Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Vi takker Dr. Michael Stern og hans Lab for deres innsikt og tilbakemeldinger på atlastin relaterte prosjekter. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] og National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke [R01NS102676].

1. rensing av GST-DAtl-His8
<ol><li>
Protein uttrykk og lysat forberedelse
	<ol>
<li>Transformer BL21 (DE3) E. coli med GST-DAtl-His8-konstruksjonen i PGEX4-T32 og velg på en Ampicillin plate.</li>
		<li>Velg en enkelt transformant og vaksinere 5 mL LB + Ampicillin (5 μL av 100 mg/mL Ampicillin) i et 14 mL kultur rør og ruge ved 25 ° c med risting ved 200 RPM for 6-8 h. Merk: På grunn av Leaky uttrykk, er det ikke anbefalt å ruge ved høyere temperaturer. V...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

Metodene her avgrense en effektiv metode for rensing, rekonstituering av, og måle fusjon aktivitet av rekombinant atlastin. For å sikre høy avkastning av funksjonell atlastin noen kritiske skritt må vurderes. Atlastin må gjøres ved lave temperaturer (16 ° c) for å unngå aggregering, og man bør sikte på en endelig konsentrasjon mellom 0,4 – 1.5 mg/mL. Svært fortynnet protein vil ikke bli rekonstituert optimalt på et 1:400 protein til lipid ratio. Effektiviteten av rekonstituering kan eventuelt analyseres me...

Membran fusjon er en kritisk prosess i mange biologiske reaksjoner. Under biologiske forhold er membran fusjon ikke spontan og krever spesialiserte fusjons proteiner for å katalysere slike reaksjoner1. Er homotypic membran Fusion er mediert i dyr av dynamin relaterte GTPase atlastin2. Atlastin rolle i homotypic fusjon er grunnleggende for treveis kryss i perifer er, som utgjør et stort sammenhengende nettverk av tubuli som strekker seg over hele cellen. Atlastins har en bevart domene morfologi bestående av en stor GTPase, en tre Helix bunt midtre domene, en hydrofobe membran anker, og en kort cytoplasmatiske C-terminal hale3. In vitro studier med rekombinant Drosophila atlastin har vist at når rekonstituert til liposomer, opprettholder den sine fusogenic egenskaper. Andre atlastins, inkludert menneskelige homologs har ikke vært i stand til å recapitulate fusjon in vitro. Vi beskriver her en metodikk for rensing en GST og Poly-histidin merket rekombinant Drosophila atlastin, rekonstituering av det til liposomer, og assaying fusjon.
Studere membran Fusion in vitro presenterer en utfordring som fusogenic proteiner har vanligvis en membran anker. For å studere dem, er det nødvendig å Rekonstituer dem inn i modellen lipid bilayers. Store unilamellære blemmer (LUV) er et nyttig verktøy for å studere lipid protein interaksjoner. Vi presenterer her et system for å gjøre elsker av forskjellige lipid komposisjoner for protein rekonstituering og fusjon analyser. Rekonstituering av Integral proteiner i har kan oppnås ved en rekke metoder, inkludert, organiske løsemiddel-mediert rekonstituering, mekaniske mekanismer, eller vaskemiddel assistert rekonstituering4. Vi presenterer her en metode for rekonstituering av Drosophila atlastin inn preformed liposomer av vaskemiddel fjerning. Fordelene med denne rekonstituering metoden inkluderer høy rekonstituering gir og riktig orientering av atlastin i lipid bilayer. I tillegg, gjennom denne metoden, er proteinet ikke tørket eller utsatt for organiske løsemidler og dermed opprettholde struktur og funksjon. Blant sine ulemper, tilstedeværelsen av vaskemidler kan ikke være ideelt for alle proteiner og den endelige proteoliposomes kan ha noen innarbeidet vaskemiddel i lipid bilayer. Ytterligere dialyse kan brukes til å eliminere mer av vaskemiddel. Men dialyse kan ta lang tid og kan derfor føre til tap av protein aktivitet.
Vurdering atlastin ' s Fusion aktivitet kan bestemmes av lipid miksing analyser som tidligere beskrevet2. Her, vi avgrense en metode for å måle atlastin mediert fusjon gjennom N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-YL (neste arbeidsdag)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) merket lipider. Denne analysen krever fusjon av donor (merket) proteoliposomes og Acceptor (umerkede) proteoliposomes. En bånd Release kan måles under reaksjonen som fortynning av en giver-Acceptor par fra "merket" liposomer til "umerkede" liposomer som et resultat av lipid miksing under membran fusjon (figur 1)5. Mens denne analysen fungerer som en proxy for membran fusjon, er det begrenset i skille mellom membran fusjon og hemifusion, en tilstand der bare de ytre brosjyrer mix. For å løse dette problemet, er et alternativ ytre pakningsvedlegget slukker av neste arbeidsdag ved dithionite. Etter den samme metodikk som neste arbeidsdag/rhodamine lipid blande analyser, ved å slukke den ytre pakningsvedlegget noen arbeidsdag bånd utgivelse ved fusjon vil være på grunn av indre pakningsvedlegg blanding8.
Alternative fusjon analyser av indre vandig innhold miksing adresse full fusjon bare5. Eksempler på dette er Terbium (TB)/dipicolinic acid (DPA) analyser og aminonaphthalene trisulfonic acid (ANTS)/p-xylene BIS (pyridinium) bromide (DPX) analyser. I TB/DPA-analyser blir en pool av liposomer med innkapslet TB blandet og smeltet sammen med liposomer med innkapslet DPA. ved fusjon økes fluorescens via intern energi overføring fra DPA til TB i [TB (DPA)3]3- Chelation Complex6. Til sammenligning, for ANTS/DPX-analyser, er ANTS-fluorescens slukket av DPX7. Selv om disse systemene adresserer blanding av indre innhold, er det nødvendig med mer dybde utarbeidelse av liposomer for fjerning av ikke-innkapslet reagenser, i tillegg til utilsiktet interaksjon av fluorophores.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

