Name: tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion
Uploaded: 2019-07-20T14:00:00
Duration: 5 min 11 s
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Graças a Jane Reid para iniciar este programa, Barbara Terlouw para o desenvolvimento, Vahid Aslanzadeh para o "ura Looper" construções e Susana de Lucas para muitas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudos para a GIMO do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México (CONACYT) e da Universidade de Edimburgo escola de ciências biológicas, um Wellcome PhD Studentship para IEM [105256] e por Wellcome financiamento [104648] para JD Beggs . O trabalho no centro Wellcome para a biologia de pilha é apoiado pelo financiamento do núcleo de Wellcome [092076].

Nota: Consulte a Figura 2 para obter um resumo gráfico.
1. preparação de estirpe
<ol><li>
Utilizando uma estirpe ura3, introduza o sistema β-est Aid (ou seja, os genes que codificam o factor de transcrição responsivo β-estradiol (ATF) e o Ostir) e a tag Aid * a proteína alvo (ver Figura 3 e tabela 1 para um resumo do procedimento).
	<ol>
<li>Transforme15 pZTRK (marcador de resistência G418) ou pZTRL (marcadorLEU2 ) plasmídeo (disponível a partir do centro de recursos genéticos de levedura) na cepa ura3- levedura ou use o plasmídeo como modelo para produzir o produto PCR para Integração.</li>
		<li>O PCR amplifica o ATF (marcado Z4EVATF no mapa do plasmídeo) e Ostir usando um polymerase da alta fidelidade de um do plasmídeos pztrk ou de pztrl. Use primers com 50 a 60 base 3 ' extensões com homologia para a região genômica, para direcionar a integração por recombinação homóloga16. Para a integração genômica dos dois componentes separadamente ou em conjunto, ver tabela 1 para primers e condições. Nota: A estirpe pZ4EV-NTR1 tem os componentes já integrados no genoma (disponível a partir do centro de recursos genéticos de levedura, Japão).</li>
		<li>Certifique-se de que a proteína alvo é AID * etiquetada utilizando o procedimento de longtine17 (ver Figura 3B e tabela 1).</li>
		<li>Realize uma análise de crescimento da cepa sem β-estradiol e IAA presentes para determinar se a tag AID * afeta o crescimento e prever a taxa de crescimento para uso na etapa 1,5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. procedimento geral de esgotamento
<ol><li>Calcule quanta cultura é necessária para que todas as amostras sejam coletadas; por exemplo, 10 mL de cultura em OD600 de 0,8 é suficiente para a extração de proteínas, RNA e DNA para uma única amostra, portanto, para 6 amostras, pelo menos 60 ml de cultura é necessária.</li>
	<li>De uma cultura overnight, configurar uma cultura nova suficiente em OD600 0,1 para 0,2 e deixar de crescer a 30 ° c. Um meio rico como o YPDA é recomendado, embora outras condições de crescimento possam ser usadas:<table><tbody>
<tr>
<td>Extrato de levedura</td>
				<td>10 g de</td>
			</tr>
<tr>
<td>Peptona</td>
				<td>20 g de</td>
			</tr>
<tr>
<td>Glicose</td>
				<td>20 g de</td>
			</tr>
<tr>
<td>Sulfato de adenina</td>
				<td>40 mg</td>
			</tr>
<tr>
<td>H2o a</td>
				<td>1 litro</td>
			</tr>
</tbody></table>
 Nota: Autoclave ou filtro esterilizar; a esterilização do filtro é preferida como os complexos do peptide/açúcar produzidos pelo precipitado autoclavagem no metanol usado na coleção da amostra.</li>
	<li>Prepare-se para receber as amostras.
