Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Vi vil gerne takke alle medlemmer af Kashanchi Lab, især Gwen Cox. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed (NIH) tilskud (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, og NS099029 til F.K.).

1. filtrering og udfældning af ekstracellulære vesikler (EVs)
<ol><li>For at forberede kulturen supernatanten fra inficerede eller transficeret celler (dvs. cellelinjer og/eller primærceller), kultur ca 10 ml af sene-log celler i 5 dage ved 37 °c og 5% Co2 i passende kulturmedium (dvs., rpmi eller DMEM med 10% føtal kvæg serum [FBS]). Bemærk: Alle reagenser til kulturmedium skal være fri for EVs og kan enten købes (Se tabel over materialer) eller tilberedes in-Ho...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+is+released+in+extracellular+vesicles+derived+from+astrocytes:+evidence+for+Nef-mediated+neurotoxicity.">HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (1), e2542 (2017).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-9+Released+from+HIV+Tat+Stimulated+Astrocytes+Mediates+Microglial+Migration.">