Name: isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Vi vil gjerne takke James P. Bridges for å gi betydelig veiledning om metodene som er involvert for dyrking primære celler. Matthew J. Beucler ble støttet av National Institutes of Health Training Grant T32-ES007250. Dette arbeidet ble også støttet av National Institutes of Health Grants R01-AI121028 og R21-DE026267 tildelt William E. Miller.

Disse protokollene og studier har blitt gjennomgått og godkjent av den institusjonelle Review Board ved Universitetet i Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, IRB protokoll 2016-4183). Spytt vevet er vanligvis resected i mange hode og nakke kirurgiske prosedyrer og er vanligvis uninvolved av den ondartede prosessen. Vanligvis er fersk resected spyttkjertel vev brukes innen 2-4 h etter fjerning fra pasienten (figur 1a).
1. forberedelse av reagens
<ol><li>...

<ol>
	<li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands,+Part+1:+Anatomy,+Infectious,+and+Inflammatory+Processes.">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).</li><li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Biogenesis+and+Regeneration+of+Salivary+Glands.">Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands.</a> Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).</li><li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 213-225 (2003).</li><li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases.">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).</li><li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj&#246;gren's+syndrome:+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes.">Ten-year observation of patients with primary Sj&#246;gren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li><li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+A+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li><li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium.">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li><li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus:+epidemiology+and+infection+control.">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li><li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals.">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li><li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells.">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li><li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+human+and+mouse+salivary+glands:+A+practice+guide+for+salivary+researchers.">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li><li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells:+A+STR+analysis+study.">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li><li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland.">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells.">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures.">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li><li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology &amp; Medicine. 14, 199-212 (2003).</li><li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children.">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li><li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands:+Hyposalivation+Cell+Therapy.">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li><li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line.">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li><li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Salivary+Human+Stem/Progenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture:+Differentiation+of+Salivary+Stem/Progenitor+Cells.">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li><li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization.">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li></ol>

Spytt dysfunksjon representerer en bekymring for livskvalitet for de som lider av sjögrens syndrom samt de gjennomgår strålebehandling for kreft ved siden av spyttkjertler3,4,5, 16i den. En foreslått terapi for å behandle disse pasientene er å vokse funksjonell spytt stamceller eller organoids in vitro, som deretter kan settes inn skadet spyttkjertel å erstatte berørte vev<sup class="x...