	<ol>
<li>Coloque 30 a 50% do volume amostral pretendido de metanol em um tubo. Por exemplo, se uma amostra de 10 mL for tomada, coloque 5 mL de metanol em um tubo Falcon de 15 mL e feche o tubo firmemente. Uma vez que fechado, Rotule o tubo e põr sobre o gelo seco ou em-80 ° c para refrigerar. Atenção: Dispense o metanol em uma capa de fumaça.</li>
		<li>Rotule 1,5 tubos de mL para o armazenamento a longo prazo das amostras e coloc no gelo para refrigerar.</li>
		<li>Arrefecer o suficiente H2o (pelo menos 1 ml por amostra) no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Antecipar o crescimento da cultura. A OD alvo para a coleta das amostras é de aproximadamente 0,7 a 0,8, mas a etapa de pré-incubação (a incubação com β-estradiol para induzir o osTIR), precisa ser iniciada mais cedo para que a cultura atinja aproximadamente a OD direita no momento em que as amostras são Coletados. Nota: É aconselhável realizar uma curva de crescimento nas condições a serem utilizadas no experimento para que esta OD inicial possa ser estimada.</li>
	<li>Uma vez atingida a OD alvo para o início da pré-incubação, tomar uma amostra (geralmente 10 mL), no tubo pré-preparado contendo metanol frio. Inverta brevemente para misturar e colocar de volta no gelo seco. Nota: A amostra pode ser movida para o gelo de água após cerca de 5 min, se conveniente para fazê-lo.</li>
	<li>Adicione imediatamente o β-estradiol, 1 μL/mL de cultura (concentração final de 10 μM); ter o β-estradiol pré-medido em uma pipeta pronta para uso, a fim de reduzir o tempo necessário entre a coleta da amostra e a adição do β-estradiol. Misture rapidamente girando vigorosamente.</li>
	<li>Continuar a cultivar a cultura como antes (passo 2,2), incubar (esta é a etapa de "pré-incubação") com β-estradiol para o tempo ideal (para a determinação do tempo de pré-incubação ideal ver Figura 1).</li>
	<li>Prepare-se para adicionar IAA (auxina). Tome acima o volume de IAA necessário para a etapa 2,10 (isto é, 0,5 μL de IAA por o mL da cultura). Isso torna o passo 2,20 mais rápido.</li>
	<li>Colete uma amostra como etapa 2,5.</li>
	<li>Adicione imediatamente IAA 0,5 μL/mL de cultura a uma concentração final de 750 μM conforme preparado na etapa 2,8. Misture rapidamente girando vigorosamente.</li>
	<li>Colete amostras, como etapa 2,5, de acordo com seu projeto experimental. Ou uma única amostra, em um momento em que se espera que a proteína será seguramente esgotada, ou várias amostras em um curso de tempo de depleção. Por exemplo, os intervalos de 5 minutos são convenientes para o sincronismo e fornecem uma escala de níveis da proteína. A estratégia de otimização, como mostrado na Figura 1, dará uma indicação de horários adequados.</li>
	<li>Processe as amostras.
	<ol>
<li>Coloque as amostras no gelo, se não for feito já. Assegure-se de que nenhuma das amostras tenha congelado; Se eles têm, suavemente quente na mão, invertendo constantemente para que a temperatura não sobe localmente. Nota: Isto é feito melhor na mão como a temperatura da amostra pode ser avaliada, ele deve sempre sentir frio. Coloque no gelo. Este não é um ponto de pausa-uma vez que todas as amostras são fluidas, prossiga para a próxima etapa.</li>
		<li>Uma vez que todas as amostras foram coletadas e não estão mais congeladas, gire em 3.500 x g por 2 min (a 4 ° c, se possível).</li>
		<li>Despeje o metanol/mistura média e coloque de volta no gelo; Não se preocupe se nem todo o líquido foi removido.</li>
		<li>Ressuscita o pellet de células em 1 mL de gelo frio H2o (a partir do passo 2.3.3) e transfere para um tubo rotulado de 1,5 ml (preparado no passo 2.3.2) no gelo.</li>
		<li>Gire brevemente (por exemplo, 10 s de tempo total) em > 15000 x g para re-pellet as células, coloque de volta no gelo e retire o líquido.</li>
		<li>Retire o H2o por aspiração. As pelotas da pilha podem ser armazenadas em-20 ° c, ou-80 ° c para o armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique o nível para o qual a proteína foi esgotada pela análise Western blot18. Nota: A proteína suficiente19 e/ou o ácido nucleico podem ser extraídos de uma única pelota da pilha para a maioria de finalidades, embora as espécies raras do RNA possam exigir mais volume da amostra.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anchor-Away+Technique:+Rapid,+Conditional+Establishment+of+Yeast+Mutant+Phenotypes.">The Anchor-Away Technique: Rapid, Conditional Establishment of Yeast Mutant Phenotypes.</a> Molecular Cell. 31, 925-932 (2008).</li><li>Bell&#237;, G., Gar&#237;, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activator/repressor+dual+system+allows+tight+tetracycline-regulated+gene+expression+in+budding+yeast.">An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast.</a> Nucleic Acids Research. 26, 942-947 (1998).</li><li>Alexander, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling.">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um protocolo bem otimizado pode produzir depleção rápida e eficiente da proteína alvo. Determinar o tempo de pré-incubação aproximado com β-estradiol é importante, pois isso aumenta a reprodutibilidade do esgotamento, mas pequenas variações no tempo de pré-incubação podem ser toleradas. Por outro lado, deve-se tomar cuidado com o tempo após a adição de auxina, pois o nível de proteína diminui muito rapidamente.
