Name: isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Vi vil gerne takke James P. Bridges for at give en betydelig vejledning om de metoder, der er involveret i dyrkning af primære celler. Matthew J. Beucler blev støttet af nationale institutter for sundhedsuddannelse Grant T32-ES007250. Dette arbejde blev også støttet af nationale institutter for sundhedstilskud R01-AI121028 og R21-DE026267 tildelt William E. Miller.

Disse protokoller og undersøgelser er blevet gennemgået og godkendt af den institutionelle revisions bestyrelse på University of Cincinnati (Federal-dækkende Assurance #00003152, IRB-protokol 2016-4183). Spyt vævet er almindeligt genbrugt i mange hoved og hals kirurgiske procedurer og er normalt ikke involveret af den maligne proces. Typisk, frisk redesignet spytkirtel væv anvendes inden for 2-4 h efter fjernelse fra patienten (figur 1a).
1. klargøring af rea...

<ol>
	<li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands,+Part+1:+Anatomy,+Infectious,+and+Inflammatory+Processes.">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).</li><li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Biogenesis+and+Regeneration+of+Salivary+Glands.">Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands.</a> Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).</li><li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 213-225 (2003).</li><li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases.">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).</li><li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj&#246;gren's+syndrome:+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes.">Ten-year observation of patients with primary Sj&#246;gren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li><li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+A+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li><li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium.">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li><li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus:+epidemiology+and+infection+control.">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li><li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals.">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li><li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells.">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li><li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+human+and+mouse+salivary+glands:+A+practice+guide+for+salivary+researchers.">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li><li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells:+A+STR+analysis+study.">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li><li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland.">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells.">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures.">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li><li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 199-212 (2003).</li><li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children.">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands:+Hyposalivation+Cell+Therapy.">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li><li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line.">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture:+Differentiation+of+Salivary+Stem/Progenitor+Cells.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li><li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization.">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li></ol>

Spyt dysfunktion repræsenterer en bekymring for livskvaliteten for dem, der lider af Sjögrens syndrom samt dem, der gennemgår strålebehandling for kræft ved siden af spytkirtlerne3,4,5, 16. En foreslået terapi til behandling af disse patienter er at dyrke funktionelle spyt celler eller organoider in vitro, som derefter kan indsættes i beskadigede spytkirtel til at erstatte angrebne væv...