I pattedyr i Spyttkjertlene er organisert i 3 par store spyttkjertler: den parotid, submandibular, og sublingual kjertler. Det finnes også en rekke mindre kjertler ligger på tungen og spredt over hele munnhulen1. De store kjertlene er ansvarlig for bulk volumet av spytt produsert2. I tillegg til å gi antimikrobielle beskyttelse gjennom utskilles faktorer, er spytt viktig i prosessen med å tygge og smøre mat når den passerer gjennom spiserøret2. Som sådan, spyttkjertel dysfunksjon representerer et medisinsk problem der lider som ikke er i stand til å produsere nok spytt er mer utsatt for å utvikle sykdommer som Dental hulrom eller oral candidiasis3. I tillegg, redusert spytt resulterer i større vanskeligheter med å spise og fordøye mat har en betydelig innvirkning på livskvalitet.
Spyttkjertel dysfunksjon er primært funnet hos pasienter som lider av sjögrens syndrom, en autoimmun lidelse, eller hos pasienter med hode og nakke kreft som har gjennomgått bestråling terapi3,4,5, 6i den. Skadet sekretoriske acini i kjertlene som følge av autoimmunitet eller strålebehandling ikke gjennomgår selv fornyelse, noe som resulterer i en pasient som lever med irreversible skader6. Studiet av spyttkjertler har også fått oppmerksomhet eller forskere er interessert i mekanismer for viral patogenesen. Noen patogener, slik som Human Cytomegalovirus (HCMV), vedvarende gjenskape i Spyttkjertlene, som deretter gir mulighet for overføring av begynnende virus til en ny vert via spytt7,8. Dermed er det en unmet behov for å utvikle robuste og reproduserbar in vitro modeller av spyttkjertel vev å takle og forstå et mangfoldig utvalg av medisinske problemer.
Flere modeller av murine spyttkjertel-systemet har blitt brukt som et utgangspunkt for å forstå og karakterisere de ulike epitelceller som danner spyttkjertler9,10. Det finnes åpenbare og store forskjeller mellom menneske og murine spyttkjertler11. Spesielt den menneskelige parotid kjertel er større i forhold til submandibular kjertel mens musen submandibular og parotid er mye lignende i størrelse1,2,11. Mens udødeliggjort menneskelige submandibular cellelinjer finnes, er det store bekymringer at de udødeliggjort cellene ikke nøyaktig opprettholde fenotype av primær vev og sekundær bekymring for at de udødeliggjort cellene er faktisk ikke avledet fra spytt epitel selv12. Av disse grunnene er det en interesse og et behov for å studere primære spytt vev fra mennesker.
Her beskriver vi en protokoll for å isolere primære epitelceller fra menneskelig spyttkjertler for vev kultur. Vår protokoll er basert på verkene til Pringle et al. og Tran et al. med modifikasjoner gjort for å generelt forenkle sine prosedyrer13,14. Først, mens Tran et al. ' s protokoll krever en lang fem-timers inkubasjons for enzymatisk fordøye spytt vevet, har vår modifiserte protokollen vært vellykket med så lite som en-Times inkubasjons, lik som i Pringle et al. For det andre bruker vi ulike enzymer for vev fordøyelsen, særlig vi ikke bruker Trypsin som brukes i den opprinnelige Tran et al. protokoll, men i stedet bruke en blanding av dispase og kollagenase. Vi foretrekker å unngå Trypsin i den innledende fordøyelsen trinnene som en fersk studie antydet at første fordøyelsen av spytt vevet ved Trypsin resulterer i redusert celle levedyktighet, muligens ved tap av en sjelden stilk cellen befolkning15. Til slutt, kultur vi salispheres på overflaten av kjelleren membran matrise (BMM) ved hjelp av en kommersielt tilgjengelige medier opprinnelig formulert for utbredelsen av bronkial epitelceller. Vår protokoll kan brukes til å isolere spytt celler fra parotid, submandibular, og sublingual kjertler. Disse cellene uttrykker spytt Amylase og andre spytt spesifikke gener som indikerer at de opprettholder en fenotype som ligner på spytt acinar epitelceller7. Vi har med hell generert spytt kulturer fra > 50 primære menneskelige vevsprøver ved hjelp av denne metodikken. Videre kan de primære spytt cellene lett bli embryo for bruk på et senere tidspunkt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">100 mm culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">172931</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Bronchial Epithelial Cell Growth Media</td>
			<td style="width:132px;">Lonza</td>
			<td style="width:123px;">CC-3171</td>
			<td>Add bullet kit as per manufacturer&#39;s instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cell strainer 70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Charcoal stripped fetal bovine serum</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">12676-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Collagenase type III</td>
			<td style="width:132px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004182</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dispase</td>
			<td style="width:132px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">07923</td>
			<td>Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dulbecco phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">55-031-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">General Chemicals</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">PathClear Basement membrane extract</td>
			<td style="width:132px;">Cultrex</td>
			<td style="width:123px;">3432-005-01</td>
			<td>Thaw at 4 &#176;C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Six-well culture dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22-079-742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salivary epithelial cells from human salivary glands for in vitro growth as salispheres or monolayers

Spyttkjertlene er et område av betydelig interesse for forskere som er interessert i flere aspekter av menneskelig sykdom. Et mål av forskere er å gjenopprette funksjon av kjertler skadet av strålebehandling eller på grunn av patologi forbundet med Sjögrens syndrom. Et annet mål av forskere er å definere mekanismer som virus gjenskape innenfor kjertel vev der de kan da få tilgang til spytt væsker viktig for horisontal overføring. Disse målene fremheve behovet for en robust og tilgjengelig in vitro spyttkjertel modell som kan utnyttes av forskere interessert i ovennevnte samt relaterte forskningsområder. Her diskuterer vi en enkel protokoll for å isolere epitelceller fra menneskelig spyttkjertler og spre dem in vitro. Vår protokoll kan bli ytterligere optimalisert for å møte behovene til individuelle studier. Kort, spytt vev er mekanisk og enzymatisk separert for å isolere enkeltceller eller små klynger av celler. Utvalg for epitelceller oppstår ved plating på en kjeller membran matrise i nærvær av medier optimalisert for å fremme epitel cellevekst. Disse resulterende kulturer kan opprettholdes som tredimensjonale klynger, kalt "salispheres", eller vokst som en monolag på behandlet plast vev kultur retter. Denne protokollen resulterer i utvekst av en heterogene befolkning av hovedsakelig epitelceller som kan spres for 5-8 passasjer (15-20 befolkning doublings) før gjennomgår cellulære senescence.