Uma vantagem dessa abordagem é que a depleção ajustada pode ser alcançada por diferentes combinações de tempo de pré-incubação com o tempo de incubação de β-estradiol e IAA. Por exemplo, se desejado, a proteína alvo pode ser mais lentamente esgotada, reduzindo o tempo de pré-incubação.
O sistema de ajuda β-est oferece certas vantagens em relação aos sistemas em que o OsTIR é expresso constitutivamente. Por exemplo, se a proteína alvo for essencial para a viabilidade, a expressão regulada de osTIR pode evitar a depleção prematura da proteína alvo. Além disso, a expressão de osTIR pode ser ajustada para se adequar à abundância da proteína alvo e sua susceptibilidade à degradação, e a depleção pode ser rápida ou lenta. Os dois efetores de moléculas pequenas, β-estradiol e AUXINA, não perturbam o metabolismo das leveduras nas condições aqui utilizadas, diferentemente da rapamicina, utilizadas no sistema âncora-afastado1.
Deve-se notar que a marcação de algumas proteínas interrompe a sua função, o que é um problema com qualquer sistema de esgotamento alvo. Nesse caso, uma marca N-terminal pode funcionar quando uma marca de terminal C não. Além disso, nem todas as proteínas serão esgotadas eficientemente; por exemplo, a tag-AID na proteína alvo pode ser inacessível à proteína osTIR. Portanto, após a etiquetagem de ajuda, cada proteína alvo deve ser testada para qualquer efeito da marca no crescimento, e para determinar se a depleção é efetiva, antes que os intervalos de pré-incubação de β-estradiol e o tratamento de auxina sejam otimizados.
Este sistema AID * é muito simples e é compatível com qualquer procedimento experimental subsequente que não envolva um crescimento adicional, como a análise de proteínas, DNA ou RNA ou microscopia. Além, o sistema trabalha bem quando combinado com o thiolabelling para purificar o RNA nascente20.
Este sistema fornece um rápido, específico, e reprodutível meios de esgotar uma proteína sem de outra forma afetando o metabolismo da célula de levedura.

Mutações condicionais, como mutantes sensíveis à temperatura, são uma ferramenta poderosa para o estudo de proteínas essenciais, permitindo o crescimento celular a condição permissiva, mas causando perda de função condições não permissivas. No entanto, o metabolismo celular pode ser seriamente perturbado pela mudança nas condições de crescimento necessárias para induzir o defeito e também pode criar efeitos fora do alvo. Vários métodos foram desenvolvidos, em que a proteína de interesse é condicionalmente seqüestrado1 ou sua expressão é controlada2,3 por adição de uma pequena molécula. Este protocolo utiliza auxina e o sistema de degron (AID) auxina-inducible para esgotar eficientemente uma proteína alvo.
