Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

אנו מודים לד ר מיכאל שטרן והמעבדה שלו על התובנות והמשוב שלהם על פרויקטים הקשורים באטלסטין. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית [R01GM101377] ואת המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ [R01NS102676].

1. טיהור של GT-DAtl-His8
<ol><li>
ביטוי חלבונים והכנה ליפוסט
	<ol>
<li>המרה BL21 (DE3) E. coli עם מבנה Gt-datl-His8 בpGEX4-T32 ובחר על צלחת אמפיצילין.</li>
		<li>בחר טרנספורנט בודד ו-האיחסן 5 מ ל של LB + אמפיצילין (5 μL של 100 mg/mL אמפיצילין) בצינור התרבות 14 מ ל ו-דגירה ב -25 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 6-8 h. הערה:</str...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

השיטה מתארת שיטה יעילה לטיהור, העצמה מחדש ומדידת פעילות היתוך של רקומביננטי atlastin. כדי להבטיח תשואה גבוהה של atlastin פונקציונלי כמה צעדים קריטיים יש לשקול. הביטוי של atlastin חייב להיעשות בטמפרטורות נמוכות (16 ° c) כדי למנוע צבירה ואחד צריך לכוון ריכוז סופי בין 0.4 – 1.5 mg/mL. מאוד חלבון מדלל לא יהיה מחדש...

פיוז'ן ממברנה הוא תהליך קריטי בתגובות ביולוגיות רבות. בתנאים ביולוגיים, פיוז'ן ממברנה אינה ספונטנית ודורשת היתוך מיוחדים חלבונים כדי לזרז תגובות כאלה1. היתוך ממברנה הומוטיפקס מתווכת בעלי חיים על ידי הדינמיט הקשורים GTPase atlastin2. תפקידה של אטסטין במיזוג הומוטיפקס הינו יסוד לצמתים תלת-כלאליים ב-ER היקפית, המהווה רשת מחוברים באופן גדול של tubules הנמתחים ברחבי התא. Atins יש מורפולוגיה תחום שימור המורכב GTPase גדול, שלושה צרור סליל התחום האמצעי, עוגן ממברנה הידרופובי, וזנב קצר cytoplasmic C-טרמינל3. במחקרים בעלי מבחנה עם רקומביננטי דרוסופילה אטלסטין הראו שכאשר היוו ליפוזומים, הוא שומר על המאפיינים הפוגניים שלה. לא הצליחו ללכוד. את הפיוז במבחנה אנו מתארים כאן מתודולוגיה לטיהור GT ו-פולי היסטידין מתויג רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, ממנה אותו ליפוזומים, ואומר היתוך.
לימוד פיוז'ן ממברנה בחוץ גופית מציג אתגר כמו חלבונים fusogenic בדרך כלל יש עוגן קרום. כדי ללמוד אותם, יש צורך ליצור מחדש אותם למודל השומנים bilayers. Unilamellar שלפוחיות גדולות (אהובה) הם כלי שימושי כדי ללמוד אינטראקציות חלבון השומנים. אנו מציגים כאן מערכת כדי להפוך LUVs של קומפוזיציות השומנים שונים לחידוש חלבון והיתוך assays. החוקה של חלבונים אינטגרליים לתוך LUVs יכול להיות מושגת על ידי מגוון רחב של שיטות כולל, אורגני הממס בתיווך מחדש, מנגנונים מכניים, או חומרי ניקוי סיוע החוקה4. אנו מציגים כאן שיטה ליצור מחדש את דרוסופילה אטלסטין ליפוזומים מראש על ידי הסרת חומרי ניקוי. היתרונות של שיטת החוקה הזאת כוללים תשואות גבוהה לחוקה הכיוון הנכון של atlastin ב bilayer השומנים. בנוסף, באמצעות שיטה זו, החלבון אינו מיובש או חשוף ממיסים אורגניים ובכך שמירה על מבנה ותפקוד. בין החסרונות שלה, הנוכחות של דטרגנטים לא יכול להיות אידיאלי עבור כל החלבונים ואת פרוטאוליזומים הסופי יכול להיות כמה אבקת כביסה שולבו bilayer השומנים. דיאליזה נוספת ניתן להשתמש כדי לחסל יותר של כביסה. עם זאת, דיאליזה עשויה להימשך זמן רב ולכן יכול להוביל לאובדן פעילות החלבון.
הערכת פעילות היתוך של atlastin יכול להיקבע על ידי ערבוב שומנים בדם כפי שמתואר בעבר2. כאן, אנו להתוות שיטה עבור מדידת atlastin בתיווך פיוז'ן דרך N-(7-ניטרובנץ-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B סולוניל (rhodamine) התווית שומנים. הסדר הזה דורש היתוך של התורם (מתויג) פרוטאוליפוזומים וקבלה (ללא תווית) פרוטאוליפוזומים. ניתן למדוד את השחרור במהלך התגובה כדילול של תורם – קבלה של זוג "שכותרתו" ליפוזומים "ליפוזומים" ללא תווית כתוצאה של ערבוב שומנים במהלך היתוך ממברנה (איור 1)5. בעוד שהוא משמש כפרוקסי לפיוז ממברנה, הוא מוגבל בהבחנה בין פיוז'ן ממברנה המיפיוז, מדינה שבה רק את העלונים החיצוניים לערבב. כדי לטפל בבעיה זו, חלופה היא מקופת העלעל החיצוני של NBD על ידי dithionite. בעקבות אותה מתודולוגיה כמו NBD/rhodamine ערבוב השומנים, לאחר העלעל העלון החיצוני כל שחרור הסריג NBD על ידי היתוך יהיה עקב העלון הפנימי ערבוב8.
היתוך אלטרנטיבי חלופי על ידי תוכן פנימי מימית ערבוב כתובת היתוך מלא רק5. דוגמאות לכך הם טרביום (Tb)/dipicolinic חומצה (dpa) בחני ו חומצה trisulfonic (נמלים)/pt-קסילן bis (pyridinium) ברומיד (dpa) בחני. בשחפת/DPA assays, בריכה של ליפוזומים עם שחפת מתחת למים מעורבבים והתמזגו עם ליפוזומים עם DPA שבאנקפסולציה; עם היתוך, הקרינה הפלואורסצנטית מוגברת באמצעות העברת אנרגיה פנימית מ DPA ל-Tb בתוך [Tb (DPA)3] קומפלקס3- כלציה6. לעומת זאת, עבור נמלים/DPX assays אומר, הנמלים פלואורסצנטי מוקף על ידי DPX7. בעוד מערכות אלה כתובת תוכן פנימי ערבוב, יותר מעמיק הכנה של ליפוזומים נדרש להסרת ריאגנטים שאינם מסופף, כמו גם אינטראקציה לא מכוונת של fluorophores.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

