Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Wir danken Dr. Michael Stern und seinem Labor für ihre Erkenntnisse und Ihr Feedback zu atlastin bezogenen Projekten. Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] und dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke [R01NS102676] unterstützt.

1. Reinigung von GST-DAtl-His8
<ol><li>
Proteinexpression und Lysatzubereitung
	<ol>
<li>Transformieren Sie BL21 (DE3) E. coli mit dem GST-DAtl-His8-Konstrukt in pGEX4-T32 und wählen Sie auf einer Ampicillinplatte.</li>
		<li>Wählen Sie ein einzelnes Transformant und impfen 5 ml LB + Ampicillin (5 l von 100 mg/ml Ampicillin) in einem 14 ml Kulturrohr und inkubieren bei 25 °C mit Schütteln bei 200 U/min für 6-8 h. HINWEIS: Aufgrund der undichten Expression wi...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

Die hier beschriebenen Methoden eine effiziente Methode zur Reinigung, Rekonstituierung und Messung der Fusionsaktivität von rekombinantem Atlastin. Um eine hohe Ausbeute an funktionellem Atlastin zu gewährleisten, müssen einige kritische Schritte in Betracht gezogen werden. Die Expression von Atlastin muss bei niedrigen Temperaturen (16 °C) erfolgen, um eine Aggregation zu vermeiden, und man sollte eine Endkonzentration zwischen 0,4 und 1,5 mg/ml anstreben. Sehr verdünntes Protein wird nicht optimal mit einem Prote...

Membranfusion ist ein kritischer Prozess in vielen biologischen Reaktionen. Unter biologischen Bedingungen ist die Membranfusion nicht spontan und erfordert spezielle Fusionsproteine, um solche Reaktionen zu katalysieren1. ER homotypische Membranfusion wird bei Tieren durch die Dynamin-ähnliche GTPase Atlastin2vermittelt. Atlastins Rolle bei der homotypischen Fusion ist von grundlegender Bedeutung für Drei-Wege-Kreuzungen im peripheren ER, das ein großes miteinander verbundenes Netz von Tubuli bildet, die sich über die gesamte Zelle erstrecken. Atlastine haben eine konservierte Domänenmorphologie, bestehend aus einer großen GTPase, einer drei Helix-Bundle-Mitteldomäne, einem hydrophoben Membrananker und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminalschwanz3. In-vitro-Studien mit rekombinantem Drosophila Atlastin haben gezeigt, dass es bei rekonstituiert er zu Liposomen seine fusogene Eigenschaften beibehält. Andere Atlastine, einschließlich menschlicher Homologe, konnten die Fusion in vitro nicht rekapitulieren. Wir beschreiben hier eine Methode zur Reinigung einer GST und Poly-Histidin getaggt rekombinanten Drosophila Atlastin, Rekonstituierung zu Liposomen, und Assaying Fusion.
Das Studium der Membranfusion in vitro stellt eine Herausforderung dar, da fusogene Proteine in der Regel einen Membrananker haben. Um sie zu studieren, ist es notwendig, sie in Modelllipid-Doppelschichten zu rekonstituieren. Große unilamellare Vesikel (LUV) sind ein nützliches Werkzeug, um Lipidprotein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Wir präsentieren hier ein System zur Herstellung von LUVs aus verschiedenen Lipidzusammensetzungen für Proteinrekonstitution und Fusionstests. Die Rekonstitution von integralen Proteinen in LUVs kann durch eine Vielzahl von Methoden erreicht werden, einschließlich organischer lösungsmittelvermittelter Rekonstitution, mechanischer Mechanismen oder waschmittelunterstützter Rekonstitution4. Wir präsentieren hier eine Methode zur Rekonstituierung von Drosophila-Atlastin in vorgeformte Liposomen durch Waschmittelentfernung. Zu den Vorteilen dieser Rekonstitutionsmethode gehören hohe Rekonstitutionsausbeuten und die richtige Ausrichtung von Atlastin in der Lipid-Bilayer. Darüber hinaus wird das Protein durch diese Methode nicht getrocknet oder organischen Lösungsmitteln ausgesetzt, wodurch Struktur und Funktion erhalten bleiben. Unter seinen Nachteilen ist das Vorhandensein von Detergenzien möglicherweise nicht ideal für alle Proteine und die endgültigen Proteoliposomen können ein eingebautes Reinigungsmittel in die Lipid-Bilayer haben. Weitere Dialyse kann verwendet werden, um mehr von dem Waschmittel zu beseitigen. Die Dialyse kann jedoch lange dauern und kann daher zum Verlust der Proteinaktivität führen.
Die Beurteilung der Fusionsaktivität von Atlastin kann durch Lipid-Mischtests wie zuvor beschrieben bestimmt werden2. Hier wird ein Verfahren zur Messung der atlastin vermittelten Fusion durch N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl(NBD)/Lissamine rhodamine-B Sulfonyl (Rhodamine) mit Lipiden beschrieben. Dieser Test erfordert die Fusion von Spenderproteoliposomen und Akzeptor-Proteoliposomen. Eine FRET-Freisetzung kann während der Reaktion als Verdünnung eines Spender-Akzeptor-Paares von "markierten" Liposomen zu "unbeschrifteten" Liposomen als Folge der Lipidmischung während der Membranfusion gemessen werden (Abbildung 1)5. Während dieser Assay als Proxy für die Membranfusion dient, ist er bei der Unterscheidung zwischen Membranfusion und Hemifusion begrenzt, einem Zustand, in dem sich nur die äußeren Blättchen vermischen. Um dieses Problem zu beheben, ist eine Alternative das Abschrecken von NBD durch Dithionit. Nach der gleichen Methode wie NBD/Rhodamine Lipid-Mischtests, nach dem Abschrecken der äußeren Packungsbeilage wird jede NBD FRET Freisetzung durch Fusion durch innere Packungsbeilage Mischen8.
Alternative Fusionsassays durch innerwässriges Mischen adressieren voll fusion nur5. Beispiele hierfür sind Terbium (Tb)/Dipicolinsäure (DPA) Assays und Aminonaphthalintrisulfonsäure (ANTS)/p-Xylol bis(pyridinium) bromid (DPX) Assays. In Tb/DPA-Assays wird ein Pool von Liposomen mit gekapseltem Tb gemischt und mit Liposomen mit gekapseltem DPA verschmolzen; bei fusion wird die Fluoreszenz durch interne Energieübertragung von DPA zu Tb innerhalb des [Tb(DPA)3]3- Chelationskomplexes6erhöht. Im Gegensatz dazu wird ants Fluoreszenz bei ANTS/DPX-Assays durch DPX7abgeschreckt. Während diese Systeme die Mischung des inneren Inhalts betreffen, ist eine eingehendere Herstellung von Liposomen erforderlich, um nicht verkapselte Reagenzien sowie unbeabsichtigte Wechselwirkungen der Fluorophore zu entfernen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