O sistema AID tem sua origem em plantas, onde uma auxina (neste protocolo indol-3-ácido acético (IAA) é usada), estimula a interação da proteína aux/IAA com TIR1, um membro do complexo de ligase de ubiquitina SCF U34. A interação complexa do SCF causa a poliubiquitinação das proteínas da família aux/IAA, o que resulta em sua degradação pelo Proteassoma5,6.
Este sistema foi previamente adaptado para uso na levedura Saccharomyces cerevisiae7,8 expressando a proteína TIR1 de Oriza Sativa (Ostir) em células de levedura, onde é capaz de interagir com o fermento endógeno Complexo SCF. A proteína de interesse foi marcada com um motivo da proteína aux/IAA IAA17 para direcioná-la para a degradação. Os truncamentos funcionais de IAA17 foram desenvolvidos mais tarde, tais como o auxílio *8,9,10, contendo o 43 de aminoácido auxina-motivo sensível do IAA17 de Arabidopsis Arabidopsis thaliana, junto com um Tag do epítopo para permitir Detecção.
O sistema inicialmente adaptado para uso em brotamento de levedura7,8 expressou a proteína osTIR1 de um promotor de galão de levedura. A expressão requer a mudança para o meio de crescimento com galactose como a única fonte de carbono, que, infelizmente, resulta em uma mudança diauxica com mudanças de amplo alcance para o metabolismo celular11. Por outro lado, tem sido relatado que a expressão constitutiva de TIR1 pode levar à degradação da proteína alvo na ausência de auxina/IAA12 se o nível de expressão for alto, enquanto a baixa expressão de TIR1 provoca depleção ineficiente. Foi desenvolvido um sistema de auxílios melhorado denominado β-est Aid em que o Ostir está o controlo de um promotor induzível que é sintonável para se adequar à proteína alvo, com efeito mínimo no metabolismo celular. Para isso, foi construído um fator de transcrição artificial (ATF) no qual o ativador de transcrição viral VP16 é fundido a um receptor de estrogênio e um domínio de ligação de DNA de quatro dedos de Zn (DBD). Quando o β-estradiol (um estrogénio) está presente, a ATF pode entrar no núcleo e induzir a transcrição do Ostir ligando ao seu promotor (Z4EVpr)13,14.
a expressão de osTIR é geralmente detectável aproximadamente 20 minutos após a adição de β-estradiol12. Entretanto, a duração óptima da expressão de Ostir para conseguir o esgotamento eficiente da proteína etiquetada com auxina, ao evitar a prostração antes da adição do auxina, precisa de ser determinada empiricamente para cada proteína do alvo. Um tempo aproximado para esta pré-incubação pode ser estimado a partir de valores de abundância no banco de dados do genoma de Saccharomyces (SGD https://www.yeastgenome.org/). Como pode ser observado na Figura 1, a proteína abundante, Dcp1 (2880 a 4189 moléculas/célula), requer 40 min de pré-incubação com β-estradiol, sem depleção de auxina independente observada. A proteína muito menos abundante, prp2 (172 a 211 moléculas/pilha), é empobrecido fortemente após somente 20 minutos do pre-incubação. É aconselhável testar dois tempos de pré-incubação adicionais, 10 a 20 minutos antes ou depois deste tempo estimado inicial (20 min é o tempo mínimo recomendado). O tempo de pré-incubação ideal é o tempo em que a proteína alvo não se esgotou antes de adicionar auxina e uma vez que a auxina é adicionada a depleção é aceitável ou os níveis de proteína se aproximam do mínimo possível. Assim, a partir da Figura 1b, para Prp22 com 30 min de pré-incubação, os níveis não diminuíram muito 10 min após a adição de auxina. Comparando-se com 40 min de pré-incubação e 15 min com IAA, onde há pouca depleção adicional, não há benefício na incubação com auxina maior que 10 min ou pré-incubando por mais de 30 min, particularmente porque há evidência de não-auxina depleção dependente em 40 min. Para Dcp1 com 40 min de pré-incubação (o último ponto em que o nível de proteína é aproximadamente 100% antes da adição de auxina), 15 a 20 min de depleção com auxina é aceitável. Recomenda-se manter o tempo de depleção o mais curto possível para reduzir os efeitos secundários no metabolismo celular14.