פיוז'ן ממברנה הוא תהליך מכריע בתא איקריוטית. חלבונים מיוחדים נחוצים כדי לזרז את הפיוז. האצנים הם רשתית פלזמית (אר) חלבונים תושב מעורבים במיזוג הומוטיפקס של ER. אנו מפרטים כאן שיטה לטיהור של גלוטתיון S-transferase (GT) ו פולי היסטידין מתויג דרוסופילה אטלסטין על ידי שני סיבובים של כרומטוגרפיה של זיקה. לימוד תגובות היתוך בחוץ גופית דורש חלבונים היתוך מטוהרים להיות מוכנס bilayer ליפיד. ליפוזומים הם ממברנות מודל אידיאלי, כמו הרכב השומנים וגודל ניתן לכוונן. למטרה זו, אנו מתארים שיטת החוקה על ידי הסרת חומרי ניקוי עבור Drosophila ילה atlastin לתוך ליפוזומים טרום. בעוד כמה שיטות מחדש החוקה זמינים, החוקה על ידי הסרת חומרי ניקוי יש מספר יתרונות הופכים אותו מתאים עבור atins וחלבונים דומים אחרים. היתרון של שיטה זו כולל תשואה גבוהה לחוקה וכיוון נכון של חלבון מחדש. שיטה זו ניתן להרחיב חלבונים ממברנה אחרים עבור יישומים אחרים הדורשים פרוטאוליפוזומים. בנוסף, אנו מתארים שומנים בהתבסס על השומנים מבוסס ערבוב של פרוטאוליפוזומים המשמשים כמדידה של היתוך הממברנה.

היעילות של החוקה החוזרת מוצגת באיור 2. . במעבר הדרגתי מקוטע חלבון בלתי משולב היה מימדי בשכבה התחתונה (ב) או בשכבה האמצעית (M). חלבון מחדש צף לשכבה העליונה (T). דגימות של מעבר הצבע נקצרו ונותחו על ידי כתמים של מערכות SDS-PAGE ו-Coomassie הקוונפיקציה של הג על ידי densi, try מראה יעילות גבוהה מאו...