Die Membranfusion ist ein entscheidender Prozess in der eukaryotischen Zelle. Spezielle Proteine sind notwendig, um die Fusion zu katalysieren. Atlastine sind endoplasmatische Retikulum (ER) gebietsansässige Proteine, die an der homotypischen Fusion des ER beteiligt sind. Wir beschreiben hier eine Methode zur Reinigung einer Glutathion-S-Transferase (GST) und Polyhistidin mit dem Tag Drosophila atlastin durch zwei Runden Affinitätschromatographie. Die Untersuchung von Fusionsreaktionen in vitro erfordert das Einsetzen gereinigter Fusionsproteine in eine Lipid-Bilayerin. Liposomen sind ideale Modellmembranen, da Lipidzusammensetzung und -größe angepasst werden können. Zu diesem Zweck beschreiben wir ein Rekonstitutionsverfahren durch Waschmittelentfernung für Drosophila Atlastin in vorgeformte Liposomen. Während mehrere Rekonstitutionsmethoden zur Verfügung stehen, hat die Rekonstitution durch Waschmittelentfernung mehrere Vorteile, die es für Atlastine und andere ähnliche Proteine geeignet machen. Der Vorteil dieser Methode ist eine hohe Rekonstitutionsausbeute und die korrekte Ausrichtung des rekonstituierten Proteins. Diese Methode kann auf andere Membranproteine und für andere Anwendungen ausgedehnt werden, die Proteoliposomen erfordern. Zusätzlich beschreiben wir einen FRET-basierten Lipid-Mischtest von Proteoliposomen, die als Messung der Membranfusion verwendet werden.

Die Effizienz der Atlastin-Rekonstitution ist in Abbildung 2dargestellt. Rekonstituierte Proteoliposomen wurden in einem diskontinuierlichen Ozorgradienten von Iohexol geflogen. Das nicht inkorporierte Protein wurde in der unteren Schicht (B) oder in der mittleren Schicht (M) sedimentiert. Rekonstituiertes Protein würde in die oberste Schicht (T) schweben. Proben des Gradienten wurden geerntet und von SDS-PAGE und Coomassie Färbung analysiert. Die Quantifizierung des Gels durch Densitometr...

