Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

마이클 스턴 박사와 그의 연구실에서 아플라스틴 관련 프로젝트에 대한 통찰력과 피드백에 감사드립니다. 이 작품은 일반 의학의 국립 연구소에 의해 지원되었다 [R01GM101377] 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소 [R01NS102676].

1. GST-DAtl-His8의 정화
<ol><li>
단백질 발현 및 포해준비
	<ol>
<li>pGEX4-T3 2의 GST-DAtl-His8 구성으로 BL21(DE3) 대장균을 변환하고 암피실린 플레이트에서 선택합니다.</li>
		<li>14 mL 배양 튜브에서 단일 형질전환 및 접종 5 mL LB + ampicillin (5 μL 의 100 mg/mL ampicillin)을 선택하고 25 °C에서 배양하여 6-8 시간 동안 200 rpm에서 흔들어. 참고: 누수 발현으로 인해 더 높은 온도?...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

여기서 방법은 재조합 아슬란스틴의 융합 활성을 정화, 재구성 및 측정하기위한 효율적인 방법을 묘사합니다. 기능 적 아플라스틴의 높은 수율을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다. 아슬란스틴의 발현은 응집을 피하기 위해 저온 (16 °C)에서 수행해야하며 0.4-1.5 mg / mL 사이의 최종 농도를 목표로해야합니다. 매우 희석된 단백질은 지질 비율로 1:400 단백질로 최적으로 재구성되?...

막 융합은 많은 생물학적 반응에서 중요한 과정입니다. 생물학적 조건하에서, 막 융합은 자발적이지 않으며 그러한 반응을 촉매하기위해 전문화된 융합 단백질이 필요합니다 1. ER 상형 막 융합은 다이너닌 관련 GTPase 아플라스틴2에의해 동물에서 매개된다. 상모융합에서 아틀라스틴의 역할은 세포 전체에 걸쳐 확장되는 튜블의 큰 상호 연결된 네트워크를 구성하는 주변 ER의 3방향 접합에 대한 기본입니다. 아틀라스틴은 대형 GTPase, 3개의 나선 번들 중간 도메인, 소수성 멤브레인 앵커 및 짧은 세포질 C-말단 꼬리3으로구성된 보존된 도메인 형태를 가진다. 재조합 드로 소 필아슬아슬라 아플라스틴과 생체 외 연구는 리포솜으로 재구성 할 때, 그것은 그것의 fusogenic 속성을 유지하는 것으로 나타났습니다. 인간 상동체를 포함한 다른 아슬아슬증은 시험관 내에서 융합을 재현할 수 없었다. 우리는 여기에 GST와 폴리 히스티딘 태그 재조합 초파리 아틀라스틴을 정화하기위한 방법론을 설명, 리포솜에 그것을 재구성, 및 융합을 해석.
시험관내에서 막 융합을 연구하는 것은 일반적으로 막 앵커를 가지고 있는 푸소제닉 단백질로서 도전을 제시한다. 그들을 연구하기 위해서는 모델 지질 이중층으로 재구성해야합니다. 큰 unilamellar 소포 (LUV)는 지질 단백질 상호 작용을 공부하는 유용한 공구입니다. 우리는 단백질 재구성 및 융합 세포에 대한 다른 지질 조성물의 LUV를 만드는 시스템을 제시합니다. LuV로 의 통합 단백질의 재구성은 유기 용매 매개 재구성, 기계적 메커니즘, 또는 세제 보조 재구성을포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다 4. 우리는 여기에 세제 제거에 의해 미리 형성 된 리포좀으로 Drosophila 아틀라스틴을 재구성하는 방법을 제시한다. 이 재구성 방법의 장점은 지질 이중층에서 높은 재구성 수율과 아슬라틴의 적절한 방향을 포함한다. 부가적으로, 이 방법을 통해, 단백질은 건조되거나 유기 용매에 노출되지 않아 구조 및 기능을 유지한다. 그 단점 중, 세제의 존재는 모든 단백질에 이상적이지 않을 수 있으며 최종 프로테올리포좀은 지질 이중층에 일부 통합 세제를 가질 수 있다. 추가 투석은 세제의 더 많은 제거하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나 투석은 시간이 오래 걸릴 수 있으므로 단백질 활성의 손실로 이어질 수 있습니다.
아플라스틴의 융합 활성을 평가하는 것은 앞서 설명한 바와 같이 지질 혼합 검사에 의해 결정될 수있다2. 여기서, 우리는 N-(7-니트로벤츠-2-옥사-1,3-디아졸-4-yl(NBD)/리사민 로다민-B 설포닐(로다민)에 표기된 지질을 통해 아플라스틴 매개 융합을 측정하는 방법을 묘사한다. 이 분석법은 기증자 (표지된) 프로테올리포좀및 수용자(표지되지 않은) 프로테올리포좀의 융합을 요구한다. FRET 방출은 막 융합 동안 지질 혼합의 결과로서 "표지된" 리포좀으로부터 "표지된" 리포좀으로부터 공여자-수용자 쌍의 희석으로서 반응동안 측정될 수 있다(도 1)5. 이 분석은 막 융합을 위한 프록시역할을 하는 동안, 막 융합과 헤미퓨전을 구별하는 데 에는 제한적이며, 외부 리플렛만 혼합하는 상태이다. 이 문제를 해결하기 위해, 대안은 디티오미트에 의한 NBD의 외부 전단지 담금질이다. NBD/로다민 지질 혼합 시험과 동일한 방법론에 따라, 외부 리플렛을 담금질하면 융합에 의한 NBD FRET 방출은 내부 리플렛 혼합에 기인할 것이다8.
내부 수성 함량 혼합 주소 전체 융합만5에의한 대체 융합 어제비. 이것의 예는 테르비움 (Tb)/디피콜린산 (DPA) 아미노나페탈렌 트리설포닉산 (ANTS)/p-자일렌 비스 (피리디늄) 브로마이드 (DPX) 애시스입니다. 결핵/DPA 검사에서, 캡슐화 된 결핵을 가진 리포좀 풀은 캡슐화된 DPA와 리포솜과 혼합되고 융합됩니다; 융합시, 형광은 [Tb(DPA) 3]3] 3-킬레이트 복합체6내에서 DPA에서 결핵으로 의 내부 에너지 전달을 통해 증가한다. 대조적으로, ANTS/DPX 어설션의 경우, 개미 형광은 DPX7에의해 담금질됩니다. 이러한 시스템은 내부 콘텐츠 혼합을 해결하는 동안, 리포좀의 더 심층적 인 준비는 비 캡슐화 시약의 제거뿐만 아니라 형광의 의도하지 않은 상호 작용을 위해 필요합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

