Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Мы благодарим доктора Майкла Стерна и его лабораторию за их понимание и обратную связь по атластинам, связанным с проектами. Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук (R01GM101377) и Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (R01NS102676).

1. Очистка GST-DAtl-His8
<ol><li>
Выражение белка и препарат лицизм
	<ol>
<li>Преобразуйте BL21 (DE3) E. coli с конструкцией GST-DAtl-His8 в pGEX4-T32 и выберите на пластине ампициллина.</li>
		<li>Выберите один трансформировать и привить 5 мл LB и ампициллин (5 л 100 мг/мл ампициллин) в 14 мл культуры трубки и ...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

Методы здесь разграничены эффективный метод очистки, восстановления и измерения термоядерного синтеза активности рекомбинантного аластин. Для обеспечения высоких урожаев функционального атластина необходимо рассмотреть некоторые критические шаги. Выражение атласина должно быть с...

Мембранный синтез является критическим процессом во многих биологических реакциях. При биологических условиях слияние мембран не является спонтанным и требует специализированных синтеза белков для катализировать такие реакции1. ER гомотипический мембранный синтез опосредования у животных динамина связанных GTPase атластина2. Роль Аластина в гомотипическом синтезе имеет основополагающее значение для трехсторонних узлов в периферийных ER, который представляет собой большую взаимосвязанную сеть труб, которые простираются по всей клетке. Аластины имеют сохраненную морфологию домена, состоящую из большого GTPase, три спирали расслоение среднего домена, гидрофобный якорь мембраны, и короткий цитоплазмический C-терминал хвост3. Исследования в пробирке с рекомбинантным дрозофила атластина показали, что при восстановлении липосомы, он сохраняет свои фузогенные свойства. Другие аластины, в том числе человеческие омологи, не смогли резюмировать синтез в пробирке. Мы описываем здесь методологию для очищения GST и поли-гистидина помечены рекомбинантных Drosophila atlastin, восстановление его липосомы, и отслеживание слияния.
Изучение мембранного синтеза в пробирке представляет собой проблему, как фусогенные белки, как правило, мембраны якорь. Для того, чтобы изучить их, необходимо воссоздать их в модель липидных двухслойных. Большие униламеллярные пузырьки (LUV) являются полезным инструментом для изучения взаимодействия липидных белков. Мы представляем здесь систему, чтобы сделать LUVs различных липидных композиций для восстановления белка и синтеза анализов. Восстановление интегральных белков в LUVs может быть достигнуто с помощью различных методов, включая, органический растворитель опосредоченной реконституции, механические механизмы, или моющее средство при содействии восстановления4. Мы представляем здесь метод для воссоздания Drosophila атластина в предварительно сформированные липосомы путем удаления моющего средства. Преимущества этого метода восстановления включают высокие урожаи восстановления и правильную ориентацию атласина в липидном двухслойном. Кроме того, с помощью этого метода, белок не высушивается или подвергается воздействию органических растворителей, тем самым сохраняя структуру и функцию. Среди его недостатков, наличие моющих средств не может быть идеальным для всех белков и окончательные протеолипосомы могут иметь некоторые включены моющего средства в липидный двуслой. Дальнейший диализ может быть использован для устранения большего количества моющего средства. Тем не менее, диализ может занять много времени и, следовательно, может привести к потере белковой активности.
Оценка синтеза активности атластин может быть определена липидных смешивания анализы, как ранее описано2. Здесь мы разграничив метод измерения атластина опосредованного синтеза через N-(7-нитробенц-2-окса-1,3-диазол-4-ил (NBD)/Лиссамин родамин-B сульфонил (родамин) помечены липидов. Этот ассеид требует слияния доноров (помеченных) протеолипосом и приемотеля (немаркированных) протеолипосом. Освобождение FRET может быть измерено во время реакции как разбавление пары донора-приемника от "помеченных" липосом до "немаркированных" липосом в результате перемешивания липидов во время мембранного синтеза (Рисунок 1)5. Хотя этот показатель служит прокси для мембранного синтеза, он ограничен в различении мембранного синтеза и гемифузии, состояние, в котором смешиваются только внешние листовки. Для решения этой проблемы, альтернативой является внешняя листовка закалки NBD dithionite. Следуя той же методологии, как NBD / родамин липидных анализов, при закалке внешней листовки любой релиз NBD FRET путем слияния будет связано с внутренней листовки смешивания8.
Альтернативные анализы синтеза внутренним ваквистым содержанием смешивания адрес полного слияния только5. Примерами этого являются анализы тербия (Тб)/дипиколининовой кислоты (DPA) и анализы аминонафталенной трисульфонной кислоты (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) бромид (DPX). В Тб/ДПА анализы, пул липосом с инкапсулированным Тб смешиваются и сливается с липосомы с инкапсулированными DPA; при слиянии, флуоресценция увеличивается за счет внутренней передачи энергии от DPA к ТБ в рамках «Tb (DPA)3»3- хелатоэнсивный комплекс6. В отличие от этого, для ANTS / DPX анализы, ANTS флуоресценция угасает DPX7. В то время как эти системы решают проблему внутреннего смешивания содержимого, для удаления неинкапсулированных реагентов требуется более углубленное приготовление липосом, а также непреднамеренное взаимодействие флюорофоров.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

