Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

私たちは、マイケル・スターン博士と彼の研究室に対して、アラストイン関連プロジェクトに関する洞察とフィードバックに感謝します。この研究は、国立総合医学研究所[R01GM101377]と国立神経障害・脳卒中研究所[R01NS102676]によって支援されました。

1. GST-DAtl-His8の精製
<ol><li>
タンパク質発現とリサート製剤
	<ol>
<li>pGEX4-T32のGST-DAtl-His8コンストラクトでBL21(DE3)大腸菌を変換し、アンピシリンプレート上で選択します。</li>
		<li>14 mL培養チューブでLB+アンピシリン(100mg/mLアンピシリンの5μL)を単一の形質転換体を選択し、6-8時間の200rpmで振盪して25°Cでインキュベートします。 注:漏れ発現のため、よ?...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

ここでの方法は、アラストシン組換えの核融合活性を精製、再構成、測定するための効率的な方法を示す。機能的なアラストインの高い収率を確保するためにいくつかの重要なステップを考慮する必要があります。.アラストシンの発現は、凝集を避けるために低温(16°C)で行う必要があり、1つは0.4〜1.5 mg/mLの間の最終的な濃度を目指す必要があります。非常に希薄なタンパク質は、脂質比に?...

膜融合は、多くの生物学的反応において重要なプロセスです。生物学的条件下では、膜融合は自発的ではなく、そのような反応を触媒するために特殊な融合タンパク質を必要とする1.ERホモティピック膜融合は、ダイナミン関連GTPaseアラストシン2によって動物に媒介される。同質融合におけるアラストシンの役割は、末梢ERの三方接合部の基本であり、細胞全体に広がる管状の大規模な相互接続ネットワークを構成する。アラストニンは、大きなGTPase、3つのらせん束中ドメイン、疎水性膜アンカー、および短い細胞質C末端尾3からなる保存されたドメイン形態を有する。組換えショウジョウバエアラトミンを伴うインビトロ研究では、リポソームに再構成すると、そのフソジェニック特性を維持することが示されている。ヒトホモロを含む他のアラストチンは、インビトロでの融合を要約することができませんでした。ここでは、GSTとポリヒスチジンを精製する方法論について、アラストシンの組換えショウジョウバエをタグ付けし、リポソームに再構成し、融合をアッセイする方法論を説明する。
インビトロでの膜融合の研究は、通常、フソジェニックタンパク質が膜アンカーを持っているため、課題を提示します。それらを研究するためには、モデル脂質二重層にそれらを再構成する必要があります。大きなユニラメラ小胞(LUV)は、脂質タンパク質相互作用を研究するのに有用なツールです。ここでは、タンパク質再構成および融合アッセイ用の異なる脂質組成物のLuVを作るシステムを提示する。LUVへの一体タンパク質の再構成は、有機溶媒媒介性再構成、機械的メカニズム、または洗剤支援再構成4を含む様々な方法によって達成することができる。ここでは、洗剤除去により予め形成されたリポソームにショウジョウバエのアラストシンを再構成する方法を提示する。この再構成法の利点は、高い再構成収率と脂質二重層におけるアラストシンの適切な配向を含む。さらに、この方法を通じて、タンパク質は乾燥したり有機溶媒にさらされたりせず、構造や機能を維持します。その欠点の中で、洗剤の存在はすべてのタンパク質に理想的ではない可能性があり、最終的なプロテオリポソームは、脂質二重層に何らかの洗剤を組み込む可能性があります。さらに透析は、より多くの洗剤を排除するために使用されてもよい。しかし、透析には時間がかかるため、タンパク質活性が失われる可能性があります。
アラストシンの融合活性を評価することは、前述の2として脂質混合アッセイによって決定することができる。ここでは、N-(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾル-4-yl(NBD)/リッサミンローダミンBスルホニル(ローダミン)標識脂質を介したアラストイン媒介融合を測定する方法を用いて述記する。このアッセイは、ドナー(標識された)プロテオリポソームと受諾器(ラベルなし)プロテオリポソームの融合を必要とする。FRET放出は、膜融合中の脂質混合の結果として、「標識された」リポソームから「標識されていない」リポソームへのドナー-受諾ペアの希釈として反応中に測定することができる(図1)5。このアッセイは膜融合の代理として機能するが、膜融合とヘミフュージョン(外側のリーフレットのみが混在する状態)を区別することに制限がある。この問題に対処するために、代替案は、ジチオニテによるNBDの外側のリーフレットクエンチングである。NBD/ロダミン脂質混合アッセイと同様の方法論に続いて、融合による任意のNBD FRET放出を外側のリーフレットを消光すると、内部リーフレット混合8に起因する。
内部水性含有量混合による代替融合アッセイアドレスフルフュージョンのみ5.その例としては、テルビウム(Tb)/ジピコリン酸(DPA)アッセイおよびアミノナフタレントリスルホン酸(ANTS)/p-キシレンビス(ピリジニウム)臭化物(DPX)アッセイがあります。Tb/DPAアッセイでは、カプセル化されたTbを持つリポソームのプールが混合され、封入されたDPAとリポソームと融合されます。融合時に、蛍光は[Tb(DPA)3]3-キレート複合体6内のDPAからTbへの内部エネルギー伝達を介して増加する。対照的に、ANTS/DPXアッセイの場合、ANTS蛍光はDPX7によって消光されます。これらのシステムは内部含有量の混合に対処する一方で、非カプセル化試薬の除去、ならびに蛍煙素の意図しない相互作用のために、リポソームのより詳細な調製が必要である。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