막 융합은 진핵 세포에서 중요한 과정입니다. 융합을 촉매하려면 특수 단백질이 필요합니다. 아틀라스틴은 ER의 상동성 융합에 연루된 소포체(ER) 상주 단백질이다. 여기서 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 폴리히스티딘 태그가 붙은 드로소필라 아플라스틴을 친화성 크로마토그래피의 두 라운드로 정화하는 방법을 자세히 설명합니다. 시험관 내에서 융합 반응을 연구하려면 정제된 융합 단백질을 지질 이중층으로 삽입해야 합니다. 리포솜은 지질 조성 및 크기가 조정될 수 있기 때문에 이상적인 모델 막이다. 이를 위해, 우리는 미리 형성 된 리포좀으로 초파리 아플라스틴에 대한 세제 제거에 의해 재구성 방법을 설명합니다. 여러 가지 재구성 방법을 사용할 수 있지만, 세제 제거에 의한 재구성은 아틀라스틴 및 기타 유사한 단백질에 적합한 몇 가지 장점이 있습니다. 이 방법의 장점은 재구성 된 단백질의 높은 재구성 수율 및 올바른 배향을 포함한다. 이 방법은 단백질을 필요로 하는 그밖 막 단백질 및 그밖 용도로 확장될 수 있습니다. 추가적으로, 우리는 막 융합의 측정으로 이용된 프로테올리포좀의 FRET 기반 지질 혼합 분석사를 기술한다.

아슬라스틴 재구성의 효율성은 그림2에 제시되어 있습니다. 재구성된 프로테오폴리포솜은 요오헥솔 불연속 그라데이션에 떠 있었다. 통합되지 않은 단백질을 하부층(B) 또는 중간층(M)에서 침전시켰다. 재구성된 단백질은 최상위 층(T)에 떠있을 것이다. 그라데이션의 샘플을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 수확 및 분석하였다. 밀도측정에 의한 겔의 정량화는 무시할 수 있는 ?...

