Name: isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

一次細胞の培養に関わる方法論に関する重要なガイダンスを提供してくださったジェームズ・P・ブリッジスに感謝します。マシュー・J・ベクラーは、国立衛生研修助成金T32-ES007250によって支援されました。この研究はまた、国立衛生研究所の助成金R01-AI121028とR21-DE026267ウィリアム・E・ミラーに授与されました。

これらのプロトコルと研究は、シンシナティ大学の機関審査委員会(連邦全体保証#00003152、IRBプロトコル2016-4183)によってレビューされ、承認されています。唾液組織は、一般的に多くの頭頸部外科的処置で切除され、通常、悪性プロセスによって関与しない。典型的には、新たに切除された唾液腺組織は、患者から除去した後2〜4時間以内に使用される(図1A)。
<p class=...

<ol>
	<li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands,+Part+1:+Anatomy,+Infectious,+and+Inflammatory+Processes.">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).</li><li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Biogenesis+and+Regeneration+of+Salivary+Glands.">Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands.</a> Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).</li><li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 213-225 (2003).</li><li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases.">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).</li><li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj&#246;gren's+syndrome:+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes.">Ten-year observation of patients with primary Sj&#246;gren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li><li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+A+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li><li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium.">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li><li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus:+epidemiology+and+infection+control.">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li><li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals.">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li><li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells.">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li><li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+human+and+mouse+salivary+glands:+A+practice+guide+for+salivary+researchers.">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li><li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells:+A+STR+analysis+study.">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li><li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland.">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells.">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures.">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li><li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 199-212 (2003).</li><li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children.">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands:+Hyposalivation+Cell+Therapy.">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li><li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line.">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture:+Differentiation+of+Salivary+Stem/Progenitor+Cells.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li><li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization.">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li></ol>

唾液機能不全は、シェーグレン症候群に罹患している人々の生活の質に対する懸念を表し、唾液腺3、4、5に隣接する癌に対する放射線治療を受けている人々の生活の質に関する懸念を表します。 16.これらの患者を治療するための1つの提案された治療法は、インビトロで機能性唾液幹細胞または?...

哺乳類では、唾液腺は、耳下腺、顎下腺、および言語下腺の3組の主要な唾液腺に編成される。また、舌の上に位置し、口腔1全体に散在する一連のマイナー腺が存在する。主要な腺は、2を生成した唾液のバルク量を担当しています.分泌因子を介して抗菌保護を提供することに加えて、唾液は食道2を通過する食品を噛み、潤滑する過程で重要である。したがって、唾液腺機能不全は、十分な唾液を産生することができない患者が、歯科空洞や口腔カンジダ症3などの病気を発症しやすい医学的問題を表す。さらに、唾液の減少は、生活の質に大きな影響を与える食べ物を食べたり消化するのが難しくなります。
唾液腺機能不全は、主にシェーグレン症候群、自己免疫疾患、または照射療法を受けた頭頸部癌患者3,4,5に罹患している患者に見られる。 6.自己免疫または放射線療法の結果として腺内の損傷した分泌性アチーニは自己更新を受けず、不可逆的な損傷を受けた患者を生きる6.唾液腺の研究はまた、ウイルス病因のメカニズムに興味を持つ注目や研究者を集めています。ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のような一部の病原体は、唾液腺内で持続的に複製し、唾液7、8を介して新しい宿主に新しい宿主に新しい宿主に伝染することを可能にする。したがって、唾液腺組織の堅牢で再現性の高いモデルを開発し、多様な医学的問題に取り組み、理解する必要があります。
マウス唾液腺系のいくつかのモデルは、唾液腺9、10を形成する異なる上皮細胞を理解し、特徴付ける出発点として使用されている。ヒトとマウスの唾液腺11の間には明らかな大きな違いがある。最も顕著なヒト耳下腺は、下顎腺に関連して大きいのに対し、マウスの顎下腺および耳下腺は、サイズ1、2、11でかなり類似している。不死化ヒトのマンディビバル細胞株は存在するが、不死化細胞が原発組織の表現型を正確に維持しておらず、不死化細胞が実際に由来していないという二次的懸念が大きな懸念がある。唾液上皮自体12.これらの理由から、ヒトから一次唾液組織を研究する興味と必要性があります。
ここでは、組織培養のためのヒト唾液腺から原発上皮細胞を分離するプロトコルについて説明する。私たちのプロトコルは、一般的に彼らの手順を簡素化するために行われた変更を加えたPringle et al. と Tran らの作品に基づいています13,14.まず、Tran et al.のプロトコルは唾液組織を酵素的に消化するための長い5時間のインキュベーションを必要としますが、私たちの改変されたプロトコルは、プリングルらと同様に、わずか1時間のインキュベーションで成功しています。第二に、我々は組織消化のために異なる酵素を使用し、最も顕著なのは、元のTranらプロトコルで使用されているようにトリプシンを使用せず、代わりにジスパーゼとコラゲナーゼの混合物を使用します。我々は、最近の研究がトリプシンによる唾液組織の初期消化が細胞生存率の低下をもたらすことを示唆したように、初期消化ステップでトリプシンを避けることを好む、おそらくまれな幹細胞集団15の喪失によって。最後に、気管支上皮細胞の伝播のために処方された市販の培地を用いて、基塩膜マトリックス(BMM)の表面に唾液を培養する。私たちのプロトコルは、唾液細胞を耳下腺、顎下腺、および言語下腺から単離するために使用することができます。これらの細胞は唾液アミラーゼおよび他の唾液特異的遺伝子を発現し、唾液アシナー上皮細胞7と同様の表現型を維持することを示す。この方法論を用いて、>50の一次ヒト組織サンプルから唾液培養物を生成することに成功しました。さらに、一次唾液細胞は、後日使用するために容易に凍結保存することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td>
			<td style="width:132px;">Lonza</td>
			<td style="width:123px;">CC-3171</td>
			<td>Add bullet kit as per manufacturer&#39;s instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cell strainer 70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Charcoal stripped fetal bovine serum</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">12676-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Collagenase type III</td>
			<td style="width:132px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004182</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dispase</td>
			<td style="width:132px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">07923</td>
			<td>Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dulbecco phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">55-031-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">General Chemicals</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">PathClear Basement membrane extract</td>
			<td style="width:132px;">Cultrex</td>
			<td style="width:123px;">3432-005-01</td>
			<td>Thaw at 4 &#176;C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Six-well culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-079-742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers

唾液腺は、人間の病気の複数の側面に興味を持つ研究者のための重要な関心のサイトです。研究者の1つの目標は、放射線療法によって損傷を受けた腺の機能を回復するか、シェーグレン症候群に関連する病理に起因する。研究者の第二の目標は、ウイルスが腺組織内で複製するメカニズムを定義し、水平伝播に重要な唾液液にアクセスできることです。これらの目標は、上記に興味を持つ研究者だけでなく、関連する研究分野で利用することができる体外唾液腺モデルの堅牢でアクセス可能な必要性を強調しています。ここでは、ヒト唾液腺から上皮細胞を分離し、インビトロで伝播する簡単なプロトコルについて説明します。私たちのプロトコルは、個々の研究のニーズを満たすためにさらに最適化することができます。簡単に言えば、唾液組織は機械的および酵素的に分離され、単一細胞または細胞の小さなクラスターを単離する。上皮細胞の選択は、上皮細胞増殖を促進するために最適化された培地膜マトリックス上にめっきすることによって起こる。これらの得られた培養物は、「唾液圏」と呼ばれる三次元クラスターとして維持することも、処理されたプラスチック組織培養皿上の単層として成長させることができる。このプロトコルは、細胞老化を受け入れる前に5-8の通路(15〜20集団倍増)のために伝播することができる主に上皮細胞の異種集団の成長をもたらす。

消化された組織からBMMに細胞をめっきしてから2~3日後、細胞はクラスター当たり最大15~20個の細胞の大きさで膨張し続ける小さなクラスターを容易に形成する(図2A)。細胞の破片や剥離した死細胞は一般的に見られ、新鮮な媒体を吸引し、補充することによって除去されるべきです。細胞は、約3〜10日間、またはBMM層がそのまま残っている限り、?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

一次ヒト唾液腺由来上皮細胞を分離・培養する方法を提示する.これらの細胞は唾液上皮起源の遺伝子発現パターンを示し、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム腫瘍細胞に由来する基塩膜マトリックス上の唾液圏として、または処理された培養皿上の単層として増殖することができる。

