Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
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हम अपनी अंतर्दृष्टि और atlastin संबंधित परियोजनाओं पर प्रतिक्रिया के लिए डॉ माइकल स्टर्न और उनकी प्रयोगशाला धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान [R01GM101377] और राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल विकार और स्ट्रोक संस्थान [R01NS102676] द्वारा समर्थित किया गया था।

1. जीएसटी-DAtl-His8 का शुद्धिकरण
<ol><li>
प्रोटीन अभिव्यक्ति और lysate तैयारी
	<ol>
<li>PGEX4-T32 में GST-DAtl-His8 निर्माण के साथ BL21 (DE3) ई. कोलाई रूपांतरण करें और एक एम्पिसिलिन प्लेट पर चयन करें।</li>
		<li>एक एकल परिवर्तक और टीका 5 ए...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

यहाँ तरीकों शुद्ध करने के लिए एक कुशल विधि वर्णन, पुनर्गठन, और रिकॉमबिनेंट atlastin के संलयन गतिविधि को मापने. कार्यात्मक atlastin की उच्च पैदावार सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम पर विचार किया जाना चाहि?...

झिल्ली संलयन कई जैविक प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। जैविक परिस्थितियों में, झिल्ली संलयन सहज नहीं है और इस तरह की प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करने के लिए विशेष संलयन प्रोटीन की आवश्यकताहोती है 1। ईआर होमोटाइपिक झिल्ली संलयन डाइनामिन संबंधित जी.टी.पी.एस. एटलास्टिन2द्वारा जानवरों में मध्यस्थता की जाती है। समरूपीय संलयन में Atlastin की भूमिका परिधीय ईआर में तीन तरह के जंक्शनों के लिए मौलिक है, जो ट्यूबल के एक बड़े परस्पर नेटवर्क का गठन करता है जो पूरे सेल में विस्तार करता है। Atlastins एक संरक्षित डोमेन आकृति विज्ञान एक बड़े GTPase, एक तीन कुंडलिनी बंडल मध्य डोमेन, एक हाइड्रोफोबिक झिल्ली लंगर, और एक छोटी साइटोप्लाज्मिक सी-टर्मिनल पूंछ3से मिलकर है। रिकॉमबिनेंट Drosophila atlastin के साथ इन विट्रो अध्ययन में पता चला है कि जब liposomes के लिए पुनर्गठन, यह अपने fusogenic गुणों का कहना है. मानव समलॉग सहित अन्य atlastins इन विट्रो में संलयन recapitulate करने में सक्षम नहीं किया गया है. हम यहाँ एक जीएसटी और पॉली-हिस्टिडाइन टैग रिकॉमबिनेंट Drosophila atlastin के लिए एक पद्धति का वर्णन, यह liposomes के लिए पुनर्गठन, और फ्यूजन पराजय.
इन विट्रो में झिल्ली संलयन का अध्ययन एक चुनौती प्रस्तुत करता है क्योंकि फ्यूजोजेनिक प्रोटीन में आमतौर पर एक झिल्ली लंगर होता है। उन्हें अध्ययन करने के लिए, उन्हें मॉडल लिपिड बाइलेयर में पुनर्गठन करना आवश्यक है। बड़े unilamellar vesicles (LUV) लिपिड प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं। हम यहाँ प्रोटीन पुनर्गठन और संलयन परख के लिए विभिन्न लिपिड रचनाओं के LUVs बनाने के लिए एक प्रणाली मौजूद है. LUVs में अभिन्न प्रोटीन का पुनर्गठन सहित तरीकों की एक किस्म द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, कार्बनिक विलायक मध्यस्थता पुनर्गठन, यांत्रिक तंत्र, या डिटर्जेंट सहायता प्रदान पुनर्गठन4. हम यहाँ डिटर्जेंट हटाने से preformed liposomes में Drosophila atlastin के पुनर्गठन के लिए एक विधि मौजूद है. इस पुनर्गठन विधि के लाभ उच्च पुनर्गठन पैदावार और लिपिड bilayer में atlastin के उचित अभिविन्यास शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, इस विधि के माध्यम से, प्रोटीन सूखे या कार्बनिक सॉल्वैंट्स के संपर्क में नहीं है जिससे संरचना और समारोह को बनाए रखने. इसके नुकसान के अलावा, डिटर्जेंट की उपस्थिति सभी प्रोटीन के लिए आदर्श नहीं हो सकता है और अंतिम proteoliposomes लिपिड bilayer में कुछ शामिल डिटर्जेंट हो सकता है. इसके अलावा डायलिसिस डिटर्जेंट के अधिक को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, डायलिसिस एक लंबा समय लग सकता है और इसलिए प्रोटीन गतिविधि की हानि हो सकती है।
Atlastin के संलयन गतिविधि का आकलन लिपिड मिश्रण assays द्वारा निर्धारित किया जा सकता है के रूप में पहले वर्णित2. यहाँ, हम N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lisamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) लेबल लिपिड के माध्यम से atlastin मध्यस्थता संलयन को मापने के लिए एक विधि वर्णन. इस परख दाता के संलयन की आवश्यकता है (लेबल) proteoliposomes और स्वीकारकर्ता (unlabeled) proteoliposomes. एक FRET रिलीज एक दाता-स्वीकारक जोड़ी के कमजोर पड़ने के रूप में मापा जा सकता है "लेबल" liposomes करने के लिए "unlabeled" liposomes झिल्ली संलयन के दौरान लिपिड मिश्रण का एक परिणाम के रूप में (चित्र 1)5. हालांकि इस परख झिल्ली संलयन के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है, यह झिल्ली संलयन और अर्धभ्रम, एक राज्य है जहां केवल बाहरी पत्रक मिश्रण के बीच भेद में सीमित है. इस मुद्दे को हल करने के लिए, एक विकल्प dithionite द्वारा NBD के बाहरी पत्रक शमन है. NBD/rhodamine लिपिड मिश्रण परख के रूप में एक ही पद्धति का पालन, बाहरी पत्रक किसी भी NBD FRET संलयन द्वारा जारी बुझाने पर आंतरिक पत्रक मिश्रण8के कारण होगा.
आंतरिक जलीय सामग्री मिश्रण पते पूर्ण संलयन केवल5द्वारा वैकल्पिक संलयन assays . इसके उदाहरण हैं- टेरबियम (टीबी)/डिपिकॉलिनिक एसिड (डीपीए) परख और अमीनाफ्थैलीन ट्राइसल्फोनिक एसिड (एएनटीएस)/पी-xylene bis (pyridinium) ब्रोमाइड (DPX) परख। Tb/DPA assays में, encapsulated Tb के साथ liposomes का एक पूल मिश्रित कर रहे हैं और encapsulated DPA के साथ liposomes के साथ जुड़े; संलयन पर, [Tb (DPA)3]3- chelation जटिल6के भीतर डीपीए से टीबी करने के लिए आंतरिक ऊर्जा हस्तांतरण के माध्यम से फ्लोरोसेंट बढ़ जाता है। इसके विपरीत, ANTS/DPX assays के लिए, ANTS फ्लोरोसेंट DPX7द्वारा बुझा दिया जाता है. जबकि इन प्रणालियों आंतरिक सामग्री मिश्रण पता है, liposomes की अधिक गहराई से तैयारी गैर-लम्बोद अभिकर्मकों को हटाने के लिए आवश्यक है, साथ ही fluorores के अनपेक्षित बातचीत.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