Este artigo demonstra como usar o sistema de β-est AID otimizando o sincronismo da incubação do β-estradiol para a expressão de osTIR para conseguir a prostração rápida da proteína do alvo em cima da adição de IAA sem prostração antes de adicionar o auxin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine sulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#914;-estradiol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2758-1G</td>
			<td>10mM solution in ethanol. Store at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>42780</td>
			<td>DMSO should be solid at 4 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 1H-Indole-3-acetic acid</td>
			<td>Across Orgainics</td>
			<td>122150100</td>
			<td>Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M/4000/PC17</td>
			<td>CAUTION Toxic and flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>PEP03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCSM single drop-out &#8211;ura</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DSCS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>YEA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0410</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion

O receptor de ligação de auxina da planta, TIR1, reconhece as proteínas que contêm um motivo de degron auxina-inducible específico (AID) na presença de auxina, visando-os para a degradação. Este sistema é explorado em muitos eucariontes não vegetais, de tal forma que uma proteína alvo, marcada com o motivo AID, é degradada na adição de auxina. O nível de expressão TIR1 é crítico; a expressão excessiva conduz à degradação da proteína AID-etiquetada mesmo na ausência de auxin, visto que a baixa expressão conduz à prostração lenta. Um sistema de auxílio β-estradiol-induzível foi criado, com expressão de TIR1 o controle de um promotor induzível do β-estradiol. O nível de TIR1 é sintonável alterando o tempo de incubação com β-estradiol antes da adição de auxina. Este protocolo descreve como esgotar rapidamente uma proteína alvo usando o sistema AID. O tempo adequado de incubação de β-estradiol depende da abundância da proteína alvo. Portanto, a depleção eficiente depende do tempo ideal que também minimiza a depleção independente de auxina.

Exemplos representativos de depleção são exibidos na Figura 1. Os três experimentos apresentados nesta figura foram experimentos de otimização para depleção das proteínas prp2, Prp22 e Dcp1. A baixa abundância, as proteínas prp2 e Prp22 de spliceosomal esgotou-se a menos de 20% após o 40 min pre-incubação com β-estradiol seguido por 15 minutos com auxin. Tempos de pré-incubação mais longos levam a depleção mais rápida, mas também mostram depleção de proteínas indesejáveis antes da adição de auxina. Em comparação, o Dcp1 mais abundante foi apenas esgotado para aproximadamente 30% com o mesmo tratamento, mas 60 min de pré-incubação resultou em depleção para 13% com o mesmo tratamento de auxina, ao custo de depleção antes da adição da auxina. É possível que 50 min de pré-incubação com β-estradiol e 15 min com auxina teria conseguido resultados semelhantes em um ponto de tempo mais curto e assim teria sido mais ideal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig01.jpg"> Figura 1: a taxa de depleção pode ser ajustada modulando a duração da pré-incubação de β-estradiol. Western blot18 de proteínas alvo: (a e b) PRP22-Aid *-6 Flag, (c e d) prp2-Aid *-6 Flag, e ( e e f) Dcp1-Aid *-6ha, a partir de culturas pré-incubadas com β-estradiol (β-est) para 20, 30, 40, ou 60 min antes da auxina adição12. Quantidades iguais de proteína total foram carregadas em cada pista. Pgk1 é detectado como um controle de carregamento Visual, exceto para o painel e, onde Pgk1 e Dcp1 comigrar. A quantificação das bandas proteicas nos painéis a, c e e é mostrada nos painéis b, de f, respectivamente. Como medida de taxa de depleção, calculou-se a inclinação (m) para a seção