Name: establishment of gastric cancer patient-derived xenograft models and primary cell lines
Uploaded: 2019-07-19T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81572392); le National Key Research and Development Program of China (2016YFC1201704); Conseils scientifiques et techniques des jeunes talents innovateurs du Programme de soutien spécial du Guangdong (2016TQ03R614).
Nous remercions particulièrement Guangzhou Sagene Biotech Co., Ltd. pour son aide dans la préparation des chiffres.

Cette étude humaine a été approuvée par le Comité d'examen de l'éthique institutionnelle du Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, Chine). L'étude sur les animaux a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Sun Yat-sen. Remarque : toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lois pertinentes et aux lignes directrices institutionnelles, y compris la Ligne directrice pour la protection de l'exposition professionnelle co...

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Le cancer gastrique est une maladie agressive avec des options thérapeutiques limitées; ainsi, les modèles de cancer gastrique sont devenus une ressource essentielle pour permettre des études de recherche fonctionnelle avec la traduction directe à la clinique4,8,17. Ici, nous avons décrit les méthodes et le protocole d'établir des modèles gastriques de PDX de cancer et des lignées primaires de cellules. Fait important,...

Le cancer gastrique est le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde et la troisième cause de décès par cancer. En 2018, plus d'un million de nouveaux cas de cancer gastrique ont été diagnostiqués dans le monde, et on estime que 783 000 personnes ont été tuées par cette maladie1. L'incidence et la mortalité du cancer gastrique restent très élevées dans les pays du nord-est de l'Asie2,3. Malgré des progrès significatifs dans le domaine de la thérapeutique du cancer, le pronostic des patients atteints d'un cancer gastrique avancé demeure faible, avec un taux de survie à cinq ans d'environ 25 %4,5,6, 7,. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le cancer gastrique
Le traitement du cancer gastrique est difficile en raison de sa haute hétérogénéité8,9. Ainsi, la question de savoir comment relever les défis de l'hétérogénéité tumorale pour réaliser la médecine de précision est au cœur de la recherche sur le cancer. Les modèles in vitro et in vivo jouent un rôle crucial dans l'élucidation des mécanismes hétérogènes et de la biologie du cancer gastrique. Cependant, bien qu'il existe de nombreuses lignées de cellules cancéreuses gastriques et de nombreux modèles de souris transgéniques conventionnels pour la recherche préclinique, les inconvénients de ces modèles limitent leurs applications10. Parce que les caractéristiques de ces modèles ont changé dans la culture, ils ne modélisent plus l'hétérogénéité tumorale, et leurs réponses n'ont pas été en mesure de prédire les réponses chez l'homme11. Ces problèmes limitent considérablement la possibilité d'identifier des sous-groupes de patients atteints de cancer qui répondront aux médicaments ciblés. La culture à court terme des tumeurs primaires fournit un moyen relativement rapide et personnalisé d'étudier les propriétés pharmacologiques anticancéreuses, qui seront probablement la marque du traitement personnalisé du cancer.
Les xénogreffes dérivées du patient (PDX) sont préférées comme modèle préclinique alternatif pour le profilage de réponse de drogue12. En outre, les modèles PDX offrent un outil puissant pour étudier l'initiation et la progression du cancer13,14. Les modèles De PDX préservent l'aspect histologique des cellules cancéreuses, conservent l'hétérogénéité intratumorale, et reflètent mieux les composants humains pertinents du microenvironnement de tumeur15,16. Cependant, la limitation des modèles largement utilisés de PDX est le faible taux de succès pour établir et propager en série des tumeurs solides humaines. Dans cette étude, des méthodes décemment réussies pour établir des modèles de PDX et des lignées cellulaires primaires sont décrites.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Biologix, Shandong, China</td>
			<td>15-1040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>OLYMPUS, Tokyo, Japan</td>
			<td>OLYMPUS CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>HERACELL 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Basalmedia Technology, Shanghai, China</td>
			<td>L40601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-Thermostatic Water Cabinet</td>
			<td>Yiheng, Shanghai, China</td>
			<td>DK-8AXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada</td>
			<td>86150040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, China</td>
			<td>CN2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Tissue Kit Cryo Kit</td>
			<td>Celliver Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>LT2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Tissue Thaw Kit</td>
			<td>Celliver Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>LT2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSG</td>
			<td>Biocytogen, Beijing, China</td>
			<td>B-CM-002-4-5W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin&#38;streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>8118367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture Needles with Thread</td>
			<td>LingQiao, Ningbo, China</td>
			<td>3/8 arc 4&#215;10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-processed molds and auxiliary blades</td>
			<td>Celliver Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>LT2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>2003779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 collagenase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of gastric cancer patient-derived xenograft models and primary cell lines