झिल्ली संलयन यूकैरियोटिक कोशिका में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। संलयन को उत्प्रेरित करने के लिए विशेष प्रोटीन आवश्यक हैं। ए्टलैस्टिन एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) निवासी प्रोटीन हैं जो ईआर के होमोटाइपिक संलयन में फंसाया जाता है। हम यहाँ एक glutathione एस-ट्रांसफरेस (जीएसटी) और पॉली-हिस्टिडाइन को शुद्ध करने के लिए एक विधि का विस्तार करते हैं, जिसमें एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी के दो दौर द्वारा ड्रोसोफिला एटलास्टिन टैग किया गया है। इन विट्रो में संलयन प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए शुद्ध संलयन प्रोटीन को लिपिड द्विपरत में डाला जाना आवश्यक है। Liposomes आदर्श मॉडल झिल्ली हैं, के रूप में लिपिड संरचना और आकार समायोजित किया जा सकता है. यह अंत करने के लिए, हम drosophila atlastin के लिए preformed liposomes में डिटर्जेंट हटाने के द्वारा एक पुनर्गठन विधि का वर्णन. जबकि कई पुनर्गठन के तरीके उपलब्ध हैं, डिटर्जेंट हटाने के द्वारा पुनर्गठन कई फायदे हैं जो इसे atlastins और अन्य समान प्रोटीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं। इस विधि का लाभ एक उच्च पुनर्गठन उपज और पुनर्गठन प्रोटीन का सही अभिविन्यास भी शामिल है. इस विधि अन्य झिल्ली प्रोटीन के लिए और अन्य अनुप्रयोगों है कि proteoliposomes की आवश्यकता के लिए बढ़ाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, हम झिल्ली संलयन के माप के रूप में इस्तेमाल किया प्रोटीओलिपोसोम के एक FRET आधारित लिपिड मिश्रण परख का वर्णन.