Мембранный синтез является решающим процессом в эукариотической клетке. Специализированные белки необходимы для катализа синтеза. Аластины являются эндоплазмическими белками-резидентами (ER), замешанными в гомотипическом слиянии ER. Мы подробно здесь метод очистки глутатион S-трансферазы (GST) и поли-гистидин помечены Drosophila atlastin двумя раундами сродства хроматографии. Изучение реакции синтеза в пробирке требует очищенных белков синтеза, которые должны быть вставлены в липидный двухслойный. Липосомы являются идеальными модельными мембранами, так как липидный состав и размер могут быть скорректированы. С этой целью мы описываем метод восстановления моющего средства для удаления дрозофилы атластин в предварительно сформированные липосомы. Хотя несколько методов восстановления доступны, восстановление моющих средств удаления имеет ряд преимуществ, которые делают его пригодным для атластинов и других подобных белков. Преимуществом этого метода является высокая урожайность восстановления и правильная ориентация восстановленного белка. Этот метод может быть распространен на другие мембранные белки и для других применений, которые требуют протеолипомы. Кроме того, мы описываем FRET основе липидных смешивания ассси протеолипомы, используемые в качестве измерения мембранного синтеза.

Эффективность восстановления атластин представлена на рисунке 2. Восстановленные протеолипосомы плавали в иохесоловом градиенте. Неинкорпорированный белок был отложен в нижнем слое (B) или в среднем слое (M). Восстановленный белок будет плавать к верхнему слою (T). Образц...

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Биологический мембранный синтез катализируется специализированными белками синтеза. Измерение фусогенных свойств белков может быть достигнуто путем липидных анализов смешивания. Мы представляем метод очистки рекомбинантного дрозофила атластина, белка, который опосредует гомотипическое слияние ER, воссоздавая его до предварительно сформированных липосом и тестируя на способность синтеза.

Детергент-помощь Восстановление рекомбинантных Drosophila Аластин в липосомы для Липид-смешивания анализы

