Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Michael Stern e il suo laboratorio per le loro intuizioni e feedback su atlastin progetti correlati. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] e dall'Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus [R01NS102676].

1. Purificazione di GST-DAtl-His8
<ol><li>
Espressione proteica e preparazione del liscia
	<ol>
<li>Trasformare BL21 (DE3) E. coli con il costrutto GST-DAtl-His8 in pGEX4-T32 e selezionare su una piastra di ampicillina.</li>
		<li>Selezionare un singolo trasformativo e inoculato di 5 mL di LB - ampicillina (5 -L di 100 mg/mL di ampicillina) in un tubo di coltura da 14 mL e incubare a 25 mL con agitazione a 200 rpm per 6-8 h. NOT:</</c4> A causa dell'espressione che perde...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. 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L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

I metodi qui delineano un metodo efficiente per purificare, riclassificare e misurare l'attività di fusione dell'atlastina ricombinante. Per garantire alte rese di atlastina funzionale alcuni passaggi critici devono essere considerati. L'espressione di atlastin deve essere fatta a basse temperature (16 ) per evitare l'aggregazione e si dovrebbe puntare a una concentrazione finale tra 0,4-1,5 mg/mL. Le proteine molto diluite non saranno ricostituite in modo ottimale a un rapporto tra 1:400 proteine e lipidi. L'efficienza...

La fusione a membrana è un processo critico in molte reazioni biologiche. In condizioni biologiche, la fusione della membrana non è spontanea e richiede proteine di fusione specializzate per catalizzare tali reazioni1. Er fusione della membrana otipipica è mediata negli animali dal dinamino correlato GTPase atlastin2. Il ruolo di Atlastin nella fusione omotipica è fondamentale per le giunzioni a tre vie nel ER periferico, che costituisce una grande rete interconnessa di tubuli che si estendono in tutta la cellula. Atlastins hanno una morfologia di dominio conservato costituito da una grande GTPase, un dominio intermedio fascio di tre elicoie, un'ancora di membrana idrofobica, e una breve coda citoplasmatica C-terminal33. Studi in vitro con drosophila ricombinante alla Drosophila atlastin hanno dimostrato che, una volta ricostituito per i liposomi, mantiene le sue proprietà fusogene. Altri atlastini, compresi gli omologhi umani non sono stati in grado di ricapitolare la fusione in vitro. Descriviamo qui una metodologia per purificare un GST e la poli-idina etichettata come l'atsolazione ricombinante della Drosophila, riconciliandola ai liposomi e rivaleggere la fusione.
Lo studio della fusione della membrana in vitro rappresenta una sfida in quanto le proteine fusogene di solito hanno un'ancora di membrana. Per studiarli, è necessario ricostituirli in modelli di bistrati lipidici. Le grandi vesciche di unilamellar (LUV) sono uno strumento utile per studiare le interazioni delle proteine lipidi. Vi presentiamo qui un sistema per fare LUV di diverse composizioni lipidiche per la ricostituzione delle proteine e i saggi di fusione. La ricostituzione delle proteine integrali nei LLU può essere ottenuta con una varietà di metodi, tra cui la ricostituzione organica mediata dal solvente, i meccanismi meccanici o la ricostituzione assistita dal detersivo4. Vi presentiamo qui un metodo per ricostituire la Drosophila atlastina in liposomi preformati mediante rimozione del detersivo. I vantaggi di questo metodo di ricostituzione includono elevati rendimenti di ricostituzione e un corretto orientamento di atlastin nel bistrato lipidico. Inoltre, attraverso questo metodo, la proteina non viene essiccata o esposta a solventi organici mantenendo così la struttura e la funzione. Tra i suoi svantaggi, la presenza di detergenti potrebbe non essere ideale per tutte le proteine e i proteoliposomi finali possono avere qualche detergente incorporato nel bistrato lipidico. Ulteriore dialisi può essere utilizzata per eliminare più del detersivo. Tuttavia, la dialisi può richiedere molto tempo e può quindi portare alla perdita di attività proteica.
La valutazione dell'attività di fusione di atlastin può essere determinata mescolando saggi come descritto in precedenza2. Qui, deperiamo un metodo per misurare la fusione mediata atlastina attraverso i lipidi etichettati N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine). Questo saggio richiede la fusione di proteoliposomi donatore (etichettato) e proteoliposomi accettatori (senza etichetta). Un rilascio di FRET può essere misurato durante la reazione come la diluizione di una coppia donatore-acceleratore da liposomi "etichettati" a liposomi "senza etichetta" come risultato della miscelazione dei lipidi durante la fusione della membrana (Figura 1)5. Mentre questo test serve come proxy per la fusione della membrana, è limitato nel distinguere tra fusione della membrana ed emifusione, uno stato in cui solo i volantini esterni si mescolano. Per risolvere questo problema, un'alternativa è l'eliminazione di NBD da parte di NBD per dithionite. Seguendo la stessa metodologia dei pronostici di miscelazione dei lipidi NBD/rhodamine, dopo aver placato il volantino esterno qualsiasi rilascio NBD FRET mediante fusione sarà dovuto alla miscelazione interna dei volantini8.
Saggi di fusione alternativa da contenuti acquosi interni mixaggio indirizzo full fusion solo5. Esempi di questo sono i saggi di terbio (Tb)/dipicolinic acid (DPA) e i saggi di acido trisulfonico aminonaftalene (ANTS)/p-xylene bis(pyridinium) (DPX). Nei saggi Tb/DPA, un pool di liposomi con Tb incapsulato viene miscelato e fuso con liposomi con DPA incapsulato; al momento della fusione, la fluorescenza viene aumentata attraverso il trasferimento interno di energia da DPA a Tb all'interno del complesso [Tb(DPA)3]3- chelazione6. Al contrario, per i saggi ANTS/DPX, la fluorescenza ANTS viene spenta da DPX7. Mentre questi sistemi affrontano la miscelazione del contenuto interno, è necessaria una preparazione più approfondita dei liposomi per la rimozione di reagenti non incapsulati, così come l'interazione involontaria dei fluorofori.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

