Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Vi tackar Dr Michael Stern och hans labb för deras insikter och feedback på atlastin relaterade projekt. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för allmän medicin vetenskap [R01GM101377] och det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke [R01NS102676].

1. rening av GST-DAtl-His8
<ol><li>
Protein uttryck och lysat preparat
	<ol>
<li>Förvandla BL21 (DE3) E. coli med gst-datl-His8-konstruktionen i PGEX4-T32 och välj på en ampicillin-platta.</li>
		<li>Välj en enda transformant och Inokulera 5 mL LB + ampicillin (5 μL 100 mg/mL ampicillin) i ett 14 mL odlings rör och Kubera vid 25 ° c med skakning vid 200 RPM för 6-8 h. Anmärkning: På grund av läckande uttryck, är det inte rekommenderat att Inkubera vid...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

Metoderna här avgränsar en effektiv metod för rening, beredning och mätning av fusions aktivitet av rekombinant atlastin. För att säkerställa hög avkastning av funktionella atlastin vissa kritiska steg måste övervägas. Uttryck av atlastin måste göras vid låga temperaturer (16 ° c) för att undvika agg regering och man bör sträva efter en slutlig koncentration mellan 0,4 – 1,5 mg/mL. Mycket utspädd protein kommer inte att rekonstitueras optimalt vid ett 1:400 protein-till lipidförhållande. Rekonstitu...

Membran fusion är en kritisk process i många biologiska reaktioner. Under biologiska förhållanden är membran fusion inte spontant och kräver specialiserade fusions proteiner för att katalysera sådana reaktioner1. ER homotypisk membran fusion medieras hos djur av dynamin relaterade GTPase atlastin2. Atlastin roll i homotypisk fusion är grundläggande för tre-vägs korsningar i perifera ER, som utgör ett stort sammanlänkat nätverk av tubuli som sträcker sig över hela cellen. Atlastins har en konserveras domän morfologi bestående av en stor GTPase, en tre Helix bunt mellersta domän, en hydrofoba membran ankare, och en kort Cytoplasmatisk C-Terminal svans3. In vitro-studier med rekombinant Drosophila atlastin har visat att när rekonstitueras till liposomer, den behåller sina fusogenic egenskaper. Andra atlastiner, inklusive humana homostockar, har inte kunnat rekapitulera fusion in vitro. Vi beskriver här en metod för rening av en gst och poly-histidin taggade rekombinant Drosophila atlastin, beredning det till liposomer, och test metoder fusion.
Att studera membran fusion in vitro presenterar en utmaning som fusogenic proteiner har vanligt vis ett membran ankare. För att studera dem, är det nödvändigt att rekonstruera dem i modell lipidbilayers. Stora unilamellar blåsor (luv) är ett användbart verktyg för att studera lipidproteininteraktioner. Vi presenterar här ett system för att göra LUVs av olika lipidsammansättningar för protein beredning och fusion analyser. Rekonstituering av integralproteiner till LUVs kan uppnås genom en mängd olika metoder, inklusive organisk vätskemedierad beredning, mekaniska mekanismer, eller rengörings medels assisterad beredning4. Vi presenterar här en metod för beredning av Drosophila atlastin i förformade liposomer genom att ta bort rengörings medel. Fördelar med denna beredning metod inkluderar hög upplösning avkastning och korrekt orientering av atlastin i lipidbilayer. Dessutom, genom denna metod, är proteinet inte torkas eller utsätts för organiska lösnings medel därigenom bibehålla struktur och funktion. Bland dess nack delar, kan förekomsten av rengörings medel inte vara idealisk för alla proteiner och den slutliga proteoliposomer kan ha några inbyggda tvätt medel i lipidbilayer. Ytterligare dialys kan användas för att eliminera mer av rengörings medlet. Dialys kan dock ta lång tid och kan därför leda till förlust av protein aktivitet.
Bedöma atlastin s fusion aktivitet kan bestämmas genom lipid blandning analyser som tidigare beskrivits2. Här, vi avgränsa en metod för att mäta atlastin medierad fusion genom N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/lissamin rhodamine-B Metylsulfonylmetan (rhodamine) märkta lipider. Denna analys kräver fusion av givare (märkt) proteoliposomer och tagaren (omärkta) proteoliposomer. En FRET release kan mätas under reaktionen som utspädning av en donator-Acceptor par från "märkt" liposomer till "omärkta" liposomer som ett resultat av lipidblandning under membran fusion (figur 1)5. Även denna analys fungerar som en proxy för membran fusion, det är begränsad i att skilja mellan membran fusion och hemifusion, ett tillstånd där endast de yttre broschyrer blanda. För att ta itu med detta problem är ett alternativ en ytterbipacksedel som slätar ut NBD med dithionit. Efter samma metod som för att blanda in NBD/Rhodamin-lipidblandningar, kommer alla NBD FRET-frigörningar genom fusion att på insidan av bipacksedeln blandas8.
Alternativa fusion analyser av inre vattenhaltiga innehåll blandning adress full fusion endast5. Exempel på detta är Terbium (TB)/dipicolinic Acid (DPA) analyser och Aminonaftalen trisulfonic Acid (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) bromid (DPX)-analyser. I TB/DPA analyser, en pool av liposomer med inkapslad TB blandas och smält med liposomer med inkapslad DPA; vid fusion ökas fluorescens via intern energi överföring från DPA till TB inom [TB (DPA)3]3- kelering Complex6. Däremot för ANTS/DPX-analyser, är ANTS fluorescens kylda av DPX7. Medan dessa system adress inre innehåll blandning, mer djupgående beredning av liposomer krävs för avlägsnande av icke-inkapslade reagenser, samt oavsiktlig interaktion av fluorophores.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