Membran fusjon er en viktig prosess i den eukaryote cellen. Spesialiserte proteiner er nødvendig for å katalysere fusjon. Atlastins er endoplasmatiske retikulum (er) bosatt proteiner innblandet i homotypic fusjon av AKUTTEN. Vi detalj her en metode for rensing en glutation S-glutamyltransferase (GST) og Poly-histidin merket Drosophila atlastin av to runder av affinitet kromatografi. Studere Fusion reaksjoner in vitro krever renset Fusion proteiner som skal settes inn i en lipid bilayer. Liposomer er ideelle modell membraner, som lipid sammensetning og størrelse kan justeres. For dette formålet beskriver vi en metode for rekonstituering ved rengjøringsmiddel fjerning for Drosophila atlastin til preformed liposomer. Selv om flere metoder for rekonstituering er tilgjengelige, har fjerning av vaskemiddel flere fordeler som gjør den egnet for atlastins og andre lignende proteiner. Fordelen med denne metoden inkluderer en høy rekonstituering yield og riktig orientering av rekonstituert protein. Denne metoden kan utvides til andre membran proteiner og for andre programmer som krever proteoliposomes. I tillegg beskriver vi et bånd basert lipid miksing analysen av proteoliposomes brukes som en måling av membran fusjon.

Effektiviteten av atlastin rekonstituering er presentert i figur 2. Rekonstituert proteoliposomes ble fløt i en iohexol usammenhengende gradient. Næringsdrivende protein ble sedimentert i det nederste laget (B) eller i det midterste laget (M). Rekonstituert protein ville flyte til det øverste laget (T). Prøver av gradient ble høstet og analysert av SDS-side og Coomassie farging. Kvantifisering av gelen ved densitometri viser en meget høy virkningsgrad ved rekonstituering med ubetydelig...

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biologisk membran fusjon er katalysert av spesialiserte fusjons proteiner. Måle fusogenic egenskaper av proteiner kan oppnås ved lipid miksing analyser. Vi presenterer en metode for rensing av rekombinant Drosophila atlastin, et protein som formidler homotypic fusjon av AKUTTEN, rekonstituering av det til preformed liposomer, og testing for fusjons kapasitet.

Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Rekonstituerings- og fusjonsprotokollen som er beskrevet her, er en effektiv måte å studere membranbundne proteiner på i en modell lipid bilayer og lipidblanding ved fusjonsproteiner. Her beskriver vi et vaskemiddelassistert rekonstituering av rekombinant Drosophila atlastin, et ER fusjonsprotein, til forhåndsformede fosfatidylkolinleosomer. Fusjon av atlastinprooliposomer måles deretter ved en FRET-basert lipidblandingsanalyse.En av de viktigste fordelene med vaskemiddelassistert rekonstituering er at proteinet i vaskemiddel ikke utsettes for tørking eller løsemidler. Vi viser også her at rekonstitueringsorientering av atlastin er svært effektiv. En annen fordel med den FRET-baserte lipidblandingsanalysen er at liposomer ikke trenger å lastes med fargestoff, og det er ikke behov for noen ekstra dialyser trinn.For å begynne denne prosedyren, forberede lipid blanding lagrene i kloroform, som beskrevet i tekstprotokollen. Legg til en mikrokurie per milliliter DPPC til lipidblandingene, og sørg for å reservere minst åtte mikroliter av denne aksjen. Overfør ønsket mengde lipidblandinger til flintglassrør.Tørk deretter lipidblandingene under en mild strøm av nitrogengass i ca. 10 minutter til ikke mer kloroform er synlig. Tørk den resulterende lipidfilmen ytterligere i en desiccator ved å støvsuge i 30 minutter. Etter dette, legg nok A100 med 10% glyserol, to-millimolar 2-mercaptoetanol, og en millimolar EDTA til lipidfilmen for å bringe konsentrasjonen tilbake til 10 millimolar.Resuspend lipidfilmen ved å virvle lett i 15 minutter ved romtemperatur. Frys de hydrerte lipidene i flytende nitrogen. For å tine liposomer, la løsningen sitte ved romtemperatur i 30 sekunder, og overfør dem deretter tilbake til vann for raskere tining.Gjenta denne fryse-tine syklus totalt 10 ganger. Etter dette, bruk en mini-ekstruder for å passere lipidene gjennom polykarbonatfiltre, med en porestørrelse på 100 nanometer, 19 ganger. For å bestemme den totale lipidkonsentrasjonen av liposomer, legg til fire mikroliter lipidlager og lysosomer til tre milliliter scintillation cocktail.Mål gjennomsnittlig antall per minutt for lager og liposomer, og beregn liposometkonsentrasjonen, som beskrevet i tekstprotokollen. Oppbevar liposomer på fire grader Celsius i opptil en uke. Bland først riktig mengde buffer, ekstra vaskemiddel og protein i et 0,5-milliliter rør, som beskrevet i tekstprotokollen.Tilsett liposomer raskt, og virvle umiddelbart i fem sekunder for å homogenisere blandingen. Inkuber reaksjonen i en nutator ved fire grader Celsius i en time. Under denne inkubasjonen, vei ut 0,2 gram polystyren adsorbent perler og overføre dem til et mikrocentrifuge rør.Tilsett en milliliter metanol til røret, og bland i ett minutt for å degas perlene. Deretter aspirerer metanol med en 21-gauge eller høyere nål. For å begynne å vaske perlene, legg til vann til dem.La perlene blandes med vannet i fem minutter, og aspirer deretter vannet. Gjenta denne vannvaskeprosessen fire ganger. Etter dette, tilsett vann for å bringe polystyren adsorbent perle slurry til et volum på en milliliter, med en endelig konsentrasjon på 0,2 gram per milliliter.Beregn mengden polystyren adsorbent perler som trengs for å adsorbere alt vaskemiddelet i hvert utvalg, som beskrevet i tekstprotokollen. Klipp en pipettespiss for å samle perleslamen. Overfør den beregnede mengden perleslam til et 0, 5-milliliter rør, og aspirer vannet.Legg prøvene til røret som inneholder perlene, og inkuber i en nutator ved fire grader Celsius i en time. Overfør prøvene til et friskt rør som inneholder nye perler, og sørg for å forlate de gamle perlene bak. Inkuber igjen ved hjelp av de samme forholdene.Gjenta denne prosessen med å overføre og inkubere perlene to ganger. Etter dette, overfør prøven til et nytt rør som inneholder friske perler og inkubere ved å nutating over natten på fire grader Celsius. Neste