L'utilisation de modèles précliniques pour faire progresser notre compréhension de la biologie tumorale et d'étudier l'efficacité des agents thérapeutiques est la clé de la recherche sur le cancer. Bien qu'il existe de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses gastriques établies et de nombreux modèles de souris transgéniques conventionnels pour la recherche préclinique, les inconvénients de ces modèles in vitro et in vivo limitent leurs applications. Parce que les caractéristiques de ces modèles ont changé dans la culture, ils ne modélisent plus l'hétérogénéité tumorale, et leurs réponses n'ont pas été en mesure de prédire les réponses chez l'homme. Ainsi, des modèles alternatifs qui représentent mieux l'hétérogénéité tumorale sont en cours de développement. Les modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient préservent l'aspect histologique des cellules cancéreuses, conservent l'hétérogénéité intratumorale, et reflètent mieux les composants humains pertinents du microenvironnement de tumeur. Cependant, il faut habituellement 4-8 mois pour développer un modèle de PDX, qui est plus long que la survie prévue de beaucoup de patients gastriques. Pour cette raison, l'établissement de lignées cellulaires cancéreuses primaires peut être une méthode complémentaire efficace pour les études de réponse médicamenteuse. Le protocole actuel décrit les méthodes d'établissement des modèles De PDX et des lignées cellulaires cancéreuses primaires à partir d'échantillons chirurgicaux de cancer gastrique. Ces méthodes constituent un outil utile pour le développement de médicaments et la recherche en biologie du cancer.

Ici, les tissus tumoraux d'une opération ont été préservés dans la solution de stock jusqu'à l'étape suivante. Dans les 4 heures, les tissus tumoraux ont été coupés en petits morceaux et implantés dans les flancs dorsaux des souris DeNSQui avaient été anesthésiés à l'aide de coton imbibé d'isoflurane. Les tumeurs de plus de 1 cm3 pourraient être réséquées pour l'implantation chez de nouvelles souris (figure1) ou tranchées soigneusement et conservées dans de ...

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Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Le protocole actuel décrit les méthodes pour établir des modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient et des lignées cellulaires cancéreuses primaires à partir d'échantillons chirurgicaux de cancer gastrique. Les méthodes fournissent un outil utile pour le développement de médicaments et la recherche en biologie du cancer.