To-tre dager etter plating celler fra fordøyd vev på BMM, celler vil lett danne små klynger som vil fortsette å ekspandere i størrelse opp til 15-20 celler per klynge (figur 2a). Cellular rusk og frittliggende døde celler er vanligvis sett og bør fjernes ved aspirating og påfyll med ferske medier. Celler vil fortsette å spre som salispheres i ca 3-10 dager, eller så lenge BMM laget forblir intakt. Av og til, på grunn av delvis nedbryting av BMM, vi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers at JoVE.com

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Vi presenterer en metode for å isolere og dyrke primære menneskelige spyttkjertel-avledet epitelceller. Disse cellene utstillingen genuttrykk mønstre i samsvar med dem er av spytt epitel opprinnelse og kan dyrkes som salispheres på kjeller membran matriser avledet fra Engelbreth-Holm-Swarm tumorceller eller som monolagere på behandlet kultur retter.

Isolering av spytt epitelceller fra Human spyttkjertler for in vitro vekst som Salispheres eller Monolagere

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Generering av primære cellulære modeller eller organoidlignende strukturer er nøkkelen til å svare på mange moderne spørsmål i biologi. For eksempel har vi vært interessert i ganske lang tid i mekanismene som brukes av menneskelige virus for å lette replikering i spyttkjertelen, da det er et viktig sted for horisontal overføring. Utviklingen av det salisphere-baserte systemet som er beskrevet i denne protokollen, er et avgjørende fremskritt i vår søken etter å svare på denne typen spørsmål.Denne teknikken tillater oss å generere primære celler fra en rekke forskjellige pasientprøver. Cellulærmodellene minner mer om in vivo type situasjonen som cellene ikke er modellert eller forvandlet som mange celletyper som vanligvis brukes for in vitro eksperimenter. Vi har brukt denne protokollen til å generere lignende celler fra musen primære submandibular kjertel og protokollen vil trolig være nyttig for andre organer med lignende cellulære strukturer.Innen to til fire timer etter fjerning fra pasienten, på en kulturplate, bruk autoklavet sterilisert dissekering saks og kirurgiske tang for å hakke spyttkjertelvevet i fine stykker på størrelse med en til to millimeter. Tilsett seks milliliter av Dispase/Collagenase-løsningen til hakket vev. Deretter inkubere ved 37 grader Celsius i ca 30 minutter til en time.Forstyrre vevet ved å pipettere med en fem milliliter serologisk pipette 15 til 20 ganger. Inkuber ved 37 grader Celsius i ytterligere 30 minutter til en time. Gjenta pipettering og inkubasjon trinn to til tre ganger eller til vevet ligner en slurry og kan lett passere gjennom pipette åpningen.For å belegge brønner med BMM, sakte pipette 500 mikroliter over natten tint BMM inn i hver brønn av en seks brønnplate. Virvle platen langsomt for å fordele BMM jevnt over brønnene. Inkuber deretter de belagte platene ved 37 grader Celsius i minst 15 minutter før bruk for å la BMM stivne.Overfør først Dispase/Collagenase-løsningen som inneholder homogenisert vev til et konisk rør på 15 milliliter. Vask veggen på platen en gang med seks milliliter DPBS for å overføre de resterende cellene til det koniske røret. Deretter gjennom en 70 mikrometer nylon mesh celle sil, filtrere homogenatet inn i en ny 50 milliliter konisk rør for å fjerne ufordøyd vev.Sentrifuge anstrengte celler i fem minutter ved 500 ganger g. Aspirer det overnaturante. Deretter resuspend cellen pellet i 10 milliliter av 1X RBC lysis buffer.Inkuber i fem minutter ved 37 grader Celsius. Deretter legger du til 20 til 25 milliliter DPBS for å nøytralisere RBC lysisbufferen og minimere lysis av spyttceller. Sentrifuge i fem minutter ved 500 ganger g.Hvitcellepellet indikerer fullstendig lysis av alle RBC. Hvis pelleten har rød farge, gjentar du behandling med RBC lysisbuffer. Aspirer den overnaturante og resuspend pellet i en til to milliliter av BEGM og deretter overføre de resuspended cellene til BMM belagte brønner.Inkuber ved 37 grader Celsius. Når de er belagt på BMM, vil cellene danne