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

היתוך ממברנה ביולוגי מזרז על ידי חלבונים היתוך מיוחדים. מדידת תכונות fusogenic של חלבונים ניתן להשיג על ידי ערבוב שומנים בעלי. אנו מציגים שיטה לטיהור רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, חלבון המרפא הומוטיפקס של המיון, ממנה את המבנה ליפוזומים מראש ובדיקת קיבולת היתוך.

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

פרוטוקול ההיתוך וההיתוך המפורט כאן הוא דרך יעילה לחקור חלבונים הקשורים לממברנה במודל של תערובת שומנים ושומנים על ידי חלבוני היתוך. כאן אנו מתארים התחדשות בסיוע חומר ניקוי של אטסטין דרוסופילה רקומביננטי, חלבון היתוך ER, לתוך ליפוזומים phosphatidylcholine מעוצב מראש. היתוך של פרוטאוליפוזום אטסטין נמדד לאחר מכן על ידי מוצף ערבוב שומנים מבוססי FRET.אחד היתרונות העיקריים של התחדשות בסיוע חומר ניקוי הוא החלבון בחומרי ניקוי אינו חשוף לייבוש או ממסים. אנו גם מראים כאן כי אוריינטציה מחדש של אטסטין היא יעילה מאוד. יתרון נוסף של ההטעיה על ערבוב שומנים מבוסס FRET הוא שאין צורך להטעין את ליפוזומים בצבע כלשהו, ואין צורך בצעדי דיאליזה נוספים.כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מניות תערובת השומנים בכלורופורם, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף microcurie אחד למיליליטר של DPPC לתערובות השומנים, הקפד לשמור לפחות שמונה microliters של מלאי זה. מעבירים את הכמות הרצויה של תערובת השומנים לצינורות זכוכית צור.ואז לייבש את השומנים מתערבב תחת זרם עדין של גז חנקן במשך כ 10 דקות עד לא יותר כלורופורם גלוי. יבש את הסרט השומנים וכתוצאה מכך עוד יותר במייבש על ידי שאיבת אבק במשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו מספיק A100 עם 10%גליצרול, שני מילימולרים 2-mercaptoethanol, ו EDTA מילימולר אחד לסרט השומנים כדי להחזיר את הריכוז ל 10 מילימולר.תדליק מחדש את סרט השומנים על ידי מערבולת קלה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להקפיא את השומנים hydrated בחנקן נוזלי. כדי להפשיר את ליפוזומים, תן תספורת לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות, ולאחר מכן להעביר אותם בחזרה למים להפשרה מהירה יותר.חזור על מחזור הפשרת הקפאה זה בסך הכל 10 פעמים. לאחר מכן, להשתמש mini-extruder להעביר את השומנים דרך מסנני פוליקרבונט, עם גודל נקבובית של 100 ננומטר, 19 פעמים. כדי לקבוע את ריכוז השומנים הכולל של ליפוזומים, להוסיף ארבעה microliters של מלאי השומנים ו lysosomes לשלושה מיליליטר של קוקטייל scintillation.למדוד את הספירות הממוצעות לדקה עבור מלאי ליפוזומים, ולחשב את ריכוז ליפוזום, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחסן את ליפוזומים בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. ראשית, מערבבים את הכמות המתאימה של חיץ, חומר ניקוי נוסף וחלבון בצינור של 0.5 מיליליטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.מוסיפים במהירות את ליפוזומים, ומיד מערבולת במשך חמש שניות כדי הומוגניזציה של התערובת. חממה התגובה במטורף בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. במהלך הדגירה הזו, שוקלים 0.2 גרם של בחנורי פוליסטירן ומעבירים אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה.מוסיפים מיליליטר אחד של מתנול לצינור, ומערבבים במשך דקה אחת כדי לדגום את חרוזים. לאחר מכן, שאף את מתנול עם מחט 21-מד או גבוה יותר. כדי להתחיל לשטוף את החמרוזים, מוסיפים להם מים.תן את חרוזים לערבב עם המים במשך חמש דקות, ולאחר מכן שאף את המים. חזור על תהליך שטיפת מים זה ארבע פעמים. לאחר מכן, להוסיף מים כדי להביא את תרחיף תריס פדירה פוליסטירן לנפח של מיליליטר אחד, עם ריכוז סופי של 0.2 גרם למיליליטר.