Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Vi takker Dr. Michael Stern og hans laboratorium for deres indsigt og feedback på atlastin relaterede projekter. Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] og National Institute of neurologiske lidelser og Stroke [R01NS102676].

1. rensning af GST-DAtl-His8
<ol><li>
Forberedelse af protein udtryk og lysat
	<ol>
<li>Transformer BL21 (DE3) E. coli med GST-datl-His8-konstruktionen i PGEX4-T32 , og vælg på en ampicillin plade.</li>
		<li>Vælg en enkelt transformerende og inokulere 5 mL LB + ampicillin (5 μL 100 mg/mL ampicillin) i et 14 mL dyrkningsglas og inkube ved 25 °C med omrystning ved 200 rpm for 6-8 h. Bemærk: På grund af utætte udtryk, anbefales det ikke at inkuere ved høje...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

Metoderne her afgrænser en effektiv metode til at rense, rekonstituere og måle fusion aktivitet af rekombinant atlastin. For at sikre høje udbytter af funktionel atlastin nogle kritiske skridt skal overvejes. Ekspression skal ske ved lave temperaturer (16 °C) for at undgå sammenlægning, og man bør tilstræbe en endelig koncentration på mellem 0,4 – 1,5 mg/mL. Meget fortyndet protein vil ikke blive rekonstitueret optimalt ved et 1:400 protein til lipid ratio. Rekonstitution effektivitet kan eventuelt analyseres ...

Membran fusion er en kritisk proces i mange biologiske reaktioner. Under biologiske forhold, membran fusion er ikke spontan og kræver specialiserede fusion proteiner til at katalysere sådanne reaktioner1. Er homotypisk membran fusion er medieret i dyr af dynamin relateret GTPase atlastin2. Atlastin rolle i homotypisk fusion er grundlæggende for tre-vejs vejkryds i perifer ER, som udgør et stort sammenkoblet netværk af tubuler, der strækker sig gennem hele cellen. Atlastins har en bevaret domæne morfologi bestående af en stor GTPase, en tre Helix Bundle midterste domæne, en hydrofobe membran anker, og en kort cytoplasmatiske C-Terminal hale3. In vitro undersøgelser med rekombinant Drosophila atlastin har vist, at når de er rekonstitueret til Liposomer, det bevarer sin fusogenic egenskaber. Andre atlastiner, herunder humane homologer har ikke været i stand til at rekapitulere fusion in vitro. Vi beskriver her en metode til rensning af en GST og poly-histidin Tagged rekombinant Drosophila atlastin, rekonstituerer det til Liposomer, og metaloid fusion.
Undersøgelse membran fusion in vitro udgør en udfordring som fusogenic proteiner normalt har et membran anker. For at studere dem, er det nødvendigt at rekonstruere dem i model lipid bilag. Store unilamellære vesikler (LUV) er et nyttigt redskab til at studere lipid protein interaktioner. Vi præsenterer her et system til at gøre LUVs af forskellige lipid kompositioner for protein rekonstitution og fusion assays. Rekonstitution af Integral proteiner til LUVs kan opnås ved en række forskellige metoder, herunder organisk opløsningsmiddel-medieret rekonstitution, mekaniske mekanismer eller opvaskemiddel assisteret rekonstitution4. Vi præsenterer her en metode til rekonstituering Drosophila atlastin i præformerede Liposomer ved fjernelse af vaskemiddel. Fordelene ved denne rekonstitutionsmetode omfatter høje rekonstitutionsudbytter og korrekt orientering af atlastin i lipid-bilaget. Desuden, gennem denne metode, proteinet er ikke tørret eller udsættes for organiske opløsningsmidler derved opretholde struktur og funktion. Blandt ulemperne kan tilstedeværelsen af vaskemidler ikke være ideelle for alle proteiner, og de endelige proteoliposomer kan have nogle indbyggede vaskemiddel i lipid-bilaget. Yderligere dialyse kan anvendes til at fjerne mere af vaskemidlet. Dialyse kan dog tage lang tid og kan derfor føre til tab af protein aktivitet.
Vurdering af atlastin fusion aktivitet kan bestemmes ved lipid blanding analyser som tidligere beskrevet2. Her afgrænser vi en metode til måling af atlastin medieret fusion gennem N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamin rhodamine-B Methylsulfonylmethan (rhodamine) mærket lipider. Denne analyse kræver fusion af donor (mærket) proteoliposomes og lønarbejdstageren (ikke-mærkede) proteoliposomes. En FRET frigivelse kan måles under reaktionen som fortynding af et donor-acceptor par fra "mærket" Liposomer til "umærkede" Liposomer som følge af lipid blanding under membran fusion (figur 1)5. Mens denne analyse tjener som en proxy for membran fusion, er den begrænset til at skelne mellem membran fusion og hemifusion, en tilstand, hvor kun de ydre foldere blandes. For at løse dette problem, et alternativ er den ydre folder dæmper af NBD af dithionit. Efter den samme metode som NBD/rhodamin lipid blanding assays, ved slukning af den ydre indlægsseddel enhver NBD FRET frigivelse ved fusion vil være på grund af indre folder blanding8.
Alternative fusion analyser af indre vandige indhold blanding adresse fuld fusion kun5. Eksempler på dette er terbium (TB)/dipicolinic Acid (DPA) analyser og Aminonaphthalen trisulfonsyre (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) bromid (DPX)-analyser. I TB/DPA assays, en pulje af Liposomer med indkapslet TB er blandet og fusioneret med Liposomer med indkapslet DPA; ved fusion øges fluorescens via intern energioverførsel fra DPA til TB inden for [TB (DPA)3]3- cheleringkompleks6. I modsætning hertil slukkes ANTS-fluorescens for ANTS/DPX-assays af DPX7. Mens disse systemer adresse indre indhold blanding, mere dybtgående forberedelse af Liposomer er nødvendig for fjernelse af ikke-indkapslede reagenser, samt utilsigtet interaktion af fluorophores.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

