Name: establishment of gastric cancer patient-derived xenograft models and primary cell lines
Uploaded: 2019-07-19T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81572392) unterstützt; das Nationale Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (2016YFC1201704); Tip-top Wissenschaftliche und Technische innovative Jugendtalente des Guangdong Special Support Program (2016TQ03R614).
Wir danken Guangzhou Sagene Biotech Co., Ltd. ausdrücklich für die Unterstützung bei der Erstellung der Zahlen.

Diese Studie am Menschen wurde vom Institutional Ethics Review Board des Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, China) genehmigt. Die Tierstudie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sun Yat-sen University genehmigt. Hinweis: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und institutionellen Richtlinien durchgeführt, einschließlich der Leitlinie für den Schutz der beruflichen Exposition gegen blutübertragene Krankheitserreger.
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Magenkrebs ist eine aggressive Erkrankung mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten; So sind Modelle von Magenkrebs zu einer kritischen Ressource geworden, um funktionelle Forschungsstudien mit direkter Übersetzung in die Klinik4,8,17zu ermöglichen. Hier haben wir die Methoden und das Protokoll zur Etablierung von Magenkrebs-PDX-Modellen und primären Zelllinien beschrieben. Wichtig ist, dass sowohl morphologische als auch...

Magenkrebs ist die fünfthäufigste Krebsart weltweit und die dritthäufigste Krebstodesursache. Im Jahr 2018 wurden weltweit über 1.000.000 neue Fälle von Magenkrebs diagnostiziert, und schätzungsweise 783.000 Menschen wurden durch diese Krankheit getötet1. Die Inzidenz und Sterblichkeit von Magenkrebs ist in den nordöstlichen asiatischen Ländern nach wie vor sehr hoch2,3. Trotz signifikanter Fortschritte auf dem Gebiet der Krebstherapeutika bleibt die Prognose von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs schlecht, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von ca. 25%4,5,6, 7,. Daher besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Magenkrebs
Die Behandlung von Magenkrebs ist aufgrund seiner hohen Heterogenität eine Herausforderung8,9. So ist die Frage, wie man die Herausforderungen der Tumorheterogenität angehen kann, um Präzisionsmedizin zu realisieren, von zentraler Bedeutung für die Krebsforschung. In-vitro- und In-vivo-Modelle spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung der heterogenen Mechanismen und der Biologie von Magenkrebs. Obwohl es zahlreiche Magenkrebszelllinien und viele konventionelle transgene Mausmodelle für die präklinische Forschung gibt, schränken die Nachteile dieser Modelle ihre Anwendungenein 10. Da sich die Merkmale dieser Modelle in der Kultur verändert haben, modellieren sie keine Tumorheterogenität mehr, und ihre Reaktionen waren nicht in der Lage, Reaktionen beim Menschen vorherzusagen11. Diese Probleme schränken die Möglichkeit der Identifizierung von Untergruppen von Krebspatienten, die auf gezielte Medikamente ansprechen, stark ein. Die kurzfristige Kultur der Primärtumoren bietet eine relativ schnelle und personalisierte Möglichkeit, anticancer pharmakologische Eigenschaften zu untersuchen, die wahrscheinlich das Markenzeichen der personalisierten Krebsbehandlung sein wird.
Patienten-abgeleitete Xenografts (PDXs) werden als alternatives präklinisches Modell für die Wirkstoff-Profilierung12bevorzugt. Darüber hinaus bieten PDX-Modelle ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Initiierung und des Fortschreitens von Krebs13,14. PDX-Modelle bewahren das histologische Erscheinungsbild von Krebszellen, behalten intratumorale Heterogenität und spiegeln besser die relevanten menschlichen Komponenten der Tumormikroumgebung15,16wider. Die Einschränkung der weit verbreiteten PDX-Modelle ist jedoch die geringe Erfolgsrate bei der Etablierung und seriellen Verbreitung von soliden Tumoren beim Menschen. In dieser Studie werden anständig erfolgreiche Methoden zur Erstellung von PDX-Modellen und primären Zelllinien beschrieben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Biologix, Shandong, China</td>
			<td>15-1040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>OLYMPUS, Tokyo, Japan</td>
			<td>OLYMPUS CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.</td>
			<td>5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>HERACELL 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Basalmedia Technology, Shanghai, China</td>
			<td>L40601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-Thermostatic Water Cabinet</td>
			<td>Yiheng, Shanghai, China</td>
			<td>DK-8AXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada</td>
			<td>86150040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter, China</td>
			<td>CN2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Tissue Kit Cryo Kit</td>
			<td>Celliver Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>LT2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Tissue Thaw Kit</td>
			<td>Celliver Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>LT2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSG</td>
			<td>Biocytogen, Beijing, China</td>
			<td>B-CM-002-4-5W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin&#38;streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Solarbio, Beijing, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>8118367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Suture Needles with Thread</td>
			<td>LingQiao, Ningbo, China</td>
			<td>3/8 arc 4&#215;10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-processed molds and auxiliary blades</td>
			<td>Celliver Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>LT2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>2003779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 collagenase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of gastric cancer patient-derived xenograft models and primary cell lines