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Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Die biologische Membranfusion wird durch spezialisierte Fusionsproteine katalysiert. Die Messung der fusogenen Eigenschaften von Proteinen kann durch Lipid-Mischtests erreicht werden. Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung des rekombinanten Drosophila Atlastin, ein Protein, das die homotypische Fusion des ER vermittelt, es zu vorgeformten Liposomen restituiert und auf Fusionskapazität getestet wird.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Das hier beschriebene Rekonstitutions- und Fusionsprotokoll ist eine effiziente Möglichkeit, membrangebundene Proteine in einem Modell lipid-Bilayer- und Lipid-Mixing durch Fusionsproteine zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin, einem ER-Fusionsprotein, in vorgeformte Phosphatidylcholin-Liposomen. Die Fusion von Atlastin-Proteoliposomen wird dann mit einem FRET-basierten Lipid-Mischtest gemessen.Einer der Hauptvorteile der waschmittelunterstützten Rekonstitution ist, dass das Protein in Waschmittel nicht Trocken- oder Lösungsmitteln ausgesetzt ist. Wir zeigen hier auch, dass die Rekonstitutionsorientierung von Atlastin sehr effizient ist. Ein weiterer Vorteil des FRET-basierten Lipid-Mixing-Assays ist, dass die Liposomen nicht mit einem Farbstoff beladen werden müssen, und es gibt keine Notwendigkeit für zusätzliche Dialyse-Schritte.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Lipidmischungbestände in Chloroform vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie einen Mikrocurie pro Milliliter DPPC zu den Lipidmischungen hinzu, um sicherzustellen, dass mindestens acht Mikroliter dieses Bestands reserviert werden. Übertragen Sie die gewünschte Menge der Lipidmischungen in Feuersteinglasröhren.Dann trocknen Sie das Lipid unter einem sanften Strom von Stickstoffgas für ca. 10 Minuten, bis kein Chloroform mehr sichtbar ist. Trocknen Sie den resultierenden Lipidfilm weiter in einem Trockenbau, indem Sie 30 Minuten lang saugen. Danach fügen Sie genügend A100 mit 10% Glycerin, zweimillimolarem 2-Mercaptoethanol und ein Millimolar EDTA in den Lipidfilm, um die Konzentration wieder auf 10 Millimolar zu bringen.Den Lipidfilm wieder aufbrechen, indem Sie bei Raumtemperatur 15 Minuten leicht wirbeln. Die hydratisierten Lipide in flüssigem Stickstoff einfrieren. Um die Liposomen aufzutauen, lassen Sie die Lösung 30 Sekunden bei Raumtemperatur sitzen und übertragen Sie sie dann wieder ins Wasser, um schneller aufzutauen.Wiederholen Sie diesen Frost-Tau-Zyklus insgesamt 10 Mal. Danach verwenden Sie einen Mini-Extruder, um die Lipide durch Polycarbonat-Filter zu passieren, mit einer Porengröße von 100 Nanometern, 19 Mal. Um die Gesamtfettkonzentration der Liposomen zu bestimmen, fügen Sie vier Mikroliter Lipidbestand und Lysosomen zu drei Millilitern Szintillationscocktail hinzu.Messen Sie die durchschnittlichen Anzahlen pro Minute für Bestand und Liposomen und berechnen Sie die Liposomenkonzentration, wie im Textprotokoll beschrieben. Bewahren Sie die Liposomen bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius auf. Mischen Sie zunächst die entsprechende Menge an Puffer, zusätzlichem Reinigungsmittel und Protein in einer 0,5-Milliliter-Röhre, wie im Textprotokoll beschrieben.Fügen Sie die Liposomen schnell hinzu und wirbeln Sie sofort für fünf Sekunden, um die Mischung zu homogenisieren. Inkubieren Sie die Reaktion in einem Nutator bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Während dieser Inkubation 0,2 Gramm Polystyrol adsorbierende Perlen wiegen und in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.Fügen Sie einen Milliliter Methanol in die Röhre, und mischen Sie für eine Minute, um die Perlen zu entgasen. Dann das Methanol mit einer 21-Spur oder höher Nadel ansaugen. Um mit dem Waschen der Perlen zu beginnen, fügen Sie Ihnen Wasser hinzu.Lassen Sie die Perlen mit dem Wasser für fünf Minuten mischen, dann das Wasser aspirieren. Wiederholen Sie diesen Wasserwaschvorgang viermal. Danach wasserauftragen, um die Polystyroladsorbent-Perle auf ein Volumen von einem Milliliter mit einer Endkonzentration von 0,2 Gramm pro Milliliter zu bringen.Berechnen Sie die Menge an Polystyrol adsorbent Perlen benötigt, um alle Reinigungsmittel in jeder Probe adsorbieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie eine Pipettenspitze, um die Perlenschlämme zu sammeln. Übertragen Sie