अलैस्टिन पुनर्गठन की दक्षता चित्र 2में प्रस्तुत की गई है। एक iohexol discontinuous ढाल में पुनर्गठित प्रोटीओलिपोसोम जारी किए गए थे। अनिगमित प्रोटीन नीचे की परत (बी) या मध्य परत (एम) में तलछट किया गया था। पु...

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Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

जैविक झिल्ली संलयन विशेष संलयन प्रोटीन द्वारा उत्प्रेरित है। प्रोटीन के fusogenic गुणों को मापने लिपिड मिश्रण परख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हम पुनः संयोजक Drosophila atlastin, एक प्रोटीन है कि ईआर के homotypic संलयन मध्यस्थता, यह preformed liposomes के लिए पुनर्गठन, और संलयन क्षमता के लिए परीक्षण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.

लिपिड-मिश्रण परख के लिए Liposomes में रिकॉमबिनेंट Drosophila Atlastin के डिटर्जेंट की मदद से पुनर्गठन

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

यहां विस्तृत पुनर्गठन और संलयन प्रोटोकॉल फ्यूजन प्रोटीन द्वारा एक मॉडल लिपिड बाइलेयर और लिपिड मिश्रण में झिल्ली-बाध्य प्रोटीन का अध्ययन करने का एक कुशल तरीका है। यहां हम एक डिटर्जेंट-असिस्टेड रिकॉम्बिनेंट ड्रोसोफिला एटलास्टिन, एक ईआर फ्यूजन प्रोटीन, प्रीफॉर्मेड फॉस्फेटिलकोलिन लिपोसोम्स में एक डिटर्जेंट-असिस्टेड रिसेप्स्ट्रेयशन का वर्णन करते हैं । एटलास्टिन प्रोटेओलिपोसोम का फ्यूजन तब एक FRET-आधारित लिपिड-मिश्रण परख द्वारा मापा जाता है।डिटर्जेंट-असिस्टेड रिएग्शन के प्रमुख फायदों में से एक यह है कि डिटर्जेंट में प्रोटीन सूखने या सॉल्वैंट्स के संपर्क में नहीं आता है । हम यहां यह भी दिखाते हैं कि एटास्टिन का पुनर्गठन अभिविन्यास बहुत कुशल है । FRET आधारित लिपिड मिश्रण परख का एक और लाभ यह है कि लिपोसोम्स को किसी भी डाई के साथ लोड करने की आवश्यकता नहीं है, और किसी भी अतिरिक्त डायलिस चरणों की कोई आवश्यकता नहीं है।इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, क्लोरोफॉर्म में लिपिड मिक्स स्टॉक तैयार करें, जैसा कि टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित है। लिपिड घोला जा सकता है करने के लिए DPPC के मिलीलीटर प्रति एक microcurie जोड़ें, इस शेयर के कम से कम आठ माइक्रोलीटर आरक्षित करने के लिए सुनिश्चित कर रही है । लिपिड की वांछित मात्रा को चकमक ग्लास ट्यूबों में स्थानांतरित करें।फिर लिपिड को लगभग 10 मिनट तक नाइट्रोजन गैस की कोमल धारा के नीचे घोला जा सकता है जब तक कि कोई और क्लोरोफॉर्म दिखाई न दे। 30 मिनट के लिए वैक्यूमिंग द्वारा एक desiccator में आगे जिसके परिणामस्वरूप लिपिड फिल्म सूखी । इसके बाद, एकाग्रता को 10 मिलीमोलर में वापस लाने के लिए लिपिड फिल्म में 10% ग्लाइसेरोल, दो-मिलीमोलर 2-मर्केप्टोथेनॉल, और एक-मिलीमोलर ईडीटीए के साथ पर्याप्त A100 जोड़ें।कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हल्के से भंवर द्वारा लिपिड फिल्म को फिर से खर्च करें। तरल नाइट्रोजन में हाइड्रेटेड लिपिड को फ्रीज करें। लिपोसोम्स को पिघलाने के लिए, समाधान को 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें, फिर उन्हें तेजी से विगलन के लिए पानी में वापस स्थानांतरित करें।इस फ्रीज-गल चक्र को कुल 10 बार दोहराएं। इसके बाद, पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से लिपिड को पास करने के लिए एक मिनी-एक्सट्रूडर का उपयोग करें, जिसमें 100 नैनोमीटर का पोर आकार 19 गुना है। लिपोसोम्स की कुल लिपिड एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, लिपिड स्टॉक के चार माइक्रोलीटर जोड़ें और तीन मिलीलीटर प्रस्फुटित कॉकटेल में लाइसोसोम्स जोड़ें।