Name: detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Dr. Michael Stern ve laboratuvarına, atlastin ile ilgili projelerdeki görüşleri ve geribildirimlerine teşekkür ederiz. Bu çalışma ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü [R01GM101377] ve nörolojik bozukluklar ve Inme Ulusal Enstitüsü tarafından destekleniyordu [R01NS102676].

1. GST-DAtl-His8 arıtma
<ol><li>
Protein ifadesi ve lysate hazırlığı
	<ol>
<li>BL21 (DE3) E. coli 'yi PGEX4-T32 ' de GST-Datl-His8 yapısı ile dönüştürün ve bir ampikilin plakasını seçin.</li>
		<li>14 mL 'Lik bir kültür tüpünde 5 mL LB + ampisilin (5 μL 100 mg/mL ampisilin) olarak tek bir transformant seçin ve 6-8 h için 200 rpm 'de sallayarak 25 °C ' de inkük et. Not: Sızdırmaz ifade nedeniyle, yüksek sıcaklıklarda inkübe etmek tavs...

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+membrane+fusion.">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin.">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li><li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-dependent+membrane+fusion.">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li><li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes:+application+to+energy-transducing+membrane+proteins.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li><li>D&#252;zg&#252;ne&#351;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion.">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li><li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion:+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents.">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li><li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes.">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li><li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion.">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li><li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive,+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution.">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li><li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large,+unilamellar+vesicles.">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li><li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+(prepared+by+reverse-phase+evaporation)+by+Triton+X-100,+octyl+glucoside,+and+sodium+cholate.">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li><li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines.">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association.">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li><li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+&#945;-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain.">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the &#945;-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li><li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p.">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407 (2016).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li><li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer.">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li></ol>

Buradaki Yöntemler, rekombinant atlastin 'in füzyon aktivitesini arındırmak, reconstituting ve ölçmek için verimli bir yöntem tarif ederler. Bazı kritik adımlarla fonksiyonel atlastin yüksek verim sağlamak için dikkate alınmalıdır. Atlastin ifadesi, toplama işleminden kaçınmak için düşük sıcaklıklarda (16 °C) yapılmalıdır ve bir adet 0.4 – 1.5 mg/mL arasında son bir konsantrasyon hedeflemelisiniz. Çok seyreltilmiş protein bir 1:400 protein lipid oranı en iyi şekilde reconstituted olmay...