linear (de 100% para 30% dos valores iniciais) de cada curva. O tempo de pré-incubação ideal é o tempo em que os níveis proteicos ainda estão próximos dos níveis não induzidos (100%) e a taxa subsequente de depleção é rápida. Para Dcp1 (f), 60 min de pré-incubação é muito longo, como a proteína começou a degradar na ausência de auxina, enquanto 20 min é muito curto, como a proteína não se esgota de forma apreciável neste curso de tempo. Após 40 min de pré-incubação, 15 min com auxina pode ser usado como a proteína é de aproximadamente 70% empobrecido e, embora 20 min resultaria em mais depleção, também poderia resultar em efeitos secundários. As barras de erro representam o desvio padrão de duas replicações biológicas. Para cada experimento, um borrão representativo é mostrado. Esse valor é derivado da publicação anterior9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig02v2.jpg"> Figura 2: Resumo gráfico. Adicionar β-estradiol a cultura suficiente crescendo em meio rico e na temperatura desejada, a fim de iniciar a pré-incubação. Continue o crescimento para o tempo de pré-incubação necessário antes de adicionar IAA (auxina) para iniciar a depleção. Os tempos de pré-incubação e depleção dependem da proteína a ser esgotada, mas a pré-incubação é muitas vezes na faixa de 20-60 min e o tempo de depleção é tipicamente na ordem de 10 a 20 min. 10 mL de amostras devem ser tomadas no início e no fim da pré-incubação e durina g o esgotamento. Estas amostras são rapidamente fixadas em metanol frio antes de peletização e armazenamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig02v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59874/59874fig03.jpg"> Figura 3: geração de estirpe para o sistema B-est. (a) para gerar uma estirpe de levedura com o sistema Aid *, tanto o pZTRL (LEU2) ou o pztrk (kanamycin (G418) resistência), plasmídeo deve ser introduzido na estirpe ou, alternativamente, o ATF e Ostir pode ser inserido no genoma por recombinação homous de um fragmento gerado pelo PCR de 3 ' primers finais (veja a Figura 3B e a tabela 1). (b) C-a etiquetagem terminal da proteína alvo é conseguida pela amplificação do PCR da região apropriada do PURA3-Aid do plasmídeo *-6flag (pURA3_AID *-6ha difere somente no Tag e pode ser tratada exatamente da mesma maneira), usando os primers S3-F de longtine e S2-R com 3 ' extensões homólogo à extremidade 3 ' da proteína do alvo. A extensão da cartilha para a frente deve incluir o último Codon do aminoácido no quadro com o início da etiqueta AID * e não deve incluir o Codon de batente. A extensão de primer reverso deve ser para uma região a jusante da região de codificação. Uma vez inseridos no genoma, as células que perderam o marcador URA3 (por recombinação homous entre as regiões idênticas encontradas em ambas as extremidades do marcador) podem ser selecionadas pelo crescimento com 5-Foa, que contraria URA3 células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59874/59874fig03large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8">a. sequências de primer</td>
		</tr><tr><td>Alvo</td>
			<td>Localização</td>
			<td>Primer</td>
			<td>Nome</td>
			<td colspan="3">Seqüência</td>
			<td>TM (° c)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">o pZTRL</td>
			<td>516</td>
			<td>F</td>
			<td>pZTRL_F</td>
			<td colspan="3"><-região de homologia-> GCGACAGCATCACCGACTTCG</td>
			<td>61,23</td>
		</tr><tr><td>7897</td>
			<td>R</td>
			<td>pZTR_R</td>
			<td colspan="3">CGCCGCCTCTACCTTGCAGA <-região de homologia (RC)-></td>
			<td>61,30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">o pZTRK</td>
			<td>9154</td>
			<td>F</td>
			<td>pZTRK_F</td>
			<td colspan="3"><-região de homologia-> ACGTTGAGCCATTAGTATCAATTTGCTTACC</td>
			<td>59,40</td>
		</tr><tr><td>5897</td>
			<td>R</td>
			<td>pZTR_R</td>
			<td colspan="3">CGCCGCCTCTACCTTGCAGA <-região de homologia (RC)-></td>