स्टॉक और लिपोसोम्स के लिए प्रति मिनट औसत गिनती को मापें, और पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित लिपोसोम एकाग्रता की गणना करें। एक सप्ताह तक के लिए लिपोसोम्स को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सबसे पहले, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में बफर, अतिरिक्त डिटर्जेंट और प्रोटीन की उचित मात्रा मिलाएं।तेजी से लिपोसोम्स जोड़ें, और मिश्रण को समरूप बनाने के लिए तुरंत पांच सेकंड के लिए भंवर। एक नटेटर में प्रतिक्रिया को एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इस इनक्यूबेशन के दौरान, 0.2 ग्राम पॉलीस्टीरिन एसोर्बेंट मोतियों का वजन करें और उन्हें एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।ट्यूब में मेथनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें, और मोतियों को डग करने के लिए एक मिनट के लिए मिलाएं। फिर, 21 गेज या उच्च सुई के साथ मेथनॉल को एस्पिरेट करें। मोतियों को धोना शुरू करने के लिए, उनमें पानी डालें।मोतियों को पांच मिनट के लिए पानी के साथ मिलाएं, फिर पानी को एस्पिरेट करें। इस पानी को धोने की प्रक्रिया को चार बार दोहराएं। इसके बाद, पॉलीस्टीरिन एसोर्बेंट मनका घोल को एक मिलीलीटर की मात्रा में लाने के लिए पानी जोड़ें, जिसमें 0.2 ग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता है।पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रत्येक नमूने में सभी डिटर्जेंट को सोखने के लिए आवश्यक पॉलीस्टीरिन एसोर्बेंट मोतियों की मात्रा की गणना करें। मनका घोल इकट्ठा करने के लिए एक पिपेट टिप काटें। मनका घोल की गणना की गई मात्रा को 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और पानी को एस्पिरेट करें।मोतियों वाली ट्यूब में नमूनों को जोड़ें, और एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक नटेटर में इनक्यूबेट करें। नमूनों को नए मोतियों वाली एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिससे पुराने मोतियों को पीछे छोड़ना सुनिश्चित हो। एक ही शर्तों का उपयोग कर फिर से इनक्यूबेट।मोतियों को दो बार स्थानांतरित करने और इनक्यूबेटिंग करने की इस प्रक्रिया को दोहराएं। इसके बाद, नमूना को ताजा मोतियों वाली एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर नीरस करके इनक्यूबेट करें। अगले दिन, अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय को गोली मारने के लिए 16, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर मोतियों और अपकेंद्रित्र से नमूना निकालें।सुपरनेट को ठीक करें, और पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित तरल प्रस्फुटन गिनती द्वारा अंतिम लिपिड एकाग्रता निर्धारित करें। शुरू करने के लिए, ग्लिसेरोल, बीटा-मर्केप्टोथेन, ईडीटीए और मैग्नीशियम क्लोराइड युक्त A100 में दाता और स्वीकार्य प्रोटेओपोलिपोम्स को 0.15 मिलीमोलर प्रत्येक की एकाग्रता में लाएं। फ्लोरेसेंस रीडिंग के लिए उपयुक्त फ्लैट 96-वेल प्लेट में प्रत्येक प्रतिक्रिया को स्थानांतरित करें, जिससे कम से कम चार प्रतिक्रियाएं तैयार करना सुनिश्चित करें, जिसमें एक ट्रिपलिकेट और नो-जीटीपी नकारात्मक नियंत्रण शामिल है।थाली को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गरम प्लेट रीडर में रखें। एनबीडी फ्लोरेसेंस को हर मिनट पांच मिनट के लिए मापें। फिर, फ्यूजन को प्रेरित करने के लिए पांच मिलीमोलर जीटीपी जोड़ें।पहले की तरह एक ही उत्तेजन और उत्सर्जन का उपयोग कर एक घंटे के लिए हर मिनट NBD फ्लोरेसेंस उपाय । इसके बाद, प्रोटियोलपोसोम्स को भंग करने के लिए कुओं में 2.5% एन-डोडेसिल बीटा-डी-माल्टोसाइड के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें, और उसी उत्तेजन और उत्सर्जन का उपयोग करके 15 मिनट के लिए हर मिनट अधिकतम एनबीडी फ्लोरेसेंस को मापें। इस अध्ययन में, पुनर्संयोजन ड्रोसोफिला एटलास्टिन को शुद्ध किया जाता है और पूर्व सूचित लिपोसोम्स में पुनर्गठित किया जाता है।