Membran füzyon birçok biyolojik reaksiyonda kritik bir süreçtir. Biyolojik koşullarda, membran füzyon spontan değildir ve bu tür reaksiyonlar katalizleştirmek için özel füzyon proteinleri gerektirir1. ER homotipik membran füzyon, Dynamin ile ilgili GTPase atlastin2' ye göre hayvanlarda aracılık edilir. Homotipik füzyon atlastin rolü periferik er üç yönlü kavşak için temel, hücre boyunca uzatmak tübüllerin büyük bir bağlantılı ağ oluşturmaktadır. Atlastins, büyük bir GTPase, üç sarmal paket orta etki alanı, hidrofobik membran çapa ve kısa sitoplazmik C-Terminal kuyruğu3' ten oluşan bir korunması alan morfolojisine sahiptir. İn vitro çalışmalar rekombinant Drosophila atlastin ile lipozomlar için reconstituted, onun fusogenic özelliklerini korur göstermiştir. İnsan homologlar da dahil olmak üzere diğer atlastins, Fusion in vitro reapitulate mümkün olmamıştır. Biz burada bir GST ve poli-histidin etiketli rekombinant Drosophila atlastin arındırmak için bir metodoloji tarif, lipozomlar için reconstituting, ve füzyon iddia.
Membran füzyon içinde vitro eğitim fusogenik proteinler genellikle bir membran çapa sahip olarak bir meydan okuma sunar. Onları incelemek için, onları model lipid bilayers içine yeniden oluşturmak için gereklidir. Büyük unilamellar veziküller (LUV) lipid protein etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır. Biz burada bir sistem protein reanayasası ve füzyon assays için farklı lipid bileşimleri LUVs yapmak için sunuyoruz. Integral proteinlerin luvs içine yeniden oluşturulması da dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir, organik solvent aracılı reanayasa, mekanik mekanizmalar, veya deterjan destekli sulandırma4. Biz burada bir yöntem sunuyoruz Drosophila atlastin ön biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan kaldırma. Bu reanayasa yönteminin avantajları yüksek reanayasa verimi ve lipid bilayer içinde atlastin uygun oryantasyonu içerir. Ayrıca, bu yöntem sayesinde, protein kurutulmaz veya organik çözücülere maruz kalmaktadır, böylece yapı ve fonksiyon sürdürüyor. Dezavantajları arasında, deterjanların varlığı tüm proteinler için ideal olmayabilir ve son proteoliposomların lipid bilayer içinde bazı entegre deterjan olabilir. Daha fazla diyaliz daha fazla deterjan ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Ancak diyaliz uzun sürebilir ve bu nedenle protein aktivitesinin kaybına neden olabilir.
Atlastin 'in füzyon aktivitesinin değerlendirilmesi, daha önce açıklandığı gibi lipid karıştırma kavramında belirlenir2. Burada, biz N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-il (NBD)/Lissamine Rhodamine-B sülfonil (Rhodamine) etiketli lipidler yoluyla atlastin aracılı füzyon ölçmek için bir yöntem betimlemek. Bu tahlil donör (etiketli) proteoliposomes ve Acceptor (etiketlenmemiş) proteoliposomes füzyon gerektirir. Bir donörün seyreltmesi olarak reaksiyon sırasında bir FRET sürümü ölçülebilir – membran füzyon sırasında lipid karıştırma sonucunda "etiketli" lipozomlar "etiketlenmemiş" liderecede ' den alıcı çifti (Şekil 1)5. Bu tahlil membran füzyon için bir vekil olarak hizmet ederken, membran füzyon ve hemifüzyon arasında ayırt sınırlıdır, bir devlet nerede sadece dış broşürler karışımı. Bu sorunu gidermek için, alternatif olarak NBD 'nin dithionite tarafından dış broşür giderici olduğunu. NBD/Rhodamine lipid karıştırma gibi aynı metodoloji takip, dış broşürün füzyon tarafından herhangi bir NBD FRET serbest Quenching üzerine iç broşür karıştırma8nedeniyle olacaktır.
Alternatif füzyon iç sulu içerik karıştırma adresi tam füzyon sadece5tarafından görülmektedir. Bu örnekler Terbiyum (TB)/dipicolinik asit (DPA) deneyleri ve aminonaphthalene trisulfonik asit (karıncalar)/p-Xylene bis (pyridinium) bromür (DPX) deneyleri. TB/DPA 'da, kapsüllenmiş TB olan lipozomlar havuzu karışık ve kapsüllü DPA ile lipozomlar ile kaynaşıyor; Füzyon üzerine, floresans [TB (DPA)3]3- şelasyon kompleksi6içinde DPA 'dan TB 'ye dahili enerji aktarımı ile artar. Buna karşılık, ANTS/DPX için, ANTS floresans DPX7tarafından söndürülün. Bu sistemler iç içeriği karıştırırken, lipozomların daha derinlemesine hazırlanması, kapsüllenmeyen reaktiflerin kaldırılması ve fluorophorlerin istenmeyen etkileşimi için gereklidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep chromatography columns</td>
			<td>Biored</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x 75 mm Flint glass tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>608225-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7141 104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white plate</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>437796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anapoe X-100</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>9002-931-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell disrupter</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>Avestin Emulsiflex C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035P-10mg</td>
			<td>DOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Research organics inc.</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Complete protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z373400&#160;</td>
			<td>Liposofast Basic Extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Akta Prime liquid chromatography system</td>
			<td>GE Pharmacia</td>
			<td>8149-30-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione agarose beads</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G4510-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>GX0185-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36051-31-7</td>
			<td>Guanosine 5&#39; triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, acid free</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>5330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>fluka</td>
			<td>5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17040801</td>
			<td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iohexol</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corporation</td>
			<td>AN 7050 BLK</td>
			<td>Accudenz/Nycodenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Research products international corp.</td>
			<td>I56000-100.0</td>
			<td>IPTG, dioxane free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione reduced</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Omnisolv</td>
			<td>MX0488-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>NBD-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>21950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonpolar polystyrene adsorbent beads</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>SM2 Biobeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima LE80K Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine, L-&#945;-dipalmitoyl [choline methyl-3H]</td>
			<td>ARC</td>
			<td>ART0284</td>
			<td>Titriated lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>TECAN infinite M200 plate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>151944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>236495</td>
			<td>Rh-DPPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-272</td>
			<td>Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>592928</td>
			<td>Fast turn cap Mini Poly-Q Vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1063-1kU</td>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex 9 to 13mm Tube Holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-138</td>
			<td>Insert for vortexing flint glass tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Insert Retainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-132</td>
			<td>Retainer needed for vortex tube holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2.235074</td>
			<td>Vortex Genie 2 model G560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>444203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detergent-assisted reconstitution of recombinant drosophila atlastin into liposomes for lipid-mixing assays