La fusione a membrana è un processo cruciale nella cellula eucarica. Proteine specializzate sono necessarie per catalizzare la fusione. Le atlastine sono proteine residenti nell'endoplasmico (ER) implicate nella fusione omotipica del ER. Abbiamo descritto qui un metodo per purificare un glutathione S-transferase (GST) e poli-istidina etichettato Drosophila atlastina da due cicli di cromatografia di affinità. Lo studio delle reazioni di fusione in vitro richiede l'inserimento di proteine di fusione purificate in un bistrato lipidico. I liposomi sono membrane modello ideale, come la composizione e le dimensioni dei lipidi possono essere regolati. A tal fine, descriviamo un metodo di ricostituzione mediante rimozione del detergente per la Drosophila atlastin a liposomi preformati. Sebbene siano disponibili diversi metodi di ricostituzione, la ricostituzione mediante rimozione del detergente presenta diversi vantaggi che lo rendono adatto per atlastini e altre proteine simili. Il vantaggio di questo metodo include un'elevata resa di ricostituzione e un corretto orientamento della proteina ricostituita. Questo metodo può essere esteso ad altre proteine della membrana e per altre applicazioni che richiedono proteoliposomi. Inoltre, descriviamo un saggio di miscelazione dei lipidi a base di FRET di proteoliposomi utilizzati come misura della fusione della membrana.

L'efficienza della ricostituzione atlastin è presentata nella Figura 2. I proteoliposomi ricostituiti sono stati galleggianti in un gradiente discontinuo iohexol. La proteina non incorporata è stata sedimentata nello strato inferiore (B) o nello strato intermedio (M). La proteina ricostituita fluttuerebbe verso lo strato superiore (T). I campioni del gradiente sono stati raccolti e analizzati da SDS-PAGE e Coomassie colorazione. La quantificazione del gel mediante densitometria mostra un'e...

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Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

La fusione biologica della membrana è catalizzata da proteine di fusione specializzate. Misurare le proprietà fusogene delle proteine può essere ottenuto mescolando saggi. Vi presentiamo un metodo per purificare la Drosophila ricombinante atlastina, una proteina che media la fusione omotipica del ER, riconformandola in liposomi preformati e testando la capacità di fusione.