Membran fusion är en avgörande process i den eukaryotiska cellen. Specialiserade proteiner är nödvändiga för att katalysera fusion. Atlastiner är endoplasmatiska Retikulum (ER) bosatta proteiner inblandade i homotypisk fusion av ER. Vi specificerar här en metod för rening av en glutation S-transferas (gst) och poly-histidin taggade Drosophila atlastin av två rundor av affinitet kromatografi. Att studera fusions reaktioner in vitro kräver att renade fusions proteiner sätts in i lipidbilayer. Liposomer är idealiska modell membran, som lipidsammansättning och storlek kan justeras. För detta ändamål beskriver vi en metod för beredning genom att ta bort rengörings medel för Drosophila atlastin i förformade liposomer. Även om flera rekonstitutionsmetoder finns tillgängliga har rekonstituering genom borttagning av rengörings medel flera fördelar som gör den lämplig för atlastiner och andra liknande proteiner. Fördelen med denna metod inkluderar en hög rekonstitutionsavkastning och korrekt orientering av det rekonstituerade proteinet. Denna metod kan utvidgas till andra membran proteiner och för andra tillämpningar som kräver proteoliposomer. Dessutom beskriver vi en FRET baserad lipid blandning test av proteoliposomer används som ett mått på membran fusion.

Effektiviteten hos atlastin-beredning presenteras i figur 2. Rekonstituerade proteoliposomer flödes i en diskontinuerlig gradient av Johexol. Oinkorporerat protein sedimenterades i botten skiktet (B) eller i mellanskiktet (M). Rekonstituerat protein skulle flyta till det översta lagret (T). Prover av gradienten skördades och analyserades av SDS-PAGE och Coomassie färgning. Kvantifieringen av gelen genom densitometri visar en mycket hög verknings grad av beredning med försumbar förlora...

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biologisk membran fusion katalyseras av specialiserade fusions proteiner. Att mäta de fusogena egenskaperna hos proteiner kan uppnås genom lipidblandningstester. Vi presenterar en metod för rening av rekombinant Drosophila atlastin, ett protein som förmedlar homotypisk fusion av ER, beredning av den till förformade liposomer, och testning för fusions kapacitet.