Membran füzyon ökaryotik hücrede önemli bir süreçtir. Özel proteinler füzyon katalizörler için gereklidir. Atlastins, er 'in homottifik füzyon içinde bulunan endoplazmik retikulum (er) yerleşik proteinleridir. Biz detay burada bir glutatyon S-transferase (GST) ve Poly-histidin temizleyerek için bir yöntem benzeşme Kromatografi iki tur tarafından Drosophila atlastin etiketlenmiş. Füzyon reaksiyonları içinde vitro eğitim, lipid bilayer içine yerleştirilmek üzere arıtılmış füzyon proteinlerini gerektirir. Lipozomlar ideal model membranlara sahiptir, lipid bileşimi ve boyutu ayarlanabilir. Bu amaçla, biz önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine Drosophila atlastin için deterjan kaldırma ile bir reanayasa yöntemi açıklanmaktadır. Çeşitli reanayasa yöntemleri mevcut iken, deterjan kaldırma ile reanayasası atlastins ve diğer benzer proteinler için uygun hale getirmek çeşitli avantajları vardır. Bu yöntemin avantajı, reconstituted proteinin yüksek reanayasa verimi ve doğru yönünü içerir. Bu yöntem diğer membran proteinleri ve proteoliposomes gerektiren diğer uygulamalar için uzatılabilir. Ayrıca, membran füzyon ölçümü olarak kullanılan proteoliposomların bir FRET bazlı lipid karıştırma tahlili açıklanmaktadır.

Atlastin reanayasasının verimliliği Şekil 2' de sunulmuştur. Reconstituted proteoliposomes bir ıohexol kesintisiz gradyan içinde süzülmüştü. Unıncorporated protein alt katmanda (B) veya Orta katmanda (M) posalı oldu. Reconstituted protein üst katmanda (T) yüzer. Gradyan örnekleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama tarafından hasat edilmiş ve analiz edilmiştir. Jelin densitometri ile ölçülmesi, ihmal edilebilir kaybeder ile reanayasanın çok yüksek bir verimliliğini göst...

Watch this Scientific Journal Video about Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays at JoVE.com

