Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر كاشانشي، وخاصة جوين كوكس. وقد تم دعم هذا العمل بمنح المعاهد الوطنية للصحة (AI078859، AI074410، AI127351-01، AI043894، وNS099029 إلى F.K.).

1. الترشيح وهطول الأمطار من الحويصلات خارج الخلية (EVs)
<ol><li>لإعداد الثقافة الفائقة من الخلايا المصابة أو المنقولة (أي خطوط الخلايا و/أو الخلايا الأولية)، والثقافة حوالي 10 مل من الخلايا المتأخرة لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ثاني أكسيد الكربون في وسط الثقافة المناسبة (أي RPMI أو DMEM مع 10٪...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+is+released+in+extracellular+vesicles+derived+from+astrocytes:+evidence+for+Nef-mediated+neurotoxicity.">HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (1), e2542 (2017).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-9+Released+from+HIV+Tat+Stimulated+Astrocytes+Mediates+Microglial+Migration.">Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Carry+HIV+Env+and+Facilitate+Hiv+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue.">Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).</li><li>Jaworski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphotropic+virus+type+1-infected+cells+secrete+exosomes+that+contain+Tax+protein.">Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).</li><li>Heinemann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

تسمح الطريقة الموضحة بتعزيز عائد EV وفصل الفيروس عن المركبات الكهربائية باستخدام نهج مركب للعزل. يمكن تصفية كميات كبيرة نسبيا من المواد الأولية (أي الخلية الفائقة) قبل عزل EV عن طريق هطول الأمطار، وفصل DG، وإثراء الجسيمات النانوية، مما يؤدي إلى حجم نهائي قدره ~ 30 درجة مئوية، مما يسمح للاستخدا...