seg til sfæriske strukturer eller salispheres over en to til tre-dagers periode. Celler kan opprettholdes som salispheres i omtrent fem til syv dager før BMM begynner å forringe slik at cellene kan få tilgang til og holde seg til plasten og vokse som monolayer.Først aspirerer mediet fra brønnene og legger til en milliliter Dispase / Collagenase løsning til hver brønn. Inkuber ved 37 grader Celsius i ca. 15 minutter eller til BMM for det meste er oppløst. Deretter overfører cellene til et konisk rør på 15 milliliter og vasker brønner én gang med en til tre milliliter DPBS for å oppnå de gjenværende cellene.Sentrifuge i fem minutter ved 500 ganger g. Aspirer den overnaturante og resuspend pellet i to milliliter trypsin. Inkuber igjen ved 37 grader Celsius i 15 minutter.Deretter legger du til et komplett medium som inneholder 10 % serum for å nøytralisere Trypsin. Sentrifuge i fem minutter ved 500 ganger g. Aspirerer det overnaturante for å fjerne gjenværende medier, Trypsin og serum og deretter gjenbruke cellene i DPBS.Sentrifuge i fem minutter ved 500 ganger g. Aspirer den overnaturante og resuspend pellet i BEGM. For å opprettholde pellet som kuler, plate de resuspended cellene på størknet BMM belagt kultur retter.Kultur alle celler i en fuktet inkubator opprettholdt ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i fem til syv dager før subculturing. Mat med fersk BEGM hver to til tre dager. For å spre cellene som monolayer på plastkulturretter, aspirer BEGM-mediet fra parabolen og vask en gang med DBPS for å fjerne gjenværende medier.Tilsett to milliliter Trypsin og inkuber ved 37 grader Celsius i 15 minutter eller til cellene har helt løsrevet. Nøytraliser Trypsin ved hjelp av fire milliliter av alle komplette medier som inneholder 10 % serum. Deretter vipper du forsiktig parabolen og overfører celler til et 15 milliliter konisk rør.Vask platen en gang med omtrent fem milliliter DPBS for å samle de resterende cellene. Sentrifuge i fem minutter ved 500 ganger g. Aspirer det overnaturante.For å fjerne gjenværende medier, gjenbruke celler i seks til 10 milliliter DPBS. Sentrifuge i fem minutter ved 500 ganger g. Aspirer den overnaturlige og resuspend i BEGM.Deretter plate cellene på de behandlede plastvev kultur retter. Kultur cellene i en fuktet inkubator opprettholdt ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i fem til syv dager før subculturing. Mat med fersk BEGM hver to til tre dager.I denne protokollen, etter plating celler fra fordøyd vev på BMM i to til tre dager, celler lett dannet små klynger som fortsatte å utvide i størrelse opp til 15 til 20 celler per klynge. Salisphere celler ble belagt på celle kultivert behandlet plast og dyrket som en monolayer hvor de viser morfologi i samsvar med celler av epitelopprinnelse. Riktig aseptisk teknikk og forsiktighet er nødvendig for å unngå bakteriell eller soppforurensning.Ingen mengde antibiotika eller antimykotika vil redde en kultur som svermer med mikrober. Vi svarer på spørsmål om viral patogenese og overføring. Men for andre, Dette gir en måte å studere menneskelige spyttceller for en rekke applikasjoner som vev regenerering terapi.For oss som studerer humant Cytomegalovirus, har denne teknikken tillatt oss å begynne å utforske de molekylære mekanismene viruset benytter seg av for å infisere og til slutt overføre til nye verter. Ingenting som brukes i denne protokollen er iboende farlig, men forsiktighet bør alltid tas ved håndtering av menneskelig vev og noen form for kjemiske reagenser.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Av spyttkjertler, eggstokker, og embryo av Vector Mygg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spytt, spyttkjertel, og Hemolymph Collection fra Ixodes Scapularis Flått

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Utvikling av en spytt antistoff Multiplex Immunoassay å måle menneskelig eksponering for miljø patogener

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metode for måling av Salivary kjortelen funksjon i mus

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...