I pattedyr spytkirtlerne er organiseret i 3 par store spytkirtler: den parotid, submandibulær, og sublinguale kirtler. Der findes også en række mindre kirtler placeret på tungen og spredt over hele mundhulen1. De vigtigste kirtler er ansvarlige for bulk volumen af spyt produceret2. Ud over at give antimikrobiel beskyttelse gennem udskillede faktorer, spyt er vigtigt i processen med at tygge og smøre fødevarer, som det passerer gennem spiserøret2. Som sådan, spytkirtel dysfunktion repræsenterer en medicinsk problem, hvor syge, der er i stand til at producere nok spyt er mere tilbøjelige til at udvikle maladies såsom dental kaviteter eller oral candidiasis3. Desuden, reduceret spyt resulterer i større problemer med at spise og fordøje fødevarer har en betydelig indvirkning på livskvalitet.
Spytkirtel dysfunktion findes primært hos patienter, der lider af Sjögrens syndrom, en autoimmunsygdom eller hos patienter med hoved-og nakke kræft, som har gennemgået strålebehandling3,4,5, 6. Beskadigede sekretoriske acini inden for kirtler som følge af autoimmunitet eller strålebehandling ikke undergår selvfornyelse, hvilket resulterer i en patient, der lever med uoprettelige skader6. Studiet af spytkirtler har også høstet opmærksomhed eller forskere interesseret i mekanismer af viral patogenese. Nogle patogener, såsom humant Cytomegalovirus (HCMV), vedholdende replikere inden for spytkirtlerne, som derefter giver mulighed for overførsel af spirende virus til en ny vært via spyt7,8. Således er der en uopfyldt behov for at udvikle robuste og reproducerbare in vitro-modeller af spytkirtel væv til at tackle og forstå en bred vifte af medicinske problemer.
Flere modeller af murine spytkirtel system har været brugt som udgangspunkt for at forstå og karakterisere de forskellige epiteliale celler, der danner spytkirtlerne9,10. Der findes indlysende og store forskelle mellem menneskelige og murine spytkirtler11. Især den menneskelige parotideale kirtel er større i forhold til submandibulær kirtel, mens musens submandibulære og parotideale er meget ens i størrelse1,2,11. Mens udødeliggjort menneskelige submandibulære cellelinjer findes, der er store bekymringer, at de udødeliggjort celler ikke præcist vedligeholde Fænotypen af det primære væv og sekundære bekymringer, at de udødelige celler ikke rent faktisk stammer fra spyt epitelet12. Af disse grunde er der en interesse og et behov for at studere primære spyt væv fra mennesker.
Her beskriver vi en protokol for at isolere primære epiteliale celler fra menneskelige spytkirtler til vævskultur. Vores protokol er baseret på værker af Pringle et al. og Tran et al. med ændringer, der generelt forenkler deres procedurer13,14. For det første, mens Tran et al. 's protokol kræver en lang femtimers inkubation for enzymatisk at fordøje spyt vævet, har vores modificerede protokol været vellykket med så lidt som en times inkubation, svarende til den i Pringle et al. For det andet bruger vi forskellige enzymer til vævs fordøjelse, især vi bruger ikke trypsin som bruges i den oprindelige Tran et al. protokol, men i stedet bruge en blanding af dispase og kollagenase. Vi foretrækker at undgå trypsin i de indledende fordøjelsestrin, da en nylig undersøgelse antydede, at den initiale fordøjelse af spyt vævet ved trypsin resulterer i nedsat cellelevedygtighed, muligvis ved tab af en sjælden stamcelle population15. Endelig kultur de salisfærer på overfladen af kælderen membran matrix (BMM) ved hjælp af en kommercielt tilgængelige medier oprindeligt formuleret til formering af bronkiale epitelceller. Vores protokol kan bruges til at isolere spyt celler fra parotid, submandibulær og sublinguale kirtler. Disse celler udtrykker spyt amylase og andre spyt specifikke gener, der indikerer, at de opretholder en fænotype svarende til spyt acinic epiteliale celler7. Vi har med succes genereret spyt kulturer fra > 50 primære humane vævsprøver ved hjælp af denne metode. Desuden kan de primære spyt celler nemt kryopreserveres til brug på et senere tidspunkt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td>
			<td style="width:132px;">Lonza</td>
			<td style="width:123px;">CC-3171</td>
			<td>Add bullet kit as per manufacturer&#39;s instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cell strainer 70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Charcoal stripped fetal bovine serum</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">12676-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Collagenase type III</td>
			<td style="width:132px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004182</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dispase</td>
			<td style="width:132px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">07923</td>
			<td>Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dulbecco phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">55-031-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">General Chemicals</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">PathClear Basement membrane extract</td>
			<td style="width:132px;">Cultrex</td>
			<td style="width:123px;">3432-005-01</td>
			<td>Thaw at 4 &#176;C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Six-well culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-079-742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers

Spytkirtlerne er et sted af betydelig interesse for forskere, der er interesseret i flere aspekter af sygdomme hos mennesker. Et mål for forskere er at genoprette funktionen af kirtler beskadiget af stråling behandlinger eller på grund af patologier forbundet med Sjögrens syndrom. Et andet mål for forskere er at definere de mekanismer, hvormed vira replikere inden for glandulær væv, hvor de kan derefter få adgang til spyt væsker vigtigt for horisontal transmission. Disse mål fremhæver behovet for en robust og tilgængelig in vitro spytkirtel model, der kan udnyttes af forskere interesseret i ovennævnte samt relaterede forskningsområder. Her diskuterer vi en simpel protokol for at isolere epiteliale celler fra menneskelige spytkirtler og udbrede dem in vitro. Vores protokol kan optimeres yderligere for at imødekomme behovene i de enkelte undersøgelser. Kort sagt er spyt vævet mekanisk og enzymatisk adskilt for at isolere enkeltceller eller små klynger af celler. Udvælgelse til epiteliale celler sker ved plating på en kælder membran matrix i nærværelse af medier optimeret til at fremme epitel cellevækst. Disse resulterende kulturer kan opretholdes som tredimensionelle klynger, kaldet "salisfærer", eller dyrkes som en enkeltlags på behandlede plastik væv kultur retter. Denne protokol resulterer i en udvækst af en heterogene population af hovedsageligt epiteliale celler, der kan overføres til 5-8 passager (15-20 population doublings) før undergår cellulære senescens.