Établissement de modèles de xénogreffe dérivés du cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Les modèles xénogreffes et les lignées cellulaires primaires dérivés du patient font désormais partie intégrante du développement de médicaments et de l’initiation et de la progression de la recherche en biologie tumorale. Les modèles Xenograft dérivés du patient préservent l’aspect histologique des cellules cancéreuses, conservent l’hétérogénéité intratumorale et reflètent mieux les composants humains pertinents du microenvironnement tumoral. Ses modèles sont pour des représentations plus précises du cancer humain que les lignées cellulaires cancéreuses traditionnelles et ont le potentiel d’améliorer l’évaluation préclinique de nouvelles thérapies anticancéreuses.En outre, ces modèles peuvent être utiles en comparant les caractéristiques moléculaires ou les signatures tumorales entre différents sous-groupes de patients atteints de cancer. Les souris NSG sont recommandées comme modèle immunodéficient de souris. En raison de l’immunodéficience grave des souris, la stérilité doit être maintenue dans toutes les expériences.Dans des conditions stériles, utilisez des forceps et des ciseaux pour disséquer soigneusement les tissus tumoraux et les couper en plusieurs petits morceaux. Après anesthésier la souris, utilisez des ciseaux stériles pour faire une incision d’un centimètre sur les deux flancs dorsal. Utilisez des forceps stériles pour perturber le tissu sous-cutané.Ensuite, couper un morceau du tissu tumoral, et le placer dans le site profond. Fermer la zone de l’implant par suture sous-cutanée avec des aiguilles de suture chirurgicales. Stériliser la plaie avec de l’iode.Après cela, placez doucement les souris dans une cage vide tout en maintenant la récumbence sternale. Portez une attention particulière aux souris qui devraient se réveiller et commencer à marcher après environ trois à quatre minutes. Placez les souris qui ont subi une intervention chirurgicale dans une nouvelle cage séparées de celles qui ne sont pas soumises à la chirurgie.Évaluez la taille de tumeur par palpation du site d’implantation et mesurez-les avec un étrier de Vernier deux fois par semaine. Après avoir euthanasié les souris, utilisez des forceps stériles et des ciseaux pour isoler lentement la tumeur des souris. Lavez les tissus tumoraux dans DPBS dans un plat de 10 centimètres.Vous forceps et ciseaux pour disséquer et enlever les zones nécrotiques, les tissus adipeux, les caillots sanguins et les tissus conjonctifs. Ensuite, utilisez un moule pour couper les tissus tumoraux à une épaisseur maximale d’un millimètre. Laver les tranches tumorales avec du DPBS dans un plat de 10 centimètres.Pour commencer le processus de vitrification, utilisez des forceps pour transférer les tranches dans le tube V1 et incuber à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes. Rouler et inverser brièvement le tube et incuber à quatre degrés Celsius pendant encore quatre minutes. Ensuite, versez la solution V1 et les tranches dans un plat de 10 centimètres et utilisez des forceps pour transférer les tranches dans le tube V2. Incuber à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes.Rouler et inverser brièvement le tube et l’incuber à quatre degrés Celsius pendant encore quatre minutes. Après cela, versez la solution V2 et les tranches dans un plat de 10 centimètres. Transférer les tranches dans le tube V3 et incuber à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Rouler et inverser brièvement le tube et incuber à quatre degrés Celsius pendant encore cinq minutes. Assurez-vous que toutes les tranches coulent au fond du tube. Si plusieurs tranches restent flottantes, roulez et inversez brièvement le tube et incubez à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que toutes les tranches coulent complètement.Verser ensuite la solution V3 et les couper en tranches dans un plat de 10 centimètres. Coupez les porte-tissus à la bonne longueur et placez-les sur de la gaze stérile. Transférer les tranches sur les supports.Envelopper les supports de gaze. À l’aide de forceps, placer les supports dans de l’azote liquide et les laisser incuber pendant cinq minutes. Après cela, étiquetez les flacons cryogéniques avec l’information tissulaire.Transférer les supports avec des tranches de tissu dans les flacons, qui seront stockés dans de l’azote liquide. Tout d’abord, réécectez des échantillons gastriques de cancer à partir de spécimens réséqués ou de tissus PDX récoltés. Placez les tissus sur la glace et transférez-les dans un plat de culture stérile de 10 centimètres.Utilisez des forceps et des ciseaux pour enlever les zones nécrotiques, les tissus adipeux, les caillots sanguins et les tissus conjonctifs. Lavez les tissus tumoraux une fois avec du DPBS contenant de la pénicilline et de la streptomiycine dans un plat de 10 centimètres. Ensuite, coupez la tumeur en morceaux sur le couvercle du plat.L’épaisseur maximale de chaque pièce doit être d’un millimètre. Transférer les morceaux dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres contenant sept millilitres d’une solution de collagène et de trypsine de type 1. Vortex le mélange brièvement.Incuber dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 minutes, en s’assurant de vortex le mélange toutes les cinq minutes. Après cela, ajouter un volume égal de RPMI-1640 moyen complété avec 10%FBS et vortex le mélange à fond. Transférer ce mélange dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres par filtration lente à travers un filtre de 40 microlitres.Centrifuger les filtrates à une vitesse comprise entre 113 et 163 fois g pendant cinq à sept minutes à température ambiante. Retirez soigneusement ce supernatant. Laver la pastille avec cinq millilitres de PBS et retirer soigneusement le supernatant.Si la pastille est rouge, elle contient des érythrocytes. Resuspendez doucement la pastille avec 500 microlitres de tampon de lyse de globule rouge et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter ensuite cinq millilitres de PBS.Centrifugeuse à une vitesse comprise entre 113 et 163 fois g pendant cinq à sept minutes à température ambiante. Retirer délicatement le supernatant et resuspendre la pastille avec le milieu de culture et transférer le mélange dans un plat stérile de 10 centimètres. Incuber la culture à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant de remplacer le milieu par un milieu contenant du sérum tous les deux à trois jours.Dans cette étude, des modèles gastriques de PDX de cancer et des lignes primaires de cellules sont établis. Les tumeurs de première génération se développent plus lentement que celles des générations suivantes, prenant trois semaines ou plus pour atteindre la taille appropriée. Le taux de réussite de la formation de tumeurs sous-cutanées de première génération est de plus de 80%L’identité des cellules cancéreuses des modèles PDX est confirmée à partir des modèles PDX par la coloration H&E.Le taux de succès de la formation de tumeur du tissu cryopreserved de tumeur est vu pour être approximativement 95%Cellules de tumeur peut être facilement identifiée par des différences dans la morphologie. Les cellules primaires sont authentifiées indépendamment par deux pathologistes au microscope. Pour plus de confirmation, la coloration H&E est utilisée pour observer la morphologie des cellules cancéreuses après fixation.Le taux d’isolement réussi des lignées cellulaires primaires est d’environ 40 %Ces modèles se sont montrés prédictifs des résultats cliniques et sont utilisés pour l’évaluation préclinique des médicaments par une identification par marqueur, des études biologiques et des stratégies de médecine personnalisée.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Développement et maintenance d&#39;une tumeur du patient Préclinique dérivé modèle de xénogreffe de l&#39;enquête de Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Mise en place d’une Culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de Patient

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Modèles de xénogreffe orthopiques dérivés du patient pour le carcinome humain de cellules urotheliales et la croissance de tumeur de cancer colorectal et la métastasie spontanée

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modèle de xénogreffe hétérogène dérivé par le patient du cancer du pancréas à l'aide de larves de poisson zèbre comme hôtes pour l'évaluation comparative des médicaments

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Un modèle de xénogreffe dérivé du mélanome

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolement et caractérisation des modèles organoïdes du bassin adénoïque du pancréas dérivé par le patient

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

L’établissement et l’utilisation de modèles de xénogreffes dérivés de patients de métastases du système nerveux central

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Génération et expansion de lignées tumorales de mésothéliome pleural malin primitif

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Évaluation des toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique à l’aide d’un modèle murin xénogreffé dérivé d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...