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Протокол восстановления и синтеза, описанный здесь, является эффективным способом изучения мембранных белков в модели липидного бислойного и липидного смешивания белками синтеза. Здесь мы описываем моющее средство с помощью восстановления рекомбинантных drosophila атластин, ER синтез белка, в предварительно фосфатидилхолин липосомы. Слияние атластин протеолипосом затем измеряется FRET основе липидно-смешивания анализа.Одним из ключевых преимуществ восстановления с помощью моющего средства является то, что белок в моющих средствах не подвергается высыханию или растворителям. Мы также показываем здесь, что реконституционная ориентация атластина очень эффективна. Еще одним преимуществом анализа липидного смешивания на основе FRET является то, что липосомы не должны быть загружены с любым красителем, и нет необходимости в каких-либо дополнительных шагов диализа.Для начала этой процедуры подготовьте запасы липидной смеси в хлороформе, как указано в текстовом протоколе. Добавьте одну микрокурию на миллилитр DPPC в липидные смеси, убедившись, что зарезервировать по крайней мере восемь микролитров этого запаса. Перенесите нужное количество липидных смесей в кремневые стеклянные трубки.Затем высушите липидные смеси под нежным потоком азотного газа в течение примерно 10 минут, пока не будет видно больше хлороформа. Высушите полученную липидную пленку дальше в децикаторе, пылесосив в течение 30 минут. После этого добавьте достаточноЕ количество A100 с 10%глицеролом, двухмилимолейным 2-меркаптоэтаноном и одномимимолярной ЭДТА в липидную пленку, чтобы вернуть концентрацию до 10 миллимолей.Resuspend липидной пленки, вихри слегка в течение 15 минут при комнатной температуре. Заморозить гидратированные липиды в жидком азоте. Чтобы разморозить липосомы, пусть раствор сидит при комнатной температуре в течение 30 секунд, а затем передать их обратно в воду для более быстрого оттаивания.Повторите этот цикл замораживания-оттепели в общей сложности 10 раз. После этого используйте мини-экструдер для прохода липидов через поликарбонатные фильтры, с пор размером 100 нанометров, 19 раз. Для определения общей концентрации липосом липидов добавьте четыре микролитера липидного бульона и лизосомы в три миллилитра сцинтилляционного коктейля.Измерьте среднее количество в минуту для запасов и липосом, и вычислите липосомную концентрацию, как указано в текстовом протоколе. Храните липосомы при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Во-первых, смешать соответствующее количество буфера, дополнительного моющего средства и белка в 0,5-миллилитровую трубку, как указано в текстовом протоколе.Быстро добавляйте липосомы и сразу вихрем в течение пяти секунд гомогенизируйте смесь. Инкубировать реакцию в nutator при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Во время этой инкубации, вес 0,2 грамма полистирола адсорбент бисера и передать их в трубку микроцентрифуг.Добавить один миллилитр метанола в трубку, и смешать в течение одной минуты, чтобы дегазать бисер. Затем, аспирировать метанол с 21-го калибра или выше иглы. Чтобы начать мыть бисер, добавьте к ним воду.Пусть бисер смешать с водой в течение пяти минут, а затем аспирировать воду. Повторите этот процесс мытья воды четыре раза. После этого добавьте воду, чтобы принести полистирол адсорбент суспензии до объема одного миллилитра, с окончательной концентрацией 0,2 грамма на миллилитр.Рассчитайте количество полистирола адсорбента, необходимого для адсорбировать все моющее средство в каждом образце, как указано в текстовом протоколе. Вырезать наконечник пипетки для сбора шарика суспензии. Перенесите вычисленное количество суспензии шарика в трубку объемом 0,5 миллилитров и оспирировать воду.Добавить образцы в трубку, содержащую бисер, и инкубировать в nutator при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Перенесите образцы в свежую трубку, содержащую новые бусы, убедившись, что оставить старые бусы позади. Инкубировать снова, используя те же условия.Повторите этот процесс переноса и инкубации бисера два раза. После этого перенесите образец в новую трубку, содержащую свежие бусы, и инкубировать, окутав на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день удалите образец из бисера и центрифуги при 16 000 г и 4 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать нерастворимые белковые агрегаты.