تركز البحث حول الحويصلات خارج الخلية (EVs)، وعلى وجه التحديد exosomes، وهو نوع من EV تتراوح بين 30-120 نانومتر وتتميز بوجود ثلاثة علامات تيتراسبانين CD81، CD9، وCD63، وقد شكلت إلى حد كبير من خلال تطوير أساليب لعزل و تنقية الحويصلات من الفائدة. وقد أعيقت القدرة على تشريح الآليات المتعددة الأوجه بسبب التقنيات المعقدة والمستهلكة للوقت التي تولد عينات تتألف من مجموعة غير متجانسة من الحويصلات المتولدة عبر مسارات مختلفة مع مجموعة واسعة من المحتويات والأحجام، و الكثافه. في حين أن هذه مسألة لجميع البحوث EV تقريبا، فإنه من أهمية خاصة عند دراسة المركبات الكهربائية في سياق العدوى الفيروسية، كما virions والجسيمات الشبيهة بالفيروس (VLPs) يمكن أن تكون مماثلة في القطر إلى الحويصلات ذات الأهمية. فعلى سبيل المثال، يبلغ قطر فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) حوالي 100 نانومتر، وهو تقريبا نفس حجم العديد من أنواع المركبات الكهربائية. لهذا السبب، قمنا بتصميم سير عمل عزل EV جديد لمعالجة هذه المشكلات.
المعيار الذهبي الحالي لعزل EV هو فائق التحامل. هذه التقنية تستفيد من مختلف الكثافات الحويصلة، مما يسمح للحويصلات أن تكون مفصولة بالطرد المركزي مع الترسيب التفاضلي للجسيمات ذات الكثافة العالية مقابل جزيئات الكثافة المنخفضة في كل مرحلة 1،2. وهناك عدة خطوات الطرد المركزي منخفضة السرعة مطلوبة لإزالة الخلايا السليمة (300-400 × ز لمدة 10 دقائق)، وحطام الخلايا (~ 2000 × ز لمدة 10 دقائق)، والهيئات المبرمجة / الحويصلات الكبيرة (~ 10،000 × ز لمدة 10 دقائق). ويلي عمليات التنقية الأولية هذه عمليات الإزالة الفائقة السرعة العالية (000 100-000 200 x ز لمدة 1.5-2 ساعة) إلى المركبات الكهربائية للرواسب. يتم تنفيذ خطوات غسل لمزيد من ضمان نقاء EV، ومع ذلك، وهذا يؤدي إلى خفض عدد المركبات الكهربائية المعزولة، وبالتالي خفض العائد الإجمالي 3،4. كما أن فائدة هذه الطريقة محدودة بسبب متطلبات عدد كبير من الخلايا (حوالي 1 × 108) وحجم عينة كبير (> 100 مل) لتحقيق نتائج كافية.
ولمعالجة الشواغل المتزايدة، أصبح هطول الأمطار من الحويصلات مع البوليمرات المائية تقنية مفيدة في السنوات الأخيرة. البولي ايثيلين غليكول (PEG)، أو غيرها من الكواشف هطول الأمطار ذات الصلة، يسمح للمستخدم لسحب أسفل الحويصلات، والفيروسات، والبروتين أو البروتين الحمض النووي الريبي المجاميع داخل عينة ببساطة عن طريق احتضان العينة مع الكواشف من الاختيار، تليها واحدة منخفضة السرعة الطرد المركزي1،2،5. لقد أبلغنا سابقا أن استخدام PEG أو الأساليب ذات الصلة لتسريع المركبات الكهربائية بالمقارنة مع نتائج ultracentrifugation التقليدية في عائد أعلى بكثير6. هذه الاستراتيجية سريعة وسهلة، لا تتطلب معدات إضافية باهظة الثمن، ويمكن تطويرها بسهولة، ويحتفظ هيكل EV. ومع ذلك، ونظرا لطبيعة منحرفة من هذه الطريقة، والعينات الناتجة تحتوي على مجموعة متنوعة من المنتجات بما في ذلك البروتينات الحرة، ومجمعات البروتين، ومجموعة من المركبات الكهربائية، وبالتالي تتطلب المزيد من تنقية للحصول على السكانالمطلوب1 ،2،7،8.
وللتغلب على عدم تجانس المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من مختلف أساليب هطول الأمطار، يُستخدم تدرج الكثافة الفائق (DG) لفصل الجسيمات على نحو أفضل استناداً إلى كثافتها. يتم تنفيذ هذه الطريقة باستخدام تدرج تدريجي باستخدام وسيط تدرج الكثافة، مثل iodixanol أو السكروز، والذي يسمح لفصل المركبات الكهربائية من البروتينات، ومجمعات البروتين، وجزيئات تشبه الفيروس أو الفيروس (VLPs). ومن المهم ملاحظة أنه في حين كان يعتقد في وقت من الأوقات أن المديرية العامة سمحت بفصل أكثر دقة بين التجمعات السكانية الفرعية للEV، فمن المعروف الآن أن الأحجام والكثافات من الحويصلات المختلفة يمكن أن تتداخل. على سبيل المثال، من المعروف أن exosomes لديها كثافات التعويم من 1.08-1.22 غرام / مل9،في حين أن الحويصلات المعزولة من غولجي (COPI+ أو clathrin+) لديها كثافات من 1.05-1.12 غرام / مل وتلك من الشبكية endoplasmic (COPII+ ) الرواسب في 1.18-1.25 غرام / مل1،2،3،4،9. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المرء يرغب في مقارنة الكسور الخارجية مع الكسور التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية، وهذا قد يصبح أكثر صعوبة اعتمادا على كثافة الفيروس من الفائدة - هناك فيروسات أخرى غير فيروس نقص المناعة البشرية-1 التي من المرجح أن توازن في نفس الكثافات والكسور الإيجابية الخارجية2.
وأخيرا، فإن إثراء الإعدادية EV للتصور المصب والاختبارات الوظيفية أمر حيوي لبحوث EV. استخدام الجسيمات النانوية التي تثري EV، وعلى وجه التحديد، جزيئات هيدروجيل متعددة الوظائف التي تتراوح بين 700-800 نانومتر في القطر، هي خطوة حاسمة في تحقيق الإعدادية EV المركزة. أنها تمتلك طعم العطرية تقارب عالية التي مغلفة بقذيفة غرب مسامية غرب المنال لتعزيز الانتقائية. وتشمل الجسيمات النانوية المستخدمة في هذه الدراسة إعدادين متميزين مع طعوم أساسية مختلفة (رد الفعل الأحمر 120 NT80؛ وCibacron Blue F3GA NT82) التي أظهرت زيادة التقاط المركبات الكهربائية من مختلف الكواشف والسوائل الحيوية (انظر جدول المواد )6،10،11،12،13،14،15. الجسيمات توفر سهولة إثراء المركبات الكهربائية من العديد من المواد بدءا بما في ذلك كسور iodixanol، supernatant ثقافة الخلية، فضلا عن السوائل الحيوية المريض مثل البلازما، المصل، السوائل الشوكية الدماغية (CSF)، والبول6،13 .
الطريقة المعروضة هنا يحسن كفاءة تقنيات تنقية EV الحالية من خلال الجمع بين العديد من التكنولوجيات; EV هطول الأمطار، كثافة التدرج ultracentrifugation، والتقاط الجسيمات، لتبسيط سير العمل، والحد من متطلبات العينة، وزيادة العائد للحصول على عينة EV أكثر تجانسا للاستخدام في جميع البحوث EV. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في التحقيق في المركبات الكهربائية ومحتوياتها خلال العدوى الفيروسية كما أنه يتضمن خطوة ترشيح 0.22 ميكرومتر لاستبعاد الحويصلات الكبيرة وغير المرغوب فيها وVLPs والفصل بين مجموع السكان EV على أساس الكثافة إلى فعالية عزل المركبات الكهربائية من virions.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