膜融合は真核細胞における重要なプロセスです。融合を触媒するには特殊なタンパク質が必要です。アラストリンは、ERの同質性融合に関与する小プラズム網膜(ER)常駐タンパク質である。ここでは、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)とポリヒスチジンタグドロソフィラアラストシンを2ラウンドの親和性クロマトグラフィーで精製する方法を詳述する。インビトロで融合反応を研究するには、精製された融合タンパク質を脂質二重層に挿入する必要があります。リポソームは、脂質組成物およびサイズが調整されてもよいとして、理想的なモデル膜である。そのために、予め形成されたリポソームにショウジョウバエのアラストリンに対する洗剤除去による再構成法について述べた。いくつかの再構成方法が利用可能であるが、洗剤除去による再構成は、アラストシンおよび他の同様のタンパク質に適しているいくつかの利点を有する。この方法の利点は、高い再構成収率および再構成されたタンパク質の正しい向きを含む。この方法は、他の膜タンパク質およびプロテオリポソームを必要とする他のアプリケーションに拡張することができる。さらに、膜融合の測定として用いられるプロテオリポソームのFRETベース脂質混合アッセイについて述べる。

アラストシン再構成の効率を図2に示す。再構成されたプロテオリポソームは、イオエクソール不連続勾配で浮動させた。未組み込みタンパク質は、底層(B)または中間層(M)に堆積させた。再構成されたタンパク質は、最上層(T)に浮動するであろう。グラデーションのサンプルをSDS-PAGEおよびクーマシー染色によって採取し、分析した。デンシトメトリーによるゲルの定量?...

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Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

生体膜融合は、特殊な融合タンパク質によって触媒されます。タンパク質のフソジェニック特性の測定は、脂質混合アッセイによって達成することができる。ERの同質融合を媒実化するタンパク質である組換えショウジョウバエを精製し、あらかじめ形成されたリポソームに再構成し、融合能力を試験する方法を提示する。