			<td>61,30</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="2">pURA3-AID *-6BANDEIRA ou pURA3_AID *-6HA</td>
			<td>F</td>
			<td>S3-F</td>
			<td colspan="3"><-região de homologia-> CGTACGCTGCAGGTCGAC</td>
			<td>59,21</td>
		</tr><tr><td>R</td>
			<td>S2-R</td>
			<td colspan="3">ATCGATGAATTCGAGCTCG <-região de homologia (RC)-></td>
			<td>52,76</td>
		</tr><tr><td colspan="8">pZRTL/K é amplificar o sistema β-est AID</td>
		</tr><tr><td colspan="8">pURA3-Aid *-6 Flag/6ha para amplificar o auxílio * e epítopo mapeado tag para etiquetar a proteína alvo (procedimento lontine)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"><-região de homologia-></td>
			<td colspan="5">Região homólogo às regiões flanqueando onde o sistema deve ser introduzido. Quanto mais essa região for mais provável, a modificação será bem-sucedida; 50-100 bases é recomendado.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"><-região de homologia (RC)-></td>
			<td colspan="5">Região homólogo às regiões flanqueando onde o sistema deve ser introduzido, recorde usar o complemento reverso. Como acima, quanto mais tempo esta região é melhor.</td>
		</tr><tr><td colspan="3">TM (° c)</td>
			<td colspan="5">TM utilizando o método% GC com 50 mM NaCl</td>
		</tr><tr><td colspan="8">b. PCR Mix</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Componente</td>
			<td colspan="4">Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Modelo</td>
			<td colspan="4">< 10</td>
		</tr><tr><td colspan="4">NEB Phusion HF buffer (5x) *</td>
			<td colspan="4">100</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Primer forward 100 μM</td>
			<td colspan="4">2,5</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Primer reverso 100 μM</td>
			<td colspan="4">2,5</td>
		</tr><tr><td colspan="4">dNTPs 10 mM cada</td>
			<td colspan="4">10</td>
		</tr><tr><td colspan="4">H2O</td>
			<td colspan="4">a 500</td>
		</tr><tr><td colspan="8">* O NEB Phusion GC buffer (5x) também pode ser usado, mas não é preferível</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Fazer esta mistura, dividida em 10 tubos de 50 μL misturar cada um e executar o PCR como tabela 1 c.</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Verifique o PCR funcionou executando em um gel do agarose</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Combine todas as reações bem-sucedidas em um tubo e etanol precipitado</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Transforme o fermento com todo o material produzido pelo PCR</td>
		</tr><tr><td colspan="8">c. condições de PCR</td>
		</tr><tr><td colspan="6">Passo</td>
			<td>Temp (° c)</td>
			<td>Tempo</td>
		</tr><tr><td colspan="6">Desnaturação inicial</td>
			<td>98</td>
			<td>de 30 s</td>
		</tr><tr><td colspan="3" rowspan="3">25-35 ciclos</td>
			<td colspan="3">Desnaturar</td>
			<td>98</td>
			<td>10 de s</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Anneal</td>
			<td>45 – 60</td>
			<td>20 de s</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Extensão</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s/KB</td>
		</tr><tr><td colspan="6">Extensão final</td>
			<td>72</td>
			<td>10 minutos</td>
		</tr><tr><td colspan="6">Segurar</td>
			<td>8</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="8">Anneal a 45 ° c para o conjunto primário Lontine (S3-F e S2-R) e 60 ° c para os primers pZTRL/K</td>
		</tr><tr><td colspan="8">Estender por 3 minutos para o PCR Lontine e 3 minutos para pZTRL/K</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: sequências da cartilha, mistura de PCR e condições de PCR.

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Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

Ajustando a degradação para conseguir a depleção de proteína específica e eficiente

Aqui, apresentamos um protocolo para efetivamente e especificamente esgotar uma proteína de interesse na levedura Saccharomyces cerevisiae usando o sistema β-est Aid.