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Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

생물학적 막 융합은 특수 융합 단백질에 의해 촉매됩니다. 단백질의 fusogenic 특성을 측정하는 것은 지질 혼합 분석을 통해 달성될 수 있다. 우리는 재조합 Drosophila 아틀라를 정화하는 방법을 제시, ER의 상모 융합을 중재하는 단백질, 미리 형성 된 리포솜에 그것을 재구성, 융합 용량에 대한 테스트.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

여기에 자세히 설명된 재구성 및 융합 프로토콜은 모형 지질 이중층및 융합 단백질에 의한 지질 혼합에서 막 결합 단백질을 연구하는 능률적인 방법입니다. 여기에서 우리는 사전 형성된 인산염 리포좀으로, ER 융합 단백질인 재조합 Drosophila atlastin의 세제 보조 재구성을 설명합니다. 아틀라스틴 프로테올리포좀의 융합은 FRET 계 지질 혼합 분석으로 측정됩니다.세제 보조 재구성의 주요 장점 중 하나는 세제의 단백질이 건조 또는 용매에 노출되지 않는다는 것입니다. 우리는 또한 여기에 아타스틴의 재구성 방향이 매우 효율적이라는 것을 보여줍니다. FRET 기반 지질 혼합 분석의 또 다른 장점은 리포솜이 염료를 적재할 필요가 없으며 추가 투석 단계가 필요하지 않다는 것입니다.이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 엽록소형태로 지질 혼합 주식을 준비합니다. DPPC의 밀리리터 당 1개의 마이크로큐리를 지질 혼합물에 추가하여 최소 8개의 마이크로리터를 보관하십시오. 원하는 양의 지질 믹스를 부싯돌 유리 튜브로 옮킨다.그런 다음 더 이상 클로로폼이 보이지 않게 될 때까지 약 10 분 동안 질소 가스의 부드러운 스트림 에서 지질 혼합물을 건조시십시오. 30분 동안 진공 청소기로 생성된 지질 필름을 건조기에서 더 건조시로 건조시로 건조시팅합니다. 그 후, 10%의 글리세롤, 2밀리머 2-메르카토에탄올, 1밀리머 EDTA를 충분한 A100을 지질 필름에 추가하여 농도를 10 밀리머로 되돌려 준다.실온에서 15분 동안 가볍게 소용돌이치며 지질 필름을 재개봉합니다. 액체 질소에 수화 지질을 동결. 리포솜을 해동하려면 용액이 실온에 30초 동안 앉아서 다시 물로 옮겨 서 더 빠르게 해동합니다.이 동결 해동 주기를 총 10회 반복합니다. 그 후, 미니 압출기를 사용하여 폴리카보네이트 필터를 통해 지질을 통과하고 100 나노미터의 모공 크기, 19 배. 지질의 총 지질 농도를 확인하려면 지질 육수와 리소좀 4개의 마이크로리터를 3밀리리터의 신경식 칵테일에 추가합니다.스톡 및 리포솜의 분당 평균 수를 측정하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 리포솜 농도를 계산합니다. 리포솜을 섭씨 4도까지 최대 1주일 동안 보관하십시오. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 양의 완충제, 여분의 세제 및 단백질을 0.5 밀리리터 튜브에 혼합합니다.리포솜을 빠르게 추가하고 혼합물을 균질화하기 위해 5 초 동안 즉시 소용돌이합니다. 1 시간 동안 섭씨 4도에서 영양가에 반응을 배양. 이 잠복 하는 동안, 무게 0.2 폴리스티렌 흡착 구슬의 그램 과 마이크로 centrifuge 튜브에 전송.튜브에 메탄올 1 밀리리터를 넣고 1분간 섞어 구슬을 탈유합니다. 그런 다음 메탄올을 21 게이지 이상의 바늘로 흡인시합니다. 구슬세척을 시작하려면 물을 넣습니다.구슬이 물과 5분간 섞은 다음 물을 흡입합니다. 이 물 세척 과정을 4 번 반복하십시오. 그 후, 물을 추가하여 폴리스티렌 흡착 구슬 슬러리를 1 밀리리터의 부피에 넣고 밀리리터당 0.2 그램의 최종 농도를 제공합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플의 모든 세제를 흡착하는 데 필요한 폴리스티렌 흡착 구슬의 양을 계산합니다. 파이펫 팁을 잘라 비드 슬러리를 수집합니다. 계산된 양의 비드 슬러리를 0.5밀리리터 튜브로 옮기고 물을 흡입합니다.