Die Verwendung präklinischer Modelle, um unser Verständnis der Tumorbiologie zu verbessern und die Wirksamkeit von therapeutischen Wirkstoffen zu untersuchen, ist der Schlüssel zur Krebsforschung. Obwohl es viele etablierte Magenkrebszelllinien und viele konventionelle transgene Mausmodelle für die präklinische Forschung gibt, schränken die Nachteile dieser In-vitro- und In-vivo-Modelle ihre Anwendungen ein. Da sich die Merkmale dieser Modelle in der Kultur verändert haben, modellieren sie keine Tumorheterogenität mehr, und ihre Reaktionen waren nicht in der Lage, Reaktionen beim Menschen vorherzusagen. So werden alternative Modelle entwickelt, die die Tumorheterogenität besser repräsentieren. Patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX) bewahren das histologische Erscheinungsbild von Krebszellen, behalten die intratumorale Heterogenität bei und spiegeln besser die relevanten menschlichen Komponenten der Tumormikroumgebung wider. Allerdings dauert es in der Regel 4-8 Monate, um ein PDX-Modell zu entwickeln, das länger ist als das erwartete Überleben vieler Magenpatienten. Aus diesem Grund kann die Etablierung primärer Krebszelllinien eine wirksame ergänzende Methode für Studien zur Wirkstoffreaktion sein. Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Erstellung von PDX-Modellen und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Diese Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Hier wurden Tumorgewebe aus einer Operation bis zum nächsten Schritt in Stammlösung konserviert. Innerhalb von 4 Stunden wurden Tumorgewebe in kleine Stücke geschnitten und in die dorsalen Flanken von NSG-Mäusen implantiert, die mit isoflurangetränkter Baumwolle betäustt worden waren. Tumoren größer als 1 cm3 könnten zur Implantation in neue Mäuse resektiert werden (Abbildung 1) oder sorgfältig geschnitten und gemäß dem Protokoll in flüssigem Stickstoff konserviert w...