Ricostituzione assistita da detergenti della Drosophila ricombinante Atlastin in Liposomi per i saggi che mescolano i lipidi

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Il protocollo di ricostituzione e fusione qui dettagliato è un modo efficiente per studiare le proteine legate alla membrana in un modello di bistrato lipidico e miscelazione lipidica da parte delle proteine di fusione. Qui descriviamo una ricostituzione assistita da detergente della drosophila atlastina ricombinante, una proteina di fusione ER, in liposomi fosfatidilcolini preformati. La fusione dei proteoliposomes di atlastina viene quindi misurata da un saggio di miscelazione lipidica a base di FRET.Uno dei principali vantaggi della ricostituzione assistita da detergenti è che la proteina nel detergente non è esposta all'essiccazione o ai solventi. Mostriamo anche qui che l'orientamento alla ricostituzione dell'atlastina è molto efficiente. Un altro vantaggio del saggio di miscelazione lipidica a base di FRET è che i liposomi non devono essere caricati con alcun colorante e non è necessario alcun passo dialisi extra.Per iniziare questa procedura, preparare le scorte di mix lipidico in cloroformio, come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere una microcurie per millilitro di DPPC alle miscele lipidiche, assicurandosi di riservare almeno otto microlitri di questo stock. Trasferire la quantità desiderata delle miscele lipidiche in tubi di vetro di selce.Quindi asciugare le miscele lipidiche sotto un flusso delicato di gas azoto per circa 10 minuti fino a quando non è visibile più cloroformio. Asciugare ulteriormente il film lipidico risultante in un essiccatore aspirando per 30 minuti. Successivamente, aggiungere abbastanza A100 con 10%glicerolo, 2-mercaptoetanolo bimolare e EDTA millimolare al film lipidico per riportare la concentrazione a 10 millimolare.Rimorsi il film lipidico vortice leggermente per 15 minuti a temperatura ambiente. Congelare i lipidi idratati in azoto liquido. Per scongelare i liposomi, lasciare riposare la soluzione a temperatura ambiente per 30 secondi, quindi trasferirli di nuovo in acqua per uno scongelamento più veloce.Ripetere questo ciclo di congelamento-scongelamento per un totale di 10 volte. Successivamente, utilizzare un mini-estrusore per passare i lipidi attraverso filtri in policarbonato, con una dimensione dei pori di 100 nanometri, 19 volte. Per determinare la concentrazione lipidica totale dei liposomi, aggiungere quattro microlitri di stock lipidico e lisosomi a tre millilitri di cocktail a scintillazione.Misurare i conteggi medi al minuto per stock e liposomi e calcolare la concentrazione liposoma, come delineato nel protocollo di testo. Conservare i liposomi a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. In primo luogo, mescolare la quantità appropriata di tampone, detergente extra e proteine in un tubo da 0,5 millilitri, come delineato nel protocollo di testo.Aggiungere rapidamente i liposomi e immediatamente vortice per cinque secondi per omogeneizzare la miscela. Incubare la reazione in un nutator a quattro gradi Celsius per un'ora. Durante questa incubazione, pesare 0,2 grammi di perline adsorbenti in polistirolo e trasferirle in un tubo di microcentrifugo.Aggiungere un millilitro di metanolo al tubo e mescolare per un minuto per degasare le perline. Quindi, aspirare il metanolo con un ago calibro 21 o superiore. Per iniziare a lavare le perline, aggiungere acqua a loro.Lasciare mescolare le perline con l'acqua per cinque minuti, quindi aspirare l'acqua. Ripetere questo processo di lavaggio dell'acqua quattro volte. Dopo questo, aggiungere acqua per portare il liquame di perline adsorbente in polistirolo a un volume di un millilitro, con una concentrazione finale di 0,2 grammi per millilitro.Calcolare la quantità di perline adsorbenti in polistirolo necessarie per assorbire tutto il detergente in ogni campione, come indicato nel protocollo di testo. Tagliare una punta di pipetta per raccogliere il liquame di perline. Trasferire la quantità calcolata di liquami di perline in un tubo da 0,5 millilitri e aspirare l'acqua.Aggiungere i campioni al tubo contenente le perline e incubare in un nutator a quattro gradi Celsius per un'ora. Trasferire i campioni in un tubo fresco contenente nuove perline, assicurandosi di lasciare indietro le vecchie perline. Incubare di nuovo usando le stesse condizioni.Ripetere questo processo di trasferimento e incubazione