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

ここで詳述する再構成および融合プロトコルは、モデル脂質二重層および融合タンパク質による脂質混合における膜結合タンパク質を研究する効率的な方法である。ここでは、ER融合タンパク質である糖質ショウジョウバエ・アトラスチンを、前形ホスファチジルコリンリポソームに組み換えする洗剤支援再構成について説明する。次いで、アプラスチンプロテオリポソームの融合をFRET系脂質混合アッセイにより測定する。洗剤支援再構成の主な利点の1つは、洗剤中のタンパク質が乾燥や溶剤にさらされないことです。また、ここで、アトラスチンの再構成の向きが非常に効率的であることを示す。FRETベースの脂質混合アッセイのもう一つの利点は、リポソームに染料をロードする必要がなく、余分な透析ステップを必要としないことです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、クロロホルムで脂質混合ストックを準備します。DPPCのミリリットル当たり1マイクロキュリーを脂質ミックスに加え、このストックの少なくとも8マイクロリットルを予約してください。必要な量の脂質をフリントガラスチューブに移します。その後、クロロホルムが見えなくなるまで、窒素ガスの穏やかな流れの下で約10分間脂質混合物を乾燥させます。得られた脂質フィルムをさらにデシケータで30分間真空にして乾燥させます。この後、10%グリセロール、2ミリモル2-メルカプトエタノール、および1ミリモルEDTAを用いて十分なA100を脂質フィルムに加え、濃度を10ミリモルに戻します。室温で15分間軽く渦を出して脂質膜を再懸濁する。水和した脂質を液体窒素中で凍結します。リポソームを解凍するには、溶液を室温で30秒間座らせ、水に戻してより速い解凍を行います。この凍結融解サイクルを合計 10 回繰り返します。この後、100ナノメートル、19倍の細孔サイズで、ポリカーボネートフィルターを介して脂質を渡すためにミニ押出機を使用してください。リポソームの総脂質濃度を決定するには、4マイクロリットルの脂質ストックとリソソームを3ミリリットルのシンチレーションカクテルに加えます。テキストプロトコルで概説されているように、ストックとリポソームの1分あたりの平均カウントを測定し、リポソーム濃度を計算します。リポソームは摂氏4度で1週間保存します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、適切な量のバッファー、余分洗剤、およびタンパク質を0.5ミリリットルのチューブに混ぜます。迅速にリポソームを添加し、すぐに5秒間渦を加えて混合物を均質化する。反応を摂氏4度で1時間インキュベートします。このインキュベーション中に、0.2グラムのポリスチレン吸着剤ビーズを計量し、マイクロ遠心チューブに移します。チューブに1ミリリットルのメタノールを加え、1分間混ぜてビーズを脱気します。次いで、21ゲージ以上の針でメタノールを吸引する。ビーズの洗浄を開始するには、それらに水を追加します。ビーズを水と5分間混ぜ、水を吸い込みます。この水洗プロセスを4回繰り返します。この後、水を加えて、ポリスチレン吸着ビーズスラリーを1ミリリットルの体積に持ち込み、最終濃度は1ミリリットルあたり0.2グラムです。テキストプロトコルで概説されているように、各サンプルのすべての洗剤を吸着するために必要なポリスチレン吸着剤ビーズの量を計算します。ピペットチップを切ってビーズスラリーを回収します。計算されたビーズスラリーの量を0.5ミリリットルチューブに移し、水を吸引します。ビーズを含むチューブにサンプルを加え、1時間摂氏4度でヌテーターでインキュベートします。新しいビーズを含む新鮮なチューブにサンプルを転送し、古いビーズを残すことを確認します。同じ条件を使用して再度インキュベートする。このビーズの移入とインキュベートを2回繰り返します。この後、新鮮なビーズを含む新しいチューブにサンプルを移し、摂氏4度で一晩をヌートしてインキュベートします。翌日、ビーズと遠心分離機から16,000回gと摂氏4度で10分間サンプルを取り出し、不溶性タンパク質凝集体をペレット化します。上清を回収し、テキストプロトコルに概説されているように、液体シンチレーション計数によって最終的な脂質濃度を決定する。まず、ドナーとアクセプタープロテオリポソームをグリセロール、β-メルカプトエタノール、EDTA、塩化マグネシウムを含むA100のそれぞれ0.15ミリモルの濃度に持って来てください。蛍光読み取りに適した平らな96ウェルプレート内のウェルに各反応を移し、三重およびノーGTP陰性対照を含む少なくとも4つの反応を準備することを確認する。プレートを摂氏37度の予熱プレートリーダーに入れなさい。NBD蛍光を毎分5分間測定します。次いで、5ミリモルGTPを加え、融合を誘導する。以前と同じ励起と放出を使用して、1時間毎分NBD蛍光を測定します。その後、2.5%の5マイクロリットルを添加し、2.5%-ドデシルβ-D-マルトシドをウェルに加えてプロテオリポソームを溶解し、同じ励起と発光を使用して1分毎に最大蛍光を測定します。本研究では、組換えショウジョウバエアトラスチンを精製し、予め形成されたリポソームに再構成する。アブラスチン再構成の効率は、イオヘキソール不連続勾配における浮遊再構成されたプロテオリポソームによって決定される。上、中央、下の勾配レイヤーのサンプルは、SDS-PAGEとクマシー染色によって収穫され、分析されます。デンシトメトリーによるゲルの定量化は、極めて小さな損失で再構成の非常に高い効率を示し、全タンパク質の96%が最上層に浮遊するプロテオリポソームとして見つかっています。タンパク質の1%未満は再構成されず、中間層に見られ、3%だけが再構成されていないか、または凝集し、底層に沈沈入されます。再構成後のアプラスチンの向きはトロンビン切断アッセイにより定量される。サンプルはSDS-PAGEとクマシー染色で分析され、デンシトメトリーで定量されます。再構成されたタンパク質のほとんどは切断され、プロテアーゼから保護されているのはわずか7%です。キネティクスとアプラスチン媒介プロテオリポソーム融合の程度は、脂質混合アッセイによって分析される。ゼロタイムポイントでGTPとの融合を誘発する前に5分間のインキュベーションが行われます。1時間後、n-ドデシルβ-D-マルトシドを添加してプロテオリポソームを可溶化し、最大蛍光共鳴伝達放出を得た。ランにおける融合の最大値は、最大蛍光の11%であることが分かる。脂質はクロロホルムに溶解する。脂質混合を準備するときは、蒸発を避けるために、化学フードと氷の上で、迅速にこれを行うことを確認してください。顕微鏡法によりアプラスチンプロテオリポソームを解析し、膜アンカーがリポソームの形状や大きさに及ぼす影響を可視化することが可能です。この方法は、他の膜固定タンパク質とモデル脂質二重層でどのように振る舞うかを研究するために拡張されました。このプロトコルは、脂質の混合物を定量化するために滴定脂質を使用します。放射性物質を扱う際には、必ず必要な予防措置を講じてください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

ベンチトップ固定金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、再構成し、Polyhistidine のアッセイ学部の研究室の金属をタグ付き

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick、合理化されたタンパク質結合アッセイのためのバイオチン化ペプチドディスクへの膜タンパク質のワンステップ組み込み

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

完全処理された組換えKRAS4b:ファルネシル化およびメチル化タンパク質の分離と特徴付け

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...