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Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Die Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Patientenabgeleitete Xenograft-Modelle und primäre Zelllinien werden zu einem integralen Bestandteil der Arzneimittelentwicklung und der Einleitung und Progression der Tumorbiologieforschung. Von Patienten abgeleitete Xenograft-Modelle bewahren das histologische Erscheinungsbild von Krebszellen, behalten intratumorale Heterogenität bei und spiegeln besser die relevanten menschlichen Komponenten der Tumormikroumgebung wider. Seine Modelle sind für genauere Darstellungen von menschlichem Krebs als traditionelle Krebszelllinien und haben das Potenzial, die präklinische Bewertung neuer Krebstherapien zu verbessern.Darüber hinaus können diese Modelle nützlich sein, um molekulare Eigenschaften oder Tumorsignaturen zwischen verschiedenen Untergruppen von Krebspatienten zu vergleichen. NSG-Mäuse werden als immundefiziendes Mausmodell empfohlen. Aufgrund der schweren Immunschwäche der Mäuse muss die Sterilität in allen Experimenten aufrechterhalten werden.Verwenden Sie unter sterilen Bedingungen Zangen und Scheren, um das Tumorgewebe sorgfältig zu sezieren und in mehrere kleine Stücke zu schneiden. Nach der Anästhesisierung der Maus verwenden Sie eine sterile Schere, um einen ein Zentimeter großen Schnitt an beiden Rückenflanken zu machen. Verwenden Sie sterile Zangen, um das unterkutane Gewebe zu stören.Schneiden Sie dann ein Stück des Tumorgewebes ab und legen Sie es in die tiefe Stelle. Schließen Sie den Implantatbereich durch subkutane Naht mit chirurgischen Nahtnadeln. Sterilisieren Sie die Wunde mit Jod.Legen Sie die Mäuse danach vorsichtig in einen leeren Käfig, während Sie die Brustbelebung beibehalten. Achten Sie genau auf die Mäuse, wie sie aufwachen sollten und beginnen zu gehen nach etwa drei bis vier Minuten. Platzieren Sie Mäuse, die operiert werden, in einem neuen Käfig, getrennt von denen, die nicht operiert werden.Bewerten Sie die Tumorgröße durch Palpation der Implantationsstelle und messen Sie sie zweimal pro Woche mit einem Vernier-Sättel. Nach der Einschlämung der Mäuse, verwenden Sie sterile Zangen und Schere, um langsam den Tumor von den Mäusen zu isolieren. Waschen Sie das Tumorgewebe in DPBS in einer 10-Zentimeter-Schale.Sie zangen und Schere, um nekrotische Bereiche, Fettgewebe, Blutgerinnsel und Bindegewebe zu sezieren und zu entfernen. Als nächstes verwenden Sie eine Form, um das Tumorgewebe auf eine maximale Dicke von einem Millimeter zu schneiden. Waschen Sie die Tumorscheiben mit DPBS in einer 10-Zentimeter-Schale.Um den Verglasungsprozess zu beginnen, verwenden Sie Zangen, um die Scheiben in Rohr V1 zu übertragen und bei vier Grad Celsius für vier Minuten zu brüten. Rollen und invertieren Sie die Röhre kurz und inkubieren Bei vier Grad Celsius für weitere vier Minuten. Als nächstes gießen Sie die V1-Lösung und scheibenen in eine 10-Zentimeter-Schale und verwenden Zangen, um die Scheiben in Rohr V2 zu übertragen. Vier Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren.Rollen und invertieren Sie das Rohr kurz und inkubieren Sie es bei vier Grad Celsius für weitere vier Minuten. Danach die V2-Lösung und die Scheiben in eine 10-Zentimeter-Schale gießen. Die Scheiben in Tube V3 geben und bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang brüten.Rollen und invertieren Sie die Röhre kurz und inkubieren bei vier Grad Celsius für weitere fünf Minuten. Stellen Sie sicher, dass alle Scheiben auf den Boden des Rohres sinken. Wenn mehrere Scheiben schweben, rollen und invertieren Sie das Rohr kurz und tauchen Sie bei vier Grad Celsius ein, bis alle Scheiben vollständig sinken.Dann die V3-Lösung gießen und in eine 10-Zentimeter-Schale schneiden. Schneiden Sie die Gewebehalter auf die richtige Länge und legen Sie sie auf sterile Gaze. Übertragen Sie die Scheiben auf die Halter.Wrap die Halter mit Gaze. Mit Zangen die Halter in flüssigen Stickstoff geben und fünf Minuten brüten lassen. Danach die kryogenen Durchstechflaschen mit den Gewebeinformationen beschriften.Übertragen Sie die Halter mit Gewebescheiben in die Fläschchen, die in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Erstens, resektect Magenkrebsproben von resektierten Proben oder geernteten PDX-Geweben. Legen Sie das Gewebe auf Eis und übertragen Sie es in ein 10 Zentimeter steriles Kulturgericht.Verwenden Sie Zangen und Scheren, um nekrotische Bereiche, Fettgewebe, Blutgerinnsel und Bindegewebe zu entfernen. Waschen Sie das Tumorgewebe einmal mit DPBS, das Penicillin und Streptomycin in einer 10-Zentimeter-Schale enthält. Als nächstes schneiden Sie den Tumor in Stücke auf dem Deckel der Schale.Die maximale Dicke jedes Stückes sollte einen Millimeter betragen. Übertragen Sie die Stücke in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit sieben Millilitern einer Typ-1-Kollagenase und Trypsinlösung. Wirbeln Sie die Mischung kurz.In einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Minuten inkubieren, um sicherzustellen, dass die Mischung alle fünf Minuten wirbelt. Danach fügen Sie ein gleiches Volumen von RPMI-1640 Medium mit 10%FBS ergänzt und Wirbel die Mischung gründlich. Übertragen Sie dieses Gemisch durch langsame Filtration durch einen 40-Mikroliter-Filter in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr.Zentrifugieren Sie die Filtrate mit einer Geschwindigkeit zwischen 113 und 163 mal g für fünf bis sieben Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie diesen Überstand vorsichtig. Waschen Sie das Pellet mit fünf MilliliterPBS und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.Wenn das Pellet rot ist, enthält es Erythrozyten. Das Pellet mit 500 Mikrolitern roter Blutzelllysepuffer vorsichtig wieder aufhängen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang brüten. Fügen Sie dann fünf Milliliter PBS hinzu.Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit zwischen 113 und 163 mal g für fünf bis sieben Minuten bei Raumtemperatur. Den Überstand vorsichtig entfernen und das Pellet mit Kulturmedium wieder aufhängen und in eine sterile 10-Zentimeter-Schale geben. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass das Medium alle zwei bis drei Tage durch serumhaltiges Medium ersetzt wird.In dieser Studie werden Magenkrebs-PDX-Modelle und primäre Zelllinien ermittelt. Tumoren der ersten Generation wachsen langsamer als in späteren Generationen und dauern drei Wochen oder länger, um die entsprechende Größe zu erreichen. Die Erfolgsrate der subkutanen Tumorbildung der ersten Generation liegt bei über 80%Die Identität der Krebszellen aus PDX-Modellen wird aus PDX-Modellen durch H&E-Färbung bestätigt.Die Erfolgsrate der Tumorbildung aus kryokonserviertem Tumorgewebe ist etwa 95%Tumorzellen können leicht durch Unterschiede in der Morphologie erkannt werden. Die Primärzellen werden unabhängig voneinander von zwei Pathologen unter dem Mikroskop authentifiziert. Zur weiteren Bestätigung wird H&E-Färbung verwendet, um die Morphologie von Krebszellen nach der Fixierung zu beobachten.Die Rate der erfolgreichen Isolierung von primären Zelllinien beträgt ca. 40%Diese Modelle haben sich als prädiktiv für klinische Ergebnisse erwiesen und werden für die präklinische Arzneimittelbewertung durch eine Marker-Identifikation, biologische Studien und personalisierte Medizinstrategien verwendet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Forschung

Krebsforschung

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Erzeugung und Erweiterung primärer, maligner pleuraler Mesotheliom-Tumorlinien

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...