Восстановите супернатант и определите окончательную концентрацию липидов путем подсчета жидких сцинтилляций, как указано в текстовом протоколе. Для начала довнесите донора и приемщика протеолифосом до концентрации 0,15 миллимоляра в A100, содержащей глицерол, бета-меркаптоэтанол, ЭДТА и хлорид магния. Передача каждой реакции на колодец в плоской пластине 96-колодец подходит для чтения флуоресценции, убедившись, что подготовить по крайней мере четыре реакции, в том числе тройной и не-GTP отрицательный контроль.Поместите тарелку в разогретую плиту при 37 градусах по Цельсию. Измерьте флуоресценцию NBD каждую минуту в течение пяти минут. Затем добавьте пятимимолярный GTP, чтобы вызвать слияние.Измерьте флуоресценцию NBD каждую минуту в течение одного часа, используя то же возбуждение и выбросы, что и раньше. После этого добавьте пять микролитров 2.5%n-Dodecyl бета-D-мальтозида к скважинам, чтобы растворить протеолипосомы, и измеряйте максимальную флуоресценцию NBD каждую минуту в течение 15 минут, используя то же возбуждение и выбросы. В этом исследовании рекомбинантный атлас Drosophila очищается и воссоздается в предварительно сформированные липосомы.Эффективность восстановления атластина определяется плавающими восстановленными протеолипосомами в iohexol разрывном градиенте. Образцы верхних, средних и нижних градиентных слоев собирают и анализируются Окрашиваниями SDS-PAGE и Coomassie. Количественная оценка геля по денситометрии показывает очень высокую эффективность восстановления с незначительными теряет, с 96% от общего белка, найденных в качестве протеолипосомы, которые плавали в верхний слой.Менее 1% белка неконституционируется и содержится в среднем слое, и только 3% неконституционированных или агрегированных и отложений в нижний слой. Ориентация атластина после восстановления измеряется анализами тромбина. Образцы анализируются с SDS-PAGE и Coomassie окрашивания и количественно денситометрии.Большая часть восстановленного белка расщепляется, и только 7% защищены от протеазы. Кинетики и степень атластин-опосредованного синтеза протеолипосомы анализируются с помощью липидных анализов. Инкубация в пять минут выполняется перед индуцированием синтеза с GTP в точке нулевого времени.Через час, n-Dodecyl бета-D-мальтозид был добавлен для solubilize протеолипосомы и получить максимальный флуоресцентный резонанс передачи релиз. Максимум синтеза в пробеге считается 11% от максимальной флуоресценции. Липиды растворяются в хлороформе.При подготовке липидных смесей, убедитесь, что сделать это быстро, на химическом капюшоне, и на льду, чтобы избежать испарения. Можно проанализировать атластин протеолифосомы с помощью микроскопии, чтобы визуализировать влияние мембранного якоря на липосомную форму и размер. Этот метод был расширен для изучения других мембранных якорных белков и как ведут себя в модели липидного билейера.Этот протокол использует титрованная липиды для количественной оценки липидных смесей. Убедитесь в том, чтобы принять необходимые меры предосторожности при работе с радиоактивными материалами.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Моющее бесплатно сверхскоростной воссоздание мембранных белков в липидных бислоев с помощью дополнительных заряженные Proteoliposomes Fusogenic.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop иммобилизованных металла аффинной хроматографии, воссоздание и меткой, Assay Polyhistidine Metalloenzyme для студентов лаборатории

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Изоляция и включения светособирающего антенны от диатомовые водоросли Cyclotella Meneghiniana в липосомах с липидами тилакоидов

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

В пробирке Воссоздание самоорганизующихся структур белков на поддерживаемых липидных бислоев

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Восстановление клеточного цикла колебаний в микроэмульсий свободных клеток Xenopus яйцо экстрактов

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Pepti'uick, одноступенчатая инкорпорация мембранных белков в биотинилатированные пептидиски для оптимизированных белковых связывающих анализов

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: изолирование и характеристика фарнезилатного и метилового белка

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...