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Burada ayrıntılı olarak yapılan yeniden yapılanma ve füzyon protokolü, bir model lipid çift katmanlı ve füzyon proteinleri tarafından lipid karıştırma membran bağlı proteinler çalışma için etkili bir yoldur. Burada rekombinant Drosophila atlastin bir deterjan destekli reconstitution tarif, bir ER füzyon proteini, önceden biçimlendirilmiş fosfatidilkolin lipozomlar içine. Atlastin proteolipozomlarının füzyonu fret tabanlı lipid karıştırma testi ile ölçülür.Deterjan destekli reconstitution önemli avantajlarından biri deterjan protein kurutma veya çözücüler maruz kalmamış olmasıdır. Ayrıca burada atlastinin yeniden yapılanma yöneliminin çok etkili olduğunu gösteriyoruz. FRET tabanlı lipid karıştırma testinin bir diğer avantajı da lipozomların herhangi bir boya ile yüklenmesi gerekmemesi ve ekstra çevirmeli adımlara gerek olmamasıdır.Bu prosedürü başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi, kloroform lipid karışımı stokları hazırlamak. Lipid karışımları DPPC mililitre başına bir mikrocurie ekleyin, Bu stok en az sekiz mikrolitre rezerv emin olun. İstenilen miktarda lipid karışımlarını çakmaktaşı cam tüplere aktarın.Daha sonra daha fazla kloroform görünür olana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca azot gazı nazik bir akışı altında lipid karışımları kuru. Elde edilen lipid filmini 30 dakika vakumlayarak kurutucu bir kurutucuda kurutun. Bundan sonra, yeterli A100 ekleyin 10%gliserol, iki milimolar 2-mercaptoetanol, ve bir milimolar EDTA lipid film geri konsantrasyon getirmek için 10 milimolar.Oda sıcaklığında 15 dakika hafifçe girdap yaparak lipid filmini yeniden askıya alın. Sıvı nitrojen de sulu lipidler dondurun. Lipozomları eritmek için, çözeltinin oda sıcaklığında 30 saniye oturmasına izin verin, daha hızlı erimeiçin suya geri aktarın.Bu donma-çözülme döngüsünü toplam 10 kez tekrarlayın. Bundan sonra, polikarbonat filtreler aracılığıyla lipidler geçmek için bir mini ekstrüzyon kullanın, bir gözenek boyutu ile 100 nanometre, 19 kez. Lipozomların toplam lipid konsantrasyonunu belirlemek için, üç mililitre sintilasyon kokteyline dört mikrolitre lipid stoğu ve lizozom ekleyin.Stok ve lipozomlar için dakika başına ortalama sayıları ölçün ve metin protokolünde belirtildiği gibi lipozom konsantrasyonu hesaplayın. Lipozomları bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi, 0,5 mililitrelik bir tüpiçinde uygun miktarda tampon, ekstra deterjan ve proteini karıştırın.Hızla lipozomlar ekleyin ve karışımı homojenize etmek için beş saniye boyunca hemen girdap. Reaksiyonu bir saat boyunca dört santigrat derecede bir nutator'da kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka sırasında, polistiren adsorbent boncuk 0,2 gram tartmak ve bir mikrosantrifüj tüp aktarın.Tüpe bir mililitre metanol ekleyin ve boncukları gazdan arındırmak için bir dakika karıştırın. Sonra, 21-gauge veya daha yüksek bir iğne ile metanol aspire. Boncukları yıkamaya başlamak için, onlara su ekleyin.Boncuklar beş dakika suyla karışSın, sonra suyu aspire edin. Bu su yıkama işlemini dört kez tekrarlayın. Bundan sonra, mililitre başına 0,2 gram son konsantrasyonile, bir mililitre hacmine polistiren adsorbent boncuk bulamaç getirmek için su ekleyin.Metin protokolünde belirtildiği gibi, her örnekteki tüm deterjanı adsorb etmek için gereken polistiren adsorbent boncuk miktarını hesaplayın. Boncuk bulamacı toplamak için bir pipet ucu kesin. Hesaplanan boncuk bulamacı miktarını 0,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve suyu aspire edin.