dag fjerner du prøven fra perlene og sentrifugen ved 16 000 ganger g og fire grader Celsius i 10 minutter for å pellet de uoppløselige proteinaggregatene.Gjenopprett det overnaturlige, og bestem den endelige lipidkonsentrasjonen ved flytende scintillasjonstelling, som beskrevet i tekstprotokollen. Til å begynne med, bringe donor og acceptor proteoliposomer til en konsentrasjon på 0,15 millimolar hver i A100 inneholder glyserol, beta-mercaptoetanol, EDTA, og magnesiumklorid. Overfør hver reaksjon til en brønn i en flat 96-brønnsplate egnet for fluorescenslesing, og sørg for å forberede minst fire reaksjoner, inkludert en triplikate og en ikke-GTP negativ kontroll.Plasser platen i en forvarmet plateleser ved 37 grader Celsius. Mål NBD-fluorescensen hvert minutt i fem minutter. Deretter legger du til fem millimolar GTP for å indusere fusjon.Mål NBD-fluorescensen hvert minutt i én time ved hjelp av samme eksitasjon og utslipp som før. Etter dette legger du til fem mikroliter på 2,5% n-Dodecyl beta-D-maltoside til brønnene for å oppløse proteoliposomene, og måle maksimal NBD-fluorescens hvert minutt i 15 minutter ved hjelp av samme eksitasjon og utslipp. I denne studien blir rekombinant Drosophila atlastin renset og rekonstituert til forhåndsformede liposomer.Effektiviteten av atlastin rekonstituering bestemmes av flytende rekonstituerte proteoliposomer i en iohexol seponert gradient. Prøver av topp-, mellom- og bunngradientlag høstes og analyseres av SDS-PAGE og Coomassie-farging. Kvantifiseringen av gelen ved densitometri viser en svært høy effektivitet av rekonstituering med ubetydelige tap, med 96% av det totale proteinet som finnes som proteoliposomer som fløt til det øverste laget.Mindre enn 1% av proteinet er ikke rekonstituert og funnet i det midterste laget, og bare 3% er ukonstituert eller aggregert og sedimentert til bunnlaget. Orienteringen av atlastin etter rekonstituering kvantifiseres av trombinspaltingsanalyser. Prøver analyseres med SDS-PAGE og Coomassie farging og kvantifisert av tettsitometri.Det meste av det rekonstituerte proteinet er spaltet, med bare 7% beskyttet mot protease. Kinetikken og omfanget av atlastinmediert proteoliposom fusjon analyseres av lipidblandingsanalyser. En inkubasjon på fem minutter utføres før du induserer fusjon med GTP på nulltidspunktet.Etter en time ble n-Dodecyl beta-D-maltoside lagt til for å løse proteoliposomene og få maksimal fluorescerende resonansoverføringsutgivelse. Fusjonen maksimal i løpet er sett på å være 11% av maksimal fluorescens. Lipider oppløses i kloroform.Når du forbereder lipidblandingene, sørg for å gjøre dette raskt, på en kjemisk hette og på is for å unngå fordampning. Det er mulig å analysere atlastin proteoliposomer ved mikroskopi for å visualisere effekten av et membrananker på liposometform og størrelse. Denne metoden har blitt utvidet til å studere andre membran-forankret proteiner og hvordan oppfører seg i en modell lipid bilayer.Denne protokollen bruker titrerte lipider for å kvantifisere lipidblandinger. Sørg for å ta de nødvendige forholdsregler når du arbeider med radioaktive materialer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel uten lynraske rekonstituering membran proteiner i Lipid Bilayers bruker Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Borstemmaskin immobilisert metall affinitet Ture, rekonstituering og analysen av en Polyhistidine merket Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolere og innlemme lys-fangst antenner fra slektene Cyclotella Meneghiniana i liposomer med Thylakoid lipider

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, en ett-trinns innlemmelse av membran proteiner i Biotinylated Peptidiscs for strømlinjeformet protein bindende analyser

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullt behandlet rekombinant KRAS4b: isolere og karakteriserer Farnesylated og denaturert protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...