חשב את כמות חרוזי הפוליסטירן הדרושים כדי לספוג את כל חומר הניקוי בכל דגימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חותכים טיפ פיפטה כדי לאסוף את תרחיף חרוזים. מעבירים את הכמות המחושבת של תרחיף חרוזים לצינור 0.5 מיליליטר, ושואפים את המים.מוסיפים את הדגימות לצינור המכיל את חרוזים, ודגירה במטורף בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. מעבירים את הדגימות לצינור טרי המכיל חרוזים חדשים, ומוודאים להשאיר את חרוזים ישנים מאחור. דגירה שוב באמצעות אותם תנאים.חזור על תהליך זה של העברה ודגירה של חרוזים פעמיים. לאחר מכן, מעבירים את הדגימה לצינור חדש המכיל חרוזים טריים ודגירה על ידי אגוזים לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את המדגם מן חרוזים צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה אגרגטים חלבון מסיסים.לשחזר את supernatant, ולקבוע את ריכוז השומנים הסופי על ידי ספירת נצנוץ נוזלי, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, להביא את התורם ואת proteoliposomes מקבל לריכוז של 0.15 מילימולר כל אחד ב A100 המכיל גליצרול, בטא-mercaptoethanol, EDTA, ומגנזיום כלורי. מעבירים כל תגובה ל הבאר בצלחת שטוחה של 96 באר המתאימה לקריאת פלואורסצנטיות, ומוודאים להכין לפחות ארבע תגובות, כולל שליש ושליטה שלילית ללא GTP.מניחים את הצלחת לתוך קורא צלחת שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. למדוד את הפלואורסצנטיות NBD כל דקה במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף GTP חמישה מילימולר כדי לגרום היתוך.למדוד את הפלואורסצנטיות NBD כל דקה במשך שעה אחת באמצעות אותה העירור וההפחתה כמו קודם. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של 2.5%n-Dodecyl בטא-D-maltoside ל הבארות כדי להמיס את proteoliposomes, ולמדוד את הפלואורסצנטיות NBD המרבי כל דקה במשך 15 דקות באמצעות אותה קריאה ו פליטה. במחקר זה, אטלסטין Drosophila רקומביננטי מטוהר ו מחדש לתוך ליפוזומים מעוצבים מראש.היעילות של התחדשות אטסטין נקבעת על ידי פרוטאוליפוסמים צף מחדש ב iohexol הדרגתי לא רציפה. דגימות של השכבות ההדרגתיות העליונות, האמצעיות והתחתונות נקצרות ומנותחות על-ידי כתמי SDS-PAGE ו- Coomassie. כימות הג'ל על ידי densitometry מראה יעילות גבוהה מאוד של התחדשות עם הפסדים זניחים, עם 96% מכלל החלבון נמצא פרוטאוליפוזום שצף לשכבה העליונה.פחות מ-1% מהחלבון אינו מפוסס ומימצאות בשכבה האמצעית, ורק 3% אינו מצטבר או מצטבר ומותן לשכבה התחתונה. האוריינטציה של אטסטין לאחר התחדשות הוא כימת על ידי מחשוף טרומבין מחשוף. דגימות מנותחות עם כתמי SDS-PAGE וקומאסי וממותמות על ידי צפיפות.רוב החלבון המשוחזר הוא מחשוף, עם רק 7% להיות מוגן מפני פרוטאז. הקינטיקה והיקף ההיתוך הפרוטאוליפוזום בתתיווך אטלסטין מנותחים על ידי תיסים מערבבים שומנים. דגירה של חמש דקות מתבצעת לפני גרימת היתוך עם GTP בנקודת הזמן אפס.לאחר שעה אחת, n-Dodecyl בטא-D-maltoside התווסף כדי לבודד את proteoliposomes ולקבל את שחרור העברת תהודה פלואורסצנטי מקסימלית. מקסימום ההיתוך בהפעלה נראה 11% של פלואורסצנטיות מקסימלית. שומנים מומסים בכלורופורם.בעת הכנת השומנים מתערבב, הקפד לעשות זאת במהירות, על מכסה המנוע הכימי, ועל הקרח, כדי למנוע כל אידוי. ניתן לנתח פרוטאוליפוזום אטלסטין על ידי מיקרוסקופיה כדי לדמיין את ההשפעות של עוגן קרום על צורה liposome וגודל. שיטה זו הורחבה כדי ללמוד חלבונים אחרים מעוגן קרום וכיצד להתנהג bilayer השומנים מודל.פרוטוקול זה משתמש שומנים titrated לכמת את תערובות השומנים. הקפד לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים בעת עבודה עם חומרים רדיואקטיביים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...