Membran fusion er en afgørende proces i den eukaryotiske celle. Specialiserede proteiner er nødvendige for at katalysere fusion. Atlastiner er endoplasmatiske reticulum (ER) hjemmehørende proteiner impliceret i homotypisk fusion af ER. Vi detalje her en metode til rensning af en glutathion S-transferase (GST) og poly-histidine mærkede Drosophila atlastin ved to runder af Affinity kromatografi. Undersøgelse af fusionsreaktioner in vitro kræver, at rensede fusions proteiner indsættes i et lipid-bilag. Liposomer er ideelle model membraner, som lipid sammensætning og størrelse kan justeres. Til dette formål beskriver vi en rekonstitutionsmetode ved fjernelse af vaskemiddel for Drosophila atlastin i præformerede Liposomer. Mens flere rekonstitueringsmetoder er tilgængelige, rekonstitution ved fjernelse af vaskemiddel har flere fordele, der gør det velegnet til atlastiner og andre lignende proteiner. Fordelen ved denne metode omfatter et højt rekonstitutionsudbytte og korrekt orientering af det rekonstituerede protein. Denne metode kan udvides til andre membran proteiner og til andre anvendelser, der kræver proteoliposomes. Derudover beskriver vi en FRET baseret lipid blanding assay af proteoliposomes anvendes som en måling af membran fusion.

Effektiviteten af atlastin rekonstitution er præsenteret i figur 2. Rekonstituerede proteoliposomer blev fremstillet i en diskontinuerlig gradient med Iohexol. Uindarbejdet protein blev sedimenteret i det nederste lag (B) eller i det midterste lag (M). Rekonstitueret protein ville flyde til det øverste lag (T). Prøver af gradienten blev høstet og analyseret af SDS-PAGE og Coomassie farvning. Kvantificeringen af gelen ved densitometri viser en meget høj virkningsgrad ved rekonstitution m...

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biologisk membran fusion katalyseres af specialiserede fusions proteiner. Måling af proteiner fusogenic egenskaber kan opnås ved lipid blanding assays. Vi præsenterer en metode til rensning af rekombinant Drosophila atlastin, et protein, der medierer homotypisk fusion af ER, og som danner det til præformerede Liposomer og test for fusions kapacitet.

Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Den rekonstitution og fusion protokol beskrevet her er en effektiv måde at studere membran-bundet proteiner i en model lipid tolags og lipid blanding af fusion proteiner. Her beskriver vi en vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila atlastin, en ER fusion protein, i præforme fosfatidylcholin liposomer. Fusion af atlastinproteoliposomer måles derefter ved hjælp af en FRET-baseret lipidblandingsanalyse.En af de vigtigste fordele ved rekonstituering af vaskemiddel er, at proteinet i vaskemiddel ikke udsættes for tørring eller opløsningsmidler. Vi viser også her, at rekonstitution orientering af atlastin er meget effektiv. En anden fordel ved FRET-baserede lipid-blanding assay er, at liposomer ikke behøver at være fyldt med noget farvestof, og der er ikke behov for nogen ekstra dialyse trin.For at begynde denne procedure, forberede lipid mix bestande i chloroform, som skitseret i tekstprotokollen. Tilføj en microcurie pr. milliliter DPPC til lipidblandingerne, og sørg for at reservere mindst otte mikroliter af denne bestand. Overfør den ønskede mængde lipidblandinger i glasrør med flint.Tør derefter lipidblandingerne under en blid strøm af nitrogengas i ca. 10 minutter, indtil der ikke er mere chloroform synlig. Tør den resulterende lipidfilm yderligere i en eksiccator ved støvsugning i 30 minutter. Efter dette, tilsæt nok A100 med 10% glycerol, to-millimolar 2-mercaptoethanol, og en millimolar EDTA til lipid film for at bringe koncentrationen tilbage til 10 millimolar.Resuspend lipid filmen ved vortexing let i 15 minutter ved stuetemperatur. Frys de hydrerede lipider i flydende nitrogen. At tø liposomer, lad opløsningen sidde ved stuetemperatur i 30 sekunder, derefter overføre dem tilbage til vand for hurtigere optøning.Gentag denne fryse-tø cyklus i alt 10 gange. Efter dette, bruge en mini-ekstruder til at passere lipider gennem polycarbonat filtre, med en pore størrelse på 100 nanometer, 19 gange. For at bestemme den samlede lipidkoncentration af liposomer, tilsættes fire mikroliter lipidlager og lysosomer til tre milliliter scintillation cocktail.Mål det gennemsnitlige antal pr. minut for lager og liposomer, og beregn liposomkoncentrationen, som beskrevet i tekstprotokollen. Opbevar liposomerne ved fire grader Celsius i op til en uge. Bland først den passende mængde buffer, ekstra vaskemiddel og protein i et 0,5 milliliterrør som beskrevet i tekstprotokollen.Tilsæt hurtigt liposomer, og straks vortex i fem sekunder for at homogenisere blandingen. Inkuber reaktionen i en nøddemaskine ved fire grader Celsius i en time. Under denne inkubation, afveje 0,2 gram polystyren adsorbent perler og overføre dem til en mikrocentrifuge rør.Tilføj en milliliter methanol til røret, og bland i et minut for at afgas perlerne. Derefter aspirere methanol med en 21-gauge eller højere nål. For at begynde at vaske perlerne, tilsæt vand til dem.Lad perlerne blandes med vandet i fem minutter, derefter aspirere vandet. Gentag denne vandvask proces fire gange. Derefter tilsættes vand for at bringe polystyren adsorbent perle gylle til et volumen på en milliliter, med en endelig koncentration på 0,2 gram pr. milliliter.Beregn mængden af polystyren adsorbent perler er nødvendige for at adsorbe alle vaskemiddel i hver prøve, som skitseret i tekstprotokollen. Skær en pipettespids for at opsamle perleslækagen. Den beregnede mængde perleslæmning overføres til et rør på 0,5 milliliter, og vandet aspirere.Tilsæt prøverne til røret, der indeholder perlerne, og inkuberes i en nutator ved fire grader Celsius i en time. Overfør prøverne til et frisk rør, der indeholder nye perler, og sørg for at efterlade de gamle perler bag. Inkubere igen ved hjælp af de samme betingelser.Gentag denne proces med at overføre og inkubere perlerne to gange. Herefter overføres prøven til et nyt rør med friske perler og inkuberes ved at duppe natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag fjernes prøven fra perlerne og centrifugeres ved 16, 000 gange g og fire grader Celsius i 10 minutter for at pelletere de uopløselige