Rengörings medel-assisterad beredning av rekombinant Drosophila Atlastin i liposomer för lipid-blandning assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Den rekonstitution och fusion protokoll som beskrivs här är ett effektivt sätt att studera membran-bundna proteiner i en modell lipid bilayer och lipid blandning av fusion proteiner. Här beskriver vi en tvättmedel-assisterad rekonstitution av rekombinanta Drosophila atlastin, en ER fusion protein, i preformed fosfatidylkolin liposomer. Fusion av atlastinprooposomer mäts sedan genom en FRET-baserad lipidblandningsanalys.En av de viktigaste fördelarna med tvättmedelsassisterad rekonstitution är att proteinet i tvättmedel inte utsätts för torkning eller lösningsmedel. Vi visar också här att rekonstitutionsorientering av atlastin är mycket effektiv. En annan fördel med FRET-baserade lipid-blandning analys är att liposomer inte behöver laddas med något färgämne, och det finns inget behov av några extra dialyser steg.För att påbörja detta förfarande, förbereda lipidblandningen lager i kloroform, som beskrivs i textprotokollet. Lägg till en mikrokuri per milliliter av DPPC till lipidblandningar, se till att reservera minst åtta mikroliter av detta bestånd. Överför den önskade mängden av lipidblandningarna till flintglasrör.Torka sedan lipidblandningarna under en mild ström av kvävegas i cirka 10 minuter tills ingen mer kloroform syns. Torka den resulterande lipidfilmen ytterligare i en exsiccator genom att dammsuga i 30 minuter. Efter detta, tillsätt tillräckligt A100 med 10%glycerol, två-millimolar 2-merkaptoetanol, och en millimolar EDTA till lipidfilmen för att få koncentrationen tillbaka till 10 millimolar.Resuspend lipidfilmen genom att virvelsa lätt i 15 minuter vid rumstemperatur. Frys de hydrerade lipiderna i flytande kväve. Att tina liposomerna, låt lösningen sitta i rumstemperatur i 30 sekunder, sedan överföra dem tillbaka till vatten för snabbare upptining.Upprepa denna frys-töcykel totalt 10 gånger. Efter detta, använd en mini-extruder för att passera lipider genom polykarbonat filter, med en porstorlek på 100 nanometer, 19 gånger. För att bestämma den totala lipidkoncentrationen av liposomerna, tillsätt fyra mikroliter av lipidlager och lysosomer till tre milliliter av scintillationscocktail.Mät de genomsnittliga antalet per minut för lager och liposomer, och beräkna liposomkoncentrationen, som beskrivs i textprotokollet. Förvara liposomerna i fyra grader Celsius i upp till en vecka. Blanda först lämplig mängd buffert, extra rengöringsmedel och protein i ett 0,5-milliliterrör, enligt textprotokollet.Tillsätt snabbt liposomerna, och omedelbart virvel i fem sekunder för att homogenisera blandningen. Inkubera reaktionen i en mutter vid fyra grader Celsius i en timme. Under denna inkubation, väg ut 0,2 gram polystyren adsorbent pärlor och överföra dem till ett mikrocentrifugrör.Tillsätt en milliliter metanol till röret, och blanda i en minut för att avgasa pärlorna. Därefter aspirera metanol med en 21-gauge eller högre nål. För att börja tvätta pärlorna, tillsätt vatten till dem.Låt pärlorna blandas med vattnet i fem minuter, sedan aspirera vattnet. Upprepa denna vattentvätt process fyra gånger. Efter detta, tillsätt vatten för att få polystyren adsorbent pärla slurry till en volym av en milliliter, med en slutlig koncentration av 0,2 gram per milliliter.Beräkna mängden polystyren adsorbent pärlor som behövs för att adsorb alla tvättmedel i varje prov, som beskrivs i textprotokollet. Klipp en pipett spets för att samla pärla slurry. Överför den beräknade mängden pärlslam till ett 0,5-milliliter rör, och aspirera vattnet.Tillsätt proverna till röret som innehåller pärlorna, och inkubera i en mutter vid fyra grader Celsius i en timme. Överför proverna till ett nytt rör som innehåller nya pärlor, se till att lämna de gamla pärlorna bakom. Inkubera igen med samma villkor.Upprepa denna process för överföring och inkubering av pärlorna två gånger. Efter detta överför du provet till ett nytt rör som innehåller färska pärlor och inkuberar genom att nöta över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, ta bort provet från pärlorna och centrifug vid 16, 000 gånger g och fyra grader Celsius i 10 minuter för att pelleta de olösliga proteinaggregaten.