To-tre dage efter plating celler fra fordøjet væv på BMM, vil cellerne let danne små klynger, der vil fortsætte med at ekspandere i størrelse op til 15-20 celler per klynge (figur 2a). Cellulære rester og fritliggende døde celler ses typisk og bør fjernes ved at aspirere og fylde med friske medier. Cellerne vil fortsætte med at formere sig som saliskugler i ca. 3-10 dage, eller så længe BMM-laget forbliver intakt. Lejlighedsvis, på grund af delvi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Vi præsenterer en metode til isolering og dyrkning af primære menneskelige spytkirtel-afledte epiteliale celler. Disse celler udviser genekspressions mønstre i overensstemmelse med dem, der er af spyt epitelial oprindelse og kan dyrkes som salisfærer på kælder membran matricer afledt af Engelbreth-Holm-sværm tumorceller eller som monolag på behandlede kultur retter.

Isolering af spyt Epiteliale celler fra humane spytkirtler til in vitro-vækst som Salisfærer eller Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Generering primære cellulære modeller eller organoid-lignende strukturer er nøglen til at besvare mange nutidige spørgsmål i biologi. For eksempel har vi været interesseret i temmelig lang tid i de mekanismer, der anvendes af menneskelige vira til at lette replikation i spytkirtel, da det er et vigtigt sted for horisontal transmission. Udviklingen af salisphere-baserede system, der er beskrevet i denne protokol er et afgørende fremskridt i vores søgen efter at besvare disse typer af spørgsmål.Denne teknik giver os mulighed for at generere primære celler fra en række forskellige patientprøver. De cellulære modeller minder mere om in vivo-typesituationen, da cellerne ikke er modelleret eller omdannet som mange celletyper, der almindeligvis anvendes til in vitro-eksperimenter. Vi har brugt denne protokol til at generere lignende celler fra musens primære submandibulære kirtel, og protokollen vil sandsynligvis være nyttig for andre organer med lignende cellulære strukturer.Inden for to til fire timer efter fjernelse fra patienten, på en kultur plade, bruge autoklaved steriliseret dissekere saks og kirurgiske kraftvices at hakke spytkirtel væv i fine stykker på størrelse med en til to millimeter. Der tilsættes seks milliliter dispase/collagenaseopløsning til det hakkede væv. Derefter inkuberes ved 37 grader Celsius i ca. 30 minutter til en time.Forstyrre vævet ved pipettering med en fem milliliter serologisk pipette 15 til 20 gange. Inkubere ved 37 grader Celsius i yderligere 30 minutter til en time. Gentag pipetterings- og inkubationstrinet to til tre gange mere, eller indtil vævet ligner en gylle og nemt kan passere gennem pipettens åbning.Til pels brønde med BMM, langsomt pipette 500 mikroliter af natten optøet BMM i hver brønd af en seks godt plade. Langsomt hvirvle pladen til jævnt distribuere BMM over brøndene. Derefter inkuberes de belagte plader ved 37 grader Celsius i mindst 15 minutter før brug for at gøre det muligt for BMM at størkne.Først overføres Dispase/Collagenase-opløsningen, der indeholder homogeniseret væv, til et konisk rør på 15 milliliter. Vask pladevæggen én gang med seks milliliter DPBS for at overføre de resterende celler til det koniske rør. Gennem en 70 mikrometer nylonnetcelles si filtreres homogenatet i et nyt konisk rør på 50 milliliter for at fjerne ufordøjet væv.Centrifuge anstrengte celler i fem minutter ved 500 gange g. Aspirate supernatant. Derefter resuspend cell pellet i 10 milliliter 1X RBC lysis buffer.Inkubere i fem minutter ved 37 grader Celsius. Derefter tilsættes 20 til 25 milliliter DPBS for at neutralisere RBC lysis buffer og minimere lysis af spytceller. Centrifuge i fem minutter ved 500 gange g.Hvid celle pellet angiver fuldstændig lysis af alle RBC. Hvis pellet har rød farve, gentages behandlingen med RBC lysis buffer. Aspirer supernatanten og opsplit pellet i en til to milliliter BEGM og derefter overføre de resuspenderede celler på BMM belagte brønde.Inkubere ved 37 grader Celsius. Når belagt på BMM, celler vil dannes i sfæriske strukturer eller salispheres over en to til tre-dages periode. Celler kan opretholdes som salispheres for omkring fem til syv dage før BMM