واحدة من العقبات الرئيسية في مجال أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV) اليوم هو القدرة على تحقيق الاستعدادات EV تنقية في إعداد العدوى الفيروسية. والمقصود من الطريقة المعروضة عزل المركبات الكهربائية بعيدا عن virions (أي فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يسمح بكفاءة أعلى وغلة أعلى بالمقارنة مع الأساليب التقليدية فائقة التثخاف. بروتوكولنا يحتوي على ثلاث خطوات: هطول الأمطار EV، فصل تدرج الكثافة، والتقاط الجسيمات. يمكن تشغيل الاختبارات النهائية (أي اللطخة الغربية، وPCR) مباشرة بعد التقاط الجسيمات. هذه الطريقة مفيدة على طرق العزل الأخرى (أي ultracentrifugation) كما أنه يسمح لاستخدام الحد الأدنى من وحدات التخزين الأولية. وعلاوة على ذلك، فهو أكثر سهولة للمستخدم من أساليب عزل EV البديلة التي تتطلب خطوات متعددة فائقة التثاقل. ومع ذلك، فإن الطريقة المعروضة محدودة في نطاق اختبارات EV الوظيفية حيث أنه من الصعب أن elute EVs سليمة من جزيئاتنا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة مصممة خصيصاً لتهيئة بيئة قائمة على البحوث بحتة ولن تكون مجدية تجارياً.

ارتفاع الأمطار في الأمطار إلى ارتفاع ويزيد من العائد على المركبات الكهربائية نهجنا الجمع بين عزل EV هو أكثر كفاءة بكثير من حيث الانتعاش EV بالمقارنة مع ultracentrifugation التقليدية، كما يتضح من انخفاض 90٪ في حجم المواد الأولية المطلوبة. Ultracentrifugation، المعيار الذهبي الحالي...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

يعزل هذا البروتوكول الحويصلات خارج الخلية (EVs) بعيدا ً عن virions ذات الكفاءة العالية والغلة من خلال دمج هطول الأمطار EV، وكثافة تدرج ultracentrifugation، والتقاط الجسيمات للسماح لسير عمل مبسط والحد من بدء متطلبات الحجم، مما أدى إلى الاستعدادات القابلة للاستنساخ لاستخدامها في جميع البحوث EV.

تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يركز على الخلايا الخارجة عن الخلية ، EVs ، من خلال مزيج من التقنيات ، مع السماح بفصل الفيرونات بعيدًا عن المركبات الكهربائية. هذا الأسلوب يزيد من الانتعاش EV فوق معيار الذهب الحالي للطرد فائقة لتحاليل متعددة المصب وتوصيف من الفيروسات خالية من EV التمهيدية. هذا البروتوكول هو مثالي لدراسة الالتهابات الفيروسية و EV.ويمكن تكييف هذه الطريقة مع أنظمة الفيروسات الأخرى، مثل HTLV والإيبولا وزيكا وغيرها. أتوقع أن يكون المستخدم لأول مرة من هذه الطريقة لكفاح مع إعداد الجسيمات النانوية، لذلك نوصي بعناية بعد مواصفاتنا. قد يكون بعض التحسين ضروريًا، اعتمادًا على النظام.إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة مهم لتوضيح تدفق العمل الإجمالي والفروق الدقيقة للبروتوكول ، مما يقلل الوقت والأخطاء للمستخدمين لأول مرة. ابدأ بإعداد الثقافة المُتطَوّرة من الخلايا المصابة أو العابرة. ثقافة ما يقرب من 10 ملليلتر من خلايا سجل في وقت متأخر لمدة خمسة أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والتأكد من أن جميع الكواشف المتوسطة خالية من الخلايا خارج الخلية.عندما تكون الثقافة جاهزة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3، 000 مرات G لمدة خمس دقائق والتخلص من بيليه. تصفية سوبرنات مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر معقمة وجمع الترشيح في أنبوب نظيف. إضافة حجم متساو من الكواشف الترسيب PEG إلى الترشيح، وعكس الأنبوب عدة مرات لخلط.احتضان الخليط في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد الحضانة، الطرد المركزي الخليط في 1500 مرات G لمدة 30 دقيقة، لتسفر عن حوياضات غير متجانسة خارج الخلية، أو EV، بيليه. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 150 إلى 300 ميكرولتر من 1X PBS، دون الكالسيوم والمغنيسيوم.الحفاظ على بيليه على الجليد، في حين إعداد التدرج كثافة. إعداد الـ iodixanol كثافة التدرج المتوسط مع 11 كسور كثافة، تتراوح بين ستة إلى 18٪ iodixanol، كما هو موضح في المخطوطة. مزيج كل أنبوب عن طريق دوامة وطبقة كسور الكثافة في نظيفة وجافة يتأرجح دلو أنبوب فائقة الrifuge.إضافة بيليه EV إعادة تعليق إلى الجزء العلوي من التدرج الطبقات و ultracentrifuge الأنبوب في 10، 000 مرات G، وأربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. نقل بعناية كل كسر من أنبوب فائقة التركيز إلى أنبوب جديد microcentrifuge. إعداد 30٪ الطين من الجسيمات النانوية لإثراء جزء EV، عن طريق خلط وحدات التخزين على قدم المساواة من NT80، NT82 و 1X-PBS.دوامة خليط الجسيمات النانوية لضمان التجانس. إضافة 30 ميكرولترات من الطين إلى كل جزء كثافة ومزيج إما الأنابيب أو عكس الأنابيب. الخطوة الأكثر أهمية هي إضافة المواد نانو لتركيز EV، بعد الفصل التدرج الكثافة.دون هذا ، EV الانتعاش هو الفقراء. قم بتدوير الجسيمات النانوية التي تحتوي على كسور الكثافة بين عشية وضحاها، عند أربع درجات مئوية. ثم الطرد المركزي كسور الكثافة في 20، 000 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.تجاهل السائل وغسل بيليه EV مرتين مع 1X-PBS. لإعداد بيليه لعزل الحمض النووي الريبي، إعادة تعليق عليه 50 ميكرولترات من المياه autoclaved، deionized، تصفية ومعالجتها مع depsy، وفقا لتوجيهات المخطوطة. ويمكن بعد ذلك عزل الجيش الملكي النيبالي، باستخدام مجموعة أدوات تجارية.للتحليل مع جل electrophoresis، إعادة تعليق بيليه في 15 ميكرولترات من عازلة Laemmli. سخني العينة إلى 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. كرر خطوة التدفئة مرتين أكثر، دوامة بلطف والغزل العينة أسفل بين دورات الحرارة.الطرد المركزي العينة لمدة 15 ثانية في 20، 000 مرات G، وتحميل supernatant مباشرة على هلام. للحصول على أفضل النتائج، الحد من كمية الجسيمات المحملة على الجل، وتشغيله في 100 فولت، لمنع أي الجسيمات النانوية المحملة من دخول الجل. يتيح هطول الأمطار PEG لاسترداد EV أكثر كفاءة بشكل ملحوظ ، من الطرد التقليدي الفائق.عند استخدام 10 ملليلتر من الثقافة، وهذا النهج يؤدي إلى ما يقرب من 500 أضعاف أعلى من العائد الطارد. هذا النهج يؤدي أيضا إلى زيادة كفاءة العزل من اكسوزومات، وهو ما يتضح من خلال مستويات أعلى من البروتينات علامة exosome. يظهر تحليل جيش التحرير الشعبي الغربي ، وزيادة 3000 أضعاف في CD81 ، وزيادة أربعة أضعاف في CD63 وزيادة 40 أضعاف في CD9.وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول لإجراء دراسات في المراحل النهائية للآليات التي يتم بوساطة EV في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 1، عن طريق عزل EV من verions. ويبين تحليل جيش التحرير الشعبي الغربي أن EV 's تم العثور عليها في ثلاثة مجموعات سكانية جزئية. بينما الفيروس موجود في اثنين منهم فقط.EV 'sمخالفة 10.8 من خلال 12 خالية من تلوث الفيروس. أهم شيء يجب تذكره هو أن الجسيمات النانوية حاسمة لإثراء EV الأمثل. إضافة لها أمر لا بد منه.يمكن إجراء العديد من المقايسات المصب، مثل البقعة الغربية، PCR، تحليل diomech النقي بواسطة قياس الطيف الكتلي في المقايسات الخلوية القائمة على لوحة. هذه تسمح للتوصيف، و/ أو الدراسات الميكانيكية، و/ أو وظيفية. هذه التقنية تسمح لدراسات محددة التي تدرس EV البضائع وظيفة دون تلوث الخلفية الفيروسية.هذا يوفر أساسا لدراسة EV في التسبب في الأمراض وتطوير العلاجات المحتملة. للتغلب على القيود المفروضة على هذه التقنية، وتطبيق إعداد EV والعزلة على كميات كبيرة، نوصي باستخدام أنظمة متقدمة، مثل الترشيح التدفق الظرفي. الأداة الأكثر خطورة لاستخدام هو الطرد الفائق، أثناء فصل التدرج الكثافة.تأكد من أن جميع أنابيب الطرد المركزي الوزن نفسه، لتجنب عدم التوازن وفشل الدوار المحتملة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

الجمعية وتنقية من النموذج إينتاسوميس فيروس مزبد

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...