delle perline due volte. Successivamente, trasferire il campione in un nuovo tubo contenente perline fresche e incubare nutando durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere il campione dalle perline e dalla centrifuga a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare gli aggregati proteici insolubili.Recuperare il supernatante e determinare la concentrazione lipidica finale mediante conteggio della scintillazione liquida, come delineato nel protocollo di testo. Per iniziare, portare il donatore e il proteoliposomes accettore a una concentrazione di 0,15 millimolari ciascuno in A100 contenente glicerolo, beta-mercaptoetanolo, EDTA e cloruro di magnesio. Trasferire ogni reazione in un pozzo in una piastra piatta da 96 po 'adatta per la lettura della fluorescenza, assicurandosi di preparare almeno quattro reazioni, tra cui un tripliceto e un controllo negativo no-GTP.Posizionare il piatto in un lettore di piastre preriscaldato a 37 gradi Celsius. Misurare la fluorescenza NBD ogni minuto per cinque minuti. Quindi, aggiungere gtp cinque millimolare per indurre la fusione.Misurare la fluorescenza NBD ogni minuto per un'ora usando la stessa eccitazione ed emissione di prima. Successivamente, aggiungere cinque microlitri del 2,5%n-Dodecil beta-D-maltoside ai pozzi per sciogliere i proteoliposomesmi e misurare la fluorescenza NBD massima ogni minuto per 15 minuti usando la stessa eccitazione ed emissione. In questo studio, la drosophila atlastina ricombinante viene purificata e ricostituita in liposomi preformati.L'efficienza della ricostituzione dell'atlastina è determinata da proteoliposomes ricostituiti galleggianti in un gradiente discontinuo dello ioesolo. I campioni degli strati di gradiente superiore, centrale e inferiore vengono raccolti e analizzati mediante colorazione SDS-PAGE e Coomassie. La quantificazione del gel per densitometria mostra un'altissima efficienza di ricostituzione con perdi trascurabili, con il 96% della proteina totale trovata come proteoliposomes che galleggiava allo strato superiore.Meno dell'1% delle proteine non è ricostituito e si trova nello strato intermedio e solo il 3% è non ricostituito o aggregato e sedimentato allo strato inferiore. L'orientamento dell'atlastina dopo la ricostituzione è quantificato da saggi di scissione trombina. I campioni vengono analizzati con colorazione SDS-PAGE e Coomassie e quantificati per densitometria.La maggior parte della proteina ricostituita viene sciccata, con solo il 7% protetto dalla proteasi. La cinetica e l'estensione della fusione proteoliposome mediata dall'atlastina vengono analizzate mediante test di miscelazione lipidica. Un'incubazione di cinque minuti viene eseguita prima di indurre la fusione con GTP al punto di tempo zero.Dopo un'ora, n-Dodecyl beta-D-maltoside è stato aggiunto per solubilizzare i proteoliposomes e ottenere il massimo rilascio di trasferimento di risonanza fluorescente. Il massimo di fusione in corsa è visto come l'11% della fluorescenza massima. I lipidi vengono sciolti in cloroformio.Quando si preparano le miscele lipidiche, assicurarsi di farlo rapidamente, su una cappa chimica e sul ghiaccio per evitare qualsiasi evaporazione. È possibile analizzare i proteoliposomes atlastina per microscopia per visualizzare gli effetti di un'ancora di membrana sulla forma e sulle dimensioni liposomiche. Questo metodo è stato esteso per studiare altre proteine ancorate alla membrana e come si comporta in un modello di bistrato lipidico.Questo protocollo utilizza lipidi titonati per quantificare le miscele lipidiche. Assicurarsi di prendere le precauzioni necessarie quando si lavora con materiali radioattivi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Privo di detersivo ultraveloce ricostituzione delle proteine di membrana in lipidici utilizzando fusogena proteoliposomi complementari a carico.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e l'analisi di un Polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea Cyclotella Meneghiniana in liposomi con i lipidi Thylakoid

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, un'incorporazione in un solo passaggio di proteine membrana in Peptidiscbio biotinylated per analisi di legame proteico semplificato

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b ricombinante completamente elaborato: isolamento e caratterizzazione delle proteine di Farnesylated e Metylated

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...