begynder at nedbrydes giver cellerne adgang og klæber til plast og vokse som en monolayer.Først, aspirere medierne fra brøndene og tilsæt en milliliter Dispase / Collagenase løsning til hver brønd. Inkuberes ved 37 grader Celsius i ca. 15 minutter, eller indtil BMM for det meste er opløst. Derefter overføres cellerne til et 15 milliliter konisk rør og vaskes brønde én gang med en til tre milliliter DPBS for at opnå de resterende celler.Centrifuge i fem minutter ved 500 gange g. Inspirer supernatanten og opsplit pellet i to milliliter Trypsin. Inkubere igen ved 37 grader Celsius i 15 minutter.Dernæst tilføje i røret nogen komplet medier, der indeholder 10% serum til at neutralisere Trypsin. Centrifuge i fem minutter ved 500 gange g. Inspirer supernatanten for at fjerne resterende medier, Trypsin og serum og derefter resuspenderede cellerne i DPBS.Centrifuge i fem minutter ved 500 gange g. Aspirere supernatant og resuspend pellet i BEGM. For at opretholde pellet som kugler, plade de resuspenderede celler på størknede BMM belagt kultur retter.Kultur alle celler i en befugtet inkubator opretholdes ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i fem til syv dage før subculturing. Foder med frisk BEGM hver anden til tredje dag. At formere cellerne som en monolayer på plast kultur retter, aspirere BEGM medierne fra fadet og vask en gang med DBPS at fjerne resterende medier.Tilsæt to milliliter Trypsin og inkuberes ved 37 grader Celsius i 15 minutter, eller indtil cellerne er helt afmonteret. Neutralisere Trypsin ved hjælp af fire milliliter af alle komplette medier, der indeholder 10% serum. Vip derefter forsigtigt skålen og overfør cellerne til et konisk rør på 15 milliliter.Pladen vaskes én gang med ca. fem milliliter DPBS for at indsamle de resterende celler. Centrifuge i fem minutter ved 500 gange g. Aspirate supernatant.For at fjerne resterende medier, resuspenderede celler i seks til 10 milliliter DPBS. Centrifuge i fem minutter ved 500 gange g. Aspirere supernatant og resuspenderet i BEGM.Derefter plade cellerne på de behandlede plastvæv kultur retter. Cellerne dyrkes i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid i fem til syv dage før subculturing. Foder med frisk BEGM hver anden til tredje dag.I denne protokol, efter plating celler fra det fordøjede væv på BMM i to til tre dage, celler let dannet små klynger, der fortsatte med at udvide i størrelse op til 15 til 20 celler pr klynge. Salisphere celler blev belagt på celle kulturperler behandlet plast og dyrket som en monolayer, hvor de udviser morfologi i overensstemmelse med celler af epitel oprindelse. Korrekt aseptisk teknik og pleje er nødvendig for at undgå bakteriel eller svampeforurening.Ingen mængde antibiotika eller antimykotika vil spare en kultur sværmer med mikrober. Vi besvarer spørgsmål om viral patogenese og transmission. Men for andre, Dette giver en måde at studere menneskelige spytceller for et vilkårligt antal applikationer såsom væv regenerering behandlinger.For os, der studerer human cytomegalovirus, denne teknik har tilladt os at begynde at udforske de molekylære mekanismer virussen udnytter til at inficere og i sidste ende overføre til nye værter. Intet, der anvendes i denne protokol, er i sagens natur farligt, men der bør altid udvises forsigtighed ved håndtering af humant væv og enhver form for kemiske reagenser.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse af en mus Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay at evaluere Bakteriel Optagelse ved M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Af spytkirtler, æggestokke og embryoner af Vector Myg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spyt, spytkirtel, og hæmolymfe Collection fra Ixodes scapularis Flåter

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering af myeloide dendritiske celler og epitelceller fra human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Udvikling af en Spyt Antibody Multiplex Immunoassay at måle menneskelig eksponering for miljømæssige patogener

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metode til måling af spytkirtel funktion i mus

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...