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Uma técnica comum para descobrir a função de uma proteína é excluí-la e ver o que acontece. Mas você não pode fazer isso com uma proteína essencial. É essencial, a célula morre.Então você precisa de uma maneira de remover essa proteína e ter um vislumbre do que acontece pouco antes da morte celular. O esgotamento da proteína deve ser rápido, então você não tem efeitos secundários. Deve ser específico, de modo que só essa proteína é removida e só esgotada quando você quiser que seja.E não deve afetar a célula de outra forma além de remover essa proteína. Depois de preparar a cepa, use uma cultura durante a noite para determinar qual diluição é necessária. Use essas informações para criar uma nova cultura suficiente com um OD600 entre 0,1 e 0,2, e cultivá-la a 30 graus Celsius.Em um capô de fumaça, adicione um metanol equivalente a 30 a 50% do volume amostral pretendido a um tubo de 15 mililitros. Feche os tubos firmemente, rotule-os e coloque-os em gelo seco para esfriar. Em seguida, rotule tubos de 1,5 mililitro para armazenamento a longo prazo das amostras e coloque no gelo para esfriar.Esfrie pelo menos um mililitro de água por amostra no gelo. Uma vez alcançada a densidade óptica alvo para o início da pré-incubação, transfira uma amostra para o tubo pré-preparado contendo metanol frio. Inverta o tubo brevemente e coloque-o de volta no gelo seco.Esta é a amostra de controle não induzida. Imediatamente, adicione o beta-estradiol de tal forma que a concentração final seja de 10-micromolar. Redemoinho vigorosamente para misturar.Continue a crescer a cultura como antes, incubando com beta-estradiol para o momento ideal, como descrito no protocolo de texto. O tempo de incubação beta-estradiol é o passo mais importante, e deve ser otimizado para cada proteína. Muito curto e o esgotamento é incompleto e lento.Muito tempo e os níveis de proteína cairão mesmo antes de você adicionar a auxina. Pipeta até 0,5 microliters de IAA por mililitro de cultura para adicionar mais tarde. Colete uma amostra da cultura não sepleted como descrito anteriormente.Adicione imediatamente o IAA a uma concentração final de 750 micromolar e redemolar vigorosamente para misturar. Inicie um temporizador o mais rápido possível após a mistura. Coletar amostras de acordo com o projeto experimental.Em seguida, coloque as amostras no gelo. Certifique-se de que nenhuma das amostras tenha congelado. Se houver, aqueça-os suavemente na mão enquanto inverte constantemente.Uma vez que todas as amostras são coletadas e não congeladas, centrifuá-las a 3.500 vezes G e quatro graus Celsius por dois minutos. Despeje o metanol e a mistura média e coloque as amostras de volta no gelo. Em seguida, resuspense a pelota celular em um mililitro de água e transfira esta suspensão para um tubo rotulado no gelo.Centrífuga brevemente a uma velocidade acima de 15.000 vezes G para repelir as células. Depois disso, coloque os tubos de volta no gelo e aspire o líquido. Neste estudo, a degradação é ajustada para alcançar o esgotamento proteico específico e eficiente sem afetar de outra forma o metabolismo da célula de levedura.As proteínas Prp2 e Prp22 de baixa abundância são esgotadas para menos de 20% após 20 minutos de pré-incubação com beta-estradiol, seguidas por 15 minutos com auxina. Tempos mais longos de pré-incubação levam a um esgotamento mais rápido, mas também mostram esgotamento proteico indesejável antes da adição de auxina. Em comparação, o Dcp1 mais abundante só está esgotado para aproximadamente 30% com o mesmo tratamento.No entanto, 60 minutos de tempo de pré-incubação resultam em esgotamento para 13% com o mesmo tratamento de auxina ao custo de esgotamento antes que a auxina seja adicionada. Otimize o tempo de pré-incubação e não perca a noção do tempo entre seus pontos de tempo. O que fazer a seguir depende da sua pergunta.Descobrimos que a amostra de 10 mils da cultura é suficiente para análise de proteína, DNA ou RNA. O procedimento amostral também é facilmente adaptável para ChIP. Agora há uma maneira rápida e específica de esgotar proteínas.Assim, a função até mesmo de proteínas essenciais pode ser encontrada. O protocolo é bastante seguro. Metanol é o único produto químico perigoso.Tome cuidado enquanto o dispensa. Faça isso em um capuz de fumaça, e use dois pares de luvas, como o metanol pode passar pela maioria das luvas de nitrito.

Research

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