die berechnete Menge an Perlenschlämme auf ein 0,5-Milliliter-Rohr und saugen Sie das Wasser an.Fügen Sie die Proben in die Röhre mit den Perlen, und in einem Nutator bei vier Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Übertragen Sie die Proben in ein frisches Rohr mit neuen Perlen, um sicherzustellen, dass die alten Perlen zurückbleiben. Unter den gleichen Bedingungen erneut inkubieren.Wiederholen Sie diesen Vorgang des Übertragens und Inkubierens der Perlen zweimal. Danach die Probe in eine neue Röhre mit frischen Perlen geben und durch Übernacht bei vier Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag die Probe bei 16 000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten aus den Perlen und der Zentrifuge entfernen, um die unlöslichen Proteinaggregate zu pellet.Stellen Sie den Überstand wieder her und bestimmen Sie die endgültige Lipidkonzentration durch Flüssigszintillationszählung, wie im Textprotokoll beschrieben. Zunächst bringen Sie die Spender- und Akzeptorproteoliposomen auf eine Konzentration von je 0,15 Millimolar in A100, die Glycerin, Beta-Mercaptoethanol, EDTA und Magnesiumchlorid enthält. Übertragen Sie jede Reaktion auf einen Brunnen in einer flachen 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist, und stellen Sie sicher, dass mindestens vier Reaktionen vorbereitet werden, einschließlich einer Dreifach- und einer No-GTP-Negativkontrolle.Legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einen vorgeheizten Plattenleser. Messen Sie die NBD-Fluoreszenz jede Minute für fünf Minuten. Fügen Sie dann fünf Millimolar GTP, um Fusion zu induzieren.Messen Sie die NBD-Fluoreszenz jede Minute für eine Stunde mit der gleichen Anregung und Emission wie zuvor. Danach fügen Sie fünf Mikroliter von 2,5%n-Dodecyl beta-D-Maltoside in die Brunnen, um die Proteoliposomen aufzulösen, und messen Sie die maximale NBD-Fluoreszenz jede Minute für 15 Minuten mit der gleichen Anregung und Emission. In dieser Studie wird rekombinantes Drosophila-Atlastin gereinigt und zu vorgeformten Liposomen rekonstituiert.Die Wirksamkeit der Atlastin-Rekonstitution wird durch schwimmende rekonstituierte Proteoliposomen in einem diskontinuierlichen Ozorgradienten bestimmt. Proben der oberen, mittleren und unteren Gradientenschichten werden von SDS-PAGE und Coomassie-Färbung geerntet und analysiert. Die Quantifizierung des Gels durch Densitometrie zeigt eine sehr hohe Effizienz der Rekonstitution mit vernachlässigbaren Verlusten, wobei 96% des gesamten Proteins als Proteoliposomen gefunden werden, die in die oberste Schicht schwammen.Weniger als 1% des Proteins ist nicht rekonstituiert und findet sich in der mittleren Schicht, und nur 3% ist unrekonstituiert oder aggregiert und in die untere Schicht sedimentiert. Die Ausrichtung von Atlastin nach Rekonstitution wird durch Thrombinspaltungstests quantifiziert. Die Proben werden mit SDS-PAGE- und Coomassie-Färbung analysiert und durch Densitometrie quantifiziert.Der größte Teil des rekonstituierten Proteins ist zerklebend, wobei nur 7% vor der Protease geschützt sind. Die Kinetik und das Ausmaß der atlastinvermittelten proteoliposomen Fusion werden durch Lipid-Mixing-Assays analysiert. Eine Inkubation von fünf Minuten wird durchgeführt, bevor die Fusion mit GTP zum Nullzeitpunkt induziert wird.Nach einer Stunde wurde n-Dodecyl beta-D-Maltoside hinzugefügt, um die Proteoliposomen zu slubilisieren und die maximale fluoreszierende Resonanztransferfreisetzung zu erhalten. Das Fusionsmaximum im Lauf wird auf 11% der maximalen Fluoreszenz gesehen. Lipide werden in Chloroform gelöst.Bei der Vorbereitung der Lipidmischungen, stellen Sie sicher, dass dies schnell zu tun, auf einer chemischen Haube, und auf Eis, um jede Verdunstung zu vermeiden. Es ist möglich, Atlastin-Proteoliposomen mittels Mikroskopie zu analysieren, um die Auswirkungen eines Membranankers auf Liposomenform und -größe zu visualisieren. Diese Methode wurde erweitert, um andere membranverankerte Proteine zu untersuchen und zu untersuchen, wie sich das Verhalten in einem Modelllipid-Doppelschicht verhalten.Dieses Protokoll verwendet titrierte Lipide, um Lipidmischungen zu quantifizieren. Achten Sie bei der Arbeit mit radioaktiven Stoffen auf die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, ein Ein-Schritt-Einbindung von Membranproteinen in biotinylierte Peptidiscs für optimierte Proteinbindungstests

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...