Återvinna supernatanten, och bestäm den slutliga lipidkoncentrationen genom vätskescintillationsräkning, som skisseras i textprotokollet. Till att börja, föra givaren och acceptor proteoliposomes till en koncentration av 0,15 millimolar vardera i A100 som innehåller glycerol, beta-merkaptoetanol, EDTA, och magnesiumklorid. Överför varje reaktion på en brunn i en platt 96-brunnsplatta som lämpar sig för fluorescensavläsning, och se till att förbereda minst fyra reaktioner, inklusive en tre exemplarisk och en no-GTP-negativ kontroll.Placera plattan i en förvärmd tallriksläsare vid 37 grader Celsius. Mät NBD fluorescensen varje minut i fem minuter. Lägg sedan till fem millimolar GTP för att inducera fusion.Mät NBD-fluorescensen varje minut under en timme med samma excitation och emission som tidigare. Efter detta, tillsätt fem mikroliter av 2,5%n-Dodecyl beta-D-maltoside till brunnarna för att lösa upp proteoliposomerna, och mät den maximala NBD fluorescens varje minut i 15 minuter med hjälp av samma excitation och emission. I denna studie, rekombinanta Drosophila atlastin renas och rekonstitueras i preformed liposomer.Effektiviteten hos atlastin rekonstitutionen bestäms av flytande rekonstituerade proteoliposomer i en iohexol diskontinuerlig gradient. Prover av de övre, mellersta och nedre gradientskikten skördas och analyseras av SDS-PAGE och Coomassie-färgning. Kvantifieringen av gelen genom densitometri visar en mycket hög effektivitet av rekonstitution med försumbara förlorar, med 96%av det totala proteinet som finns som proteoliposomes som flöt till det översta lagret.Mindre än 1% av proteinet är unreconstituted och finns i mellanskiktet, och endast 3%är unreconstituted eller aggregerade och sedimenteras till bottenskiktet. Orienteringen av atlastin efter rekonstitution kvantifieras genom trombin klyvning analyser. Prover analyseras med SDS-PAGE och Coomassie färgning och kvantifieras av densitometri.De flesta av de rekonstituerade proteinet klyvs, med endast 7% skyddas från proteas. Kinetiken och omfattningen av atlastin-medierad proteoliposom fusion analyseras genom lipid-blandning analyser. En inkubation på fem minuter utförs innan fusion med GTP induceras vid nolltidpunkten.Efter en timme lades n-Dodecyl beta-D-maltoside till för att solubilisera proteoliposomerna och få den maximala överföringsutgåvan av fluorescylresonans. Fusions maximum i loppet ses vara 11%av maximal fluorescens. Lipider löses i kloroform.När du förbereder lipidblandningar, se till att göra detta snabbt, på en kemisk huva, och på is för att undvika all avdunstning. Det är möjligt att analysera atlastinprooposomer genom mikroskopi för att visualisera effekterna av ett membranankare på liposomform och storlek. Denna metod har utökats för att studera andra membran-förankrade proteiner och hur de beter sig i en modell lipid bilayer.Detta protokoll använder titrerade lipider för att kvantifiera lipidblandningar. Se till att vidta nödvändiga försiktighetsåtgärder när du arbetar med radioaktiva material.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Beredning av Nukleosomer med differentiellt isotopmärkt Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Bänkmonterade orörlig metall affinitetskromatografi, beredning och analys av en Polyhistidine Taggad Metalloenzyme för grundutbildning laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolera och införliva ljus-skörd antenner från kiselalger Cyclotella Meneghiniana i liposomer med tylakoida lipider

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria Xenopus ägg extrakt

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, en enstegs inkorporering av membranproteiner i biotinylerade Peptidiscs för strömlinjeformade Proteinbindnings analyser

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullständigt bearbetat rekombinant KRAS4b: isolerar och karakteriserar det farnesylerade och metylerade proteinet

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...