proteinaggregater.Gendan supernatanten, og fastgør den endelige lipidkoncentration ved væskescintillationstælling, som beskrevet i tekstprotokollen. Til at begynde, bringe donor og acceptor proteoliposomer til en koncentration på 0,15 millimolar hver i A100 indeholder glycerol, beta-mercaptoethanol, EDTA, og magnesiumchlorid. Overfør hver reaktion til en brønd i en flad 96-brønd plade egnet til fluorescens læsning, og sørg for at forberede mindst fire reaktioner, herunder en tre eksemplarer og en no-GTP negativ kontrol.Placer pladen i en forvarmet pladelæser ved 37 grader Celsius. NBD-fluorescens måles hvert minut i fem minutter. Derefter tilsættes fem millimolar GTP at fremkalde fusion.NBD-fluorescens måles hvert minut i en time med samme excitation og emission som før. Derefter tilsættes fem mikroliter på 2,5%n-Dodecyl beta-D-maltoside til brøndene for at opløse proteoliposomerne, og den maksimale NBD-fluorescens måles hvert minut i 15 minutter ved hjælp af den samme excitation og emission. I denne undersøgelse renses og rekombinant Drosophila atlastin renses og rekonstitueres til præforme liposomer.Effektiviteten af atlastinrekonstitutionen bestemmes ved flydende rekonstituerede proteoliposomer i et iohexol diskontinuerligt forløb. Prøver af de øverste, midterste og nederste gradient lag er høstet og analyseret af SDS-PAGE og Coomassie farvning. Kvantificeringen af gelen ved densitometri viser en meget høj rekonstitutionseffektivitet med ubetydelige tab, hvor 96 % af det samlede protein blev fundet som proteoliposomer, der flød til det øverste lag.Mindre end 1% af proteinet er ikke-rekonstitueret og findes i det midterste lag, og kun 3% er ikke rekonstitueret eller aggregeret og sedimenteret til det nederste lag. Atlastins orientering efter rekonstitution kvantificeres ved hjælp af trombinspaltningsanalyser. Prøver analyseres med SDS-PAGE og Coomassie farvning og kvantificeres ved densitometri.Det meste af det rekonstituerede protein kløvet, med kun 7% er beskyttet mod protease. Kinetik og omfanget af atlastin-medieret proteoliposom fusion analyseres ved lipid-blanding analyser. En inkubation på fem minutter udføres, før der fremkaldes fusion med GTP på nultidspunktet.Efter en time blev n-Dodecyl beta-D-maltoside tilføjet for at opløse proteoliposomerne og få den maksimale fluorescerende resonansoverførselsfrigivelse. Den maksimale fusion i løbet ses at være 11% af maksimal fluorescens. Lipider opløses i kloroform.Når du forbereder lipidblandinger, skal du sørge for at gøre dette hurtigt, på en kemisk hætte, og på is for at undgå enhver fordampning. Det er muligt at analysere atlastin proteoliposomer ved mikroskopi for at visualisere virkningerne af et membrananker på liposom form og størrelse. Denne metode er blevet udvidet til at studere andre membran-forankrede proteiner, og hvordan opfører sig i en model lipid tolags.Denne protokol bruger titrerede lipider til at kvantificere lipidblandinger. Sørg for at tage de nødvendige forholdsregler, når du arbejder med radioaktive materialer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstituering af nucleosomer med differentielt isotopmærkede Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobiliseret Metal affinitet kromatografi, rekonstitution og analyse af en Polyhistidine mærkede Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolere og indarbejde lys-høst antenner fra Diatom Cyclotella Meneghiniana i Liposomer med tylakoid lipider

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering af selvstændige organisering Protein mønstre på understøttede Lipid dobbeltlag

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering af cellecyklus svingninger i Microemulsions af celle-fri Xenopus æg uddrag

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, et et-trins inkorporering af membran proteiner i Biotinylerede Peptiskiver for strømlinede protein bindende assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fuldt forarbejdet rekombinant KRAS4b: isolering og karakterisering af det Farnesylerede og methylerede protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...