Örnekleri boncukları içeren tüpe ekleyin ve bir saat boyunca dört santigrat derecede bir nutator da kuluçkaya yatırın. Örnekleri yeni boncuklar içeren yeni bir tüpe aktarın, eski boncukları geride bıraktığından emin olun. Aynı koşulları kullanarak tekrar kuluçkaya yatırın.Boncukları iki kez transfer etme ve kuluçkaya yatırma işlemini tekrarlayın. Bundan sonra, taze boncuk içeren yeni bir tüp için örnek aktarın ve dört santigrat derece bir gecede nutating tarafından kuluçka. Ertesi gün, çözünmez protein agregaları pelet 10 dakika boyunca 16, 000 kez g ve dört derece santigrat de boncuk ve santrifüj gelen örnek kaldırın.Supernatant kurtarmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi, sıvı sintillation sayma ile son lipid konsantrasyonunu belirlemek. Başlamak için, gliserol içeren A100 her 0.15 milimolar konsantrasyona donör ve kabul proteolipozomları getirmek, beta-mercaptoetanol, EDTA, ve magnezyum klorür. Floresan okuma için uygun düz bir 96-iyi plaka bir kuyuya her reaksiyon transfer, bir triplicate ve no-GTP negatif kontrol de dahil olmak üzere en az dört reaksiyonlar hazırlamak için emin olun.Plakayı 37 derecede önceden ısıtılmış bir plaka okuyucusuna yerleştirin. NBD floresanını her dakika beş dakika ölçün. Sonra, füzyon ikna etmek için beş milimolar GTP ekleyin.NBD floresanını her dakika bir saat boyunca ölçün, öncekiyle aynı uyarma ve emisyonuyguluyor. Bundan sonra, proteolipozomları eritmek için kuyulara %2,5 n-Dodecyl beta-D-maltoside beş mikrolitre ekleyin ve aynı uyarma ve emisyon kullanarak 15 dakika boyunca her dakika maksimum NBD floresanını ölçün. Bu çalışmada rekombinant Drosophila atlastin saflaştırılır ve önceden oluşturulmuş lipozomlar haline getirilir.Atlastin reconstitution verimliliği bir iohexol kesintili gradyan yüzen repozolipozomlar tarafından belirlenir. Üst, orta ve alt degrade tabakalarının örnekleri hasat edilir ve SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilir. Jelin densitometri ile ölçülmesi, ihmal edilebilir kaybedilmelerle yeniden yapılanmanın çok yüksek bir verimini gösterir ve toplam proteinin %96'sı üst tabakada yüzen proteolipozomlar olarak bulunur.Proteinin %1'inden azı yeniden oluşturulmaz ve orta tabakada bulunur ve sadece %3'ü yeniden oluşturulmaz veya biraraya ve alt tabakaya tortulanır. Reconstitution sonrası atlastin in oryantasyonu trombin dekolte stoyonları ile ölçülür. Örnekler SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edilir ve densitometri ile ölçülür.Yeniden yapılanan proteinlerin çoğu, sadece% 7 proteaz korunmaktadır, cleaved olduğunu. Kinetik ve atlastin aracılı proteolipozom füzyon ölçüde lipid karıştırma tahlilleri ile analiz edilir. Sıfır zaman noktasında GTP ile füzyona neden olmadan önce beş dakikalık bir kuluçka işlemi gerçekleştirilir.Bir saat sonra, n-Dodecyl beta-D-maltoside proteolipossomes solubilize ve maksimum floresan rezonans transferi sürümü almak eklendi. Koşuda füzyon maksimum maksimum maksimum floresan% 11 olarak görülmektedir. Lipidler kloroformda çözünür.Lipid karışımları hazırlarken, herhangi bir buharlaşma önlemek için, bir kimyasal başlık üzerinde, ve buz üzerinde, hızlı bir şekilde bunu yapmak için emin olun. Bir membran çapasının lipozom şekil ve boyut üzerindeki etkilerini görselleştirmek için atlastin proteolipozomlarını mikroskopi ile analiz etmek mümkündür. Bu yöntem, diğer membran bağlantılı proteinleri ve bir model lipid çift katmanlı nasıl nasıl bir şekilde çalışmak için genişletilmiştir.Bu protokol lipid karışımları ölçmek için titre lipidler kullanır. Radyoaktif maddelerle çalışırken gerekli önlemleri almayı unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, Aerodinamik Protein Bağlayıcı Tahliller için Biyotinylated Peptidiskler içine Membran Proteinlerin Bir Adım Dahil

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...