एटलास्टिन पुनर्गठन की दक्षता एक इओएक्सोल असतत ढाल में फ्लोटिंग पुनर्गठित प्रोटेओलिपोसोम द्वारा निर्धारित की जाती है। शीर्ष, मध्य, और नीचे ढाल परतों के नमूनों को काटा जाता है और एसडीएस-पेज और कूमासी धुंधला द्वारा विश्लेषण किया जाता है। घनत्व द्वारा जेल का मात्राकरण नगण्य खो देता है के साथ पुनर्गठन की एक बहुत ही उच्च दक्षता से पता चलता है, कुल प्रोटीन का 96% के साथ प्रोटियोलिपोमोस के रूप में पाया जा रहा है जो शीर्ष परत पर तैरता है।1% से कम प्रोटीन अप्रतिबंधित है और मध्य परत में पाया जाता है, और केवल 3% अप्रतिबंधित या एकत्रित और नीचे की परत के लिए तलछट है । पुनर्गठन के बाद एटास्टिन के अभिविन्यास को थ्रोम्बिन क्लीवेज परख द्वारा निर्धारित किया जाता है। नमूनों का विश्लेषण एसडीएस-पेज और कूमासी स्टेनिंग और घनत्व से निर्धारित किया जाता है।अधिकांश पुनर्गठित प्रोटीन क्लीव्ड होता है, जिसमें केवल 7% प्रोटीज से सुरक्षित होते हैं। काइनेटिक्स और एटलास्टिन-मध्यस्थता प्रोटेओलिपोसोम फ्यूजन की सीमा लिपिड-मिश्रण परख द्वारा विश्लेषण किया जाता है। शून्य समय बिंदु पर जीटीपी के साथ संलयन को प्रेरित करने से पहले पांच मिनट का इनक्यूबेशन किया जाता है।एक घंटे के बाद, एन-डोडेसिल बीटा-डी-माल्टोसाइड को प्रोटियोलिपोसोम को घुलनशील करने और अधिकतम फ्लोरोसेंट प्रतिध्वनि हस्तांतरण रिलीज प्राप्त करने के लिए जोड़ा गया। रन में फ्यूजन मैक्सिमम में अधिकतम फ्लोरेसेंस का 11% हिस्सा देखा जाता है। लिपिड क्लोरोफॉर्म में घुल जाते हैं।लिपिड घोला जा सकता है तैयार करते समय, किसी भी वाष्पीकरण से बचने के लिए, एक रासायनिक हुड पर, और बर्फ पर ऐसा करना सुनिश्चित करें। लिपोसोम आकार और आकार पर झिल्ली लंगर के प्रभावों की कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोपी द्वारा एटास्टिन प्रोटियोलिपोसोम का विश्लेषण करना संभव है। इस विधि को अन्य झिल्ली-लंगरित प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया गया है और मॉडल लिपिड बाइलेयर में कैसे व्यवहार किया जाता है।यह प्रोटोकॉल लिपिड मिक्स को मात्रा देने के लिए टिटैरेटेड लिपिड का उपयोग करता है। रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करते समय आवश्यक सावधानियां बरतना सुनिश्चित करें।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones साथ nucleosomes का पुनर्गठन

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

डिटर्जेंट-मुक्त Ultrafast Bilayers में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन Fusogenic पूरक का उपयोग कर Proteoliposomes आरोप लगाया ।

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए TRPV1 का शुद्धिकरण और पुनर्गठन

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी, पुनर्गठन और एक Polyhistidine की परख स्नातक प्रयोगशाला के लिए Metalloenzyme टैग

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

अलग और Diatom Cyclotella Meneghiniana से Thylakoid लिपिड के साथ Liposomes में प्रकाश संचयन एंटेना शामिल

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

इन विट्रो में स्व का पुनर्गठन-समर्थित लिपिड Bilayers पर प्रोटीन पैटर्न का आयोजन

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

सेल-प्रकोष्ठ के Microemulsions में चक्र दोलनों का पुनर्गठन-मुक्त Xenopus Egg अर्क

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, एक एक कदम झिल्ली प्रोटीन का शामिल Biotinylated Peptidiscs के लिए सुव्यवस्थित प्रोटीन बंधन परख के लिए

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

पूरी तरह से संसाधित पुनः संयोजन KRAS4b: फरनेसेटेड और मेथाइलेटेड प्रोटीन को अलग और विशेषता

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...