비드가 들어 있는 튜브에 샘플을 추가하고 1시간 동안 섭씨 4도의 누테이너에 인큐베이션합니다. 샘플을 새로운 구슬이 들어 있는 신선한 튜브로 옮기고 오래된 구슬을 남겨두십시오. 동일한 조건을 사용하여 다시 인큐베이션합니다.구슬을 두 번 옮기고 인큐베이팅하는 이 과정을 반복합니다. 그 후, 샘플을 신선한 구슬이 들어 있는 새로운 튜브로 옮기고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 누디닝하여 배양합니다. 다음 날, 비드 및 원심분리기에서 16, 000배, 섭씨 4도에서 10분간 샘플을 제거하여 불용성 단백질 응집체를 펠렛합니다.상체를 복구하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 액체 신경화 계수에 의해 최종 지질 농도를 결정한다. 시작하려면, 기증자와 수용자 프로테오폴좀을 글리세롤, 베타 메르카포에탄올, EDTA 및 염화 마그네슘을 함유하는 A100의 각각 0.15 밀리몰러 농도로 가져옵니다. 각 반응을 형광 판독에 적합한 평평한 96웰 플레이트에서 우물로 옮기고, 삼중 반응과 노-GTP 음성 제어를 포함하여 적어도 4개의 반응을 준비해야 합니다.접시를 예열된 플레이트 판독기에 섭씨 37도에 넣습니다. 분당 5분 동안 NBD 형광을 측정합니다. 그런 다음 융합을 유도하기 위해 5 밀리마일러 GTP를 추가합니다.이전과 동일한 흥분 및 방출을 사용하여 1시간 동안 1분마다 NBD 형광을 측정합니다. 그 후, 5개의 마이크로리터를 우물에 2.5%n-Dodecyl 베타-D-maltoside를 추가하여 프로테오올리포좀을 용해시키고, 동일한 흥분과 방출을 사용하여 15분 동안 분마다 최대 NBD 형광을 측정합니다. 이 연구에서, 재조합 드로소필라 아랫슬레이틴은 정제및 미리 형성된 리포솜으로 재구성된다.아라스틴 재구성의 효율은 요오헥솔 불연속 그라데이션에서 재구성된 프로테오폴좀을 플로팅하여 결정한다. 상단, 중간 및 하단 그라데이션 층의 샘플은 SDS PAGE 및 Coomassie 염색에 의해 수확및 분석됩니다. 밀도에 의한 겔의 정량화는 무시할 수 있는 손실로 재구성의 매우 높은 효율을 나타내며, 총 단백질의 96%가 상부 층으로 떠있는 프로테올리포좀으로 발견된다.단백질의 1% 미만은 재구성되지 않고 중간 층에서 발견되며, 3%만이 재구성되지 않거나 집계되고 바닥 층으로 퇴적됩니다. 재구성 후 아틀라스틴의 방향은 혈소분열 소세에 의해 정량화된다. 샘플은 SDS-PAGE 및 Coomassie 염색으로 분석되고 밀도에 의해 정량화됩니다.재구성된 단백질의 대부분은 칼이 나고, 7%만이 프로테아제로부터 보호되고 있습니다. 운동학 및 아랫스틴 매개 프로테오폴모성 융합의 정도는 지질 혼합 분석에 의해 분석된다. 0시점에서 GTP와의 융합을 유도하기 전에 5분의 인큐베이션이 수행됩니다.1시간 후, n-Dodecyl 베타-D-maltoside를 첨가하여 프로테오올리포좀을 용해시키고 최대 형광 공명 전달 방출을 얻습니다. 실행에서 의 융합 최대는 최대 형광의 11%로 보입니다. 지질은 클로로폼에 용해됩니다.지질 믹스를 준비할 때, 화학 후드와 얼음에서 신속하게 이 작업을 수행하여 증발을 피하십시오. 미각검사로 아틀라스틴 프로테올리포좀을 분석하여 리포솜 모양과 크기에 막 앵커의 효과를 시각화할 수 있다. 이 방법은 다른 막 고정 단백질을 연구하고 모델 지질 이중층에서 어떻게 행동하는지 연구하기 위해 확장되었습니다.이 프로토콜은 지질 혼합물을 정량화하기 위해 타이티드 지질을 사용합니다. 방사성 물질로 작업할 때 필요한 예방 조치를 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

분리 및 통합 규조류 Cyclotella Meneghiniana Thylakoid 지질으로 리에서에서 광 수확 안테나

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, 간소화 된 단백질 결합 검정을 위한 생체 면역 펩티디스크에 막 단백질의 한 단계 통합

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

완전히 가공된 재조합 KRAS4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...