唾液圏または単層としての体外増殖のためのヒト唾液腺からの唾液上皮細胞の単離

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

生物学における多くの現代的な質問に答える鍵は、一次細胞モデルまたはオルガノイドのような構造を生成する鍵です。例えば、私たちは、水平感染の重要な場所であるため、唾液腺での複製を容易にするためにヒトウイルスが使用するメカニズムにかなり長い間興味を持っていました。このプロトコルに記載されている唾液系システムの開発は、これらのタイプの質問に答えるために私たちの探求の重要な進歩です。この技術により、さまざまな患者サンプルから一次細胞を生成することができます。細胞モデルは、細胞が体外実験で一般的に使用される多くの細胞タイプのようにモデル化または変換されていないので、in vivo型の状況をより連想させる。我々は、マウスの主要な顎下腺から同様の細胞を生成するためにこのプロトコルを使用しており、プロトコルは、同様の細胞構造を有する他の器官に有用であろう。患者から除去してから2〜4時間以内に、培養プレート上で、オートクレーブ殺菌された滅菌解剖ハサミと外科用鉗子を使用して、唾液腺組織を1〜2ミリメートルの大きさで細かい部分にミンチする。6ミリリットルのディスパーゼ/コラゲターゼ溶液を細かく組織に加えます。その後、摂氏37度で約30分から1時間インキュベートします。5ミリリットル血清ピペットを15〜20回ピペット化して組織を破壊する。摂氏37度でさらに30分から1時間インキュベートします。ピペットとインキュベーションのステップを2〜3回繰り返すか、組織がスラリーに似ていてピペットの開口部を簡単に通過できるまで繰り返します。BMMで井戸をコーティングするには、ゆっくりとピペット500マイクロリットルの一晩のBMMを6つのウェルプレートの各ウェルに解凍しました。ゆっくりと井戸の上にBMMを均等に分配するためにプレートを渦巻きます。その後、BMMを固めるために使用する前に少なくとも15分間、37°Cでコーティングされたプレートをインキュベートします。まず、均質化した組織を含むディスパーゼ/コラゲターゼ溶液を15ミリリットルの円錐チューブに移します。プレートの壁を6ミリリットルのDPBSで1回洗浄し、残りの細胞を円錐管に移します。その後、70マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを介して、未消化組織を除去するために新しい50ミリリットルの円錐管にホモゲネートをフィルター処理します。遠心分離機は500倍gで5分間細胞を緊張させる。上清を吸引する。その後、細胞ペレットを1X RBCライシスバッファーの10ミリリットルで再懸濁する。摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、20〜25ミリリットルのDPBSを加え、RBC溶菌緩衝液を中和し、唾液細胞の溶菌を最小限に抑える。500回gで5分間遠心分離機。白い細胞ペレットは、全てのRBCの完全なリシスを示す。ペレットが赤色の場合は、RBCライシスバッファーで処理を繰り返します。上清を吸引し、BEGMの1〜2ミリリットルでペレットを再懸濁し、再懸濁細胞をBMMコーティングされたウェルに移す。摂氏37度でインキュベートする。BMMでメッキされると、細胞は2〜3日間にわたって球状の構造または唾液に形成されます。細胞は、BMMが分解し始める前に約5〜7日間唾液として維持することができ、細胞がプラスチックにアクセスして付着し、単層として成長することを可能にする。まず、井戸から培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルのディスパス/コラゲターゼ溶液を加えます。摂氏37度で約15分間、またはBMMがほとんど溶解するまでインキュベートします。その後、細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、1~3ミリリットルのDPBSでウェルを1回洗浄し、残りの細胞を得る。500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引し、トリプシンの2ミリリットルでペレットを再懸濁します。摂氏37度で15分間再びインキュベートします。次に、10%血清を含む完全な培地をチューブに加えてトリプシンを中和する。500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引して残留培地、トリプシン、血清を除去し、DPBS中の細胞を再懸濁する。500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引し、BEGM中のペレットを再懸濁する。ペレットを球体として維持するために、再懸濁した細胞を固化したBMMコーティングされた培養皿にプレートします。加湿インキュベーター内のすべての細胞を、5〜7日間5〜7日間、摂氏37度で維持し、5〜7日間培養する。2~3日ごとに新鮮なBEGMでフィードします。単層として細胞をプラスチック培養皿に増殖させるために、BEGM培地を皿から吸引し、DBPSで一度洗浄して残留培地を除去する。トリプシンを2ミリリットル加え、摂氏37度で15分間、または細胞が完全に剥離するまでインキュベートします。10%の血清を含む完全な培地の4ミリリットルを使用してトリプシンを中和する。その後、皿をそっと傾け、15ミリリットルの円錐管に細胞を移します。残りの細胞を収集するためにDPBSの約5ミリリットルでプレートを1回洗浄します。500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引する。残留培地を除去するために、DPBSの6〜10ミリリットルで細胞を再懸濁する。500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引し、BEGMで再中断する。その後、処理されたプラスチック組織培養皿に細胞をプレートします。加湿インキュベーターで細胞を培養し、摂氏37度で5%の二酸化炭素を5〜7日間培養した後、下皮化する。2~3日ごとに新鮮なBEGMでフィードします。このプロトコルでは、消化した組織からBMMに細胞を2〜3日間めっきした後、細胞は容易に小さなクラスターを形成し、クラスターあたり最大15〜20個の細胞まで拡大し続けた。唾液細胞を細胞培養処理プラスチックにメッキし、上皮起源の細胞と一致する形態を示す単層として増殖させた。細菌や真菌の汚染を避けるために適切な無菌技術とケアが必要です。抗生物質や抗ミコティックの量は、微生物で群がる培養物を保存しません。私たちは、ウイルスの病因と伝染に関する質問に答えています。しかし、他の人にとっては、これは組織再生療法などの任意の数のアプリケーションのためにヒト唾液細胞を研究する方法を提供します。ヒトサイトメガロウイルスを研究する私たちにとって、この技術は、ウイルスが感染し、最終的に新しい宿主に感染するために利用する分子メカニズムの探求を始めさせてきた。このプロトコルで使用するものは本質的に危険ですが、人間の組織やあらゆる種類の化学試薬を扱うときには常に注意が必要です。

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

ハイブリダイゼーション<em&gt;その場で</em&gt;唾液腺、卵巣、および媒介蚊の胚の

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

マウスの唾液腺機能の測定法

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...