلوي والمتوسط والسفلي وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ. يظهر القياس الكمي للجل حسب قياس الكثافة كفاءة عالية جدًا في إعادة التشكيل مع فقدان لا يذكر ، مع وجود 96٪ من إجمالي البروتين كبروتوليوبوسومات التي تطفو على الطبقة العليا.أقل من 1٪ من البروتين غير مستردة وجدت في الطبقة الوسطى، وفقط 3٪ غير مستردة أو تجميعها وترسبات إلى الطبقة السفلية. يتم تحديد كمية اتجاه أطلستين بعد إعادة تشكيلها عن طريق مقايسات الانقسام ثرومبين. يتم تحليل العينات مع SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ وكميا حسب قياس الكثافة.يتم شق معظم البروتين المعاد تشكيله، مع 7٪ فقط محمية من البروتياز. يتم تحليل الحركية ومدى الانصهار البروتوليوبوسوم بوساطة أطلستين عن طريق مقايسات خلط الدهون. يتم تنفيذ حضانة لمدة خمس دقائق قبل تحفيز الانصهار مع GTP عند نقطة الصفر.بعد ساعة واحدة، تمت إضافة n-Dodecyl beta-D-maltoside إلى solubilize proteoliposomes والحصول على الحد الأقصى لإصدار نقل الرنين الفلوري. ويعتبر الحد الأقصى للاندماج في المدى أن يكون 11٪ من الفلورس القصوى. يتم حل الدهون في الكلوروفورم.عند إعداد خلطات الدهون، تأكد من القيام بذلك بسرعة، على غطاء محرك السيارة الكيميائية، وعلى الجليد لتجنب أي تبخر. فمن الممكن لتحليل proteoliposomes أطلستين عن طريق المجهر لتصور آثار مرساة غشاء على شكل liposome وحجم. وقد تم توسيع نطاق هذه الطريقة لدراسة البروتينات الأخرى الراسية الغشاء وكيف تتصرف في ثنائي الدهون نموذج.يستخدم هذا البروتوكول الدهون المُقَدّمة لقياس خلطات الدهون. تأكد من اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند العمل مع المواد المشعة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني، إعادة تشكيل ومقايسة من بوليهيستيديني معلم متالونزيمي للمختبرات الجامعية

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

عزل وإدماج هوائيات حصاد الضوء من دياتوم مينيغينيانا سيكلوتيلا في الدهنية مع الدهون ثايلاكويد

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick ، خطوه واحده لدمج البروتينات الغشائية في أقراص البيتيلات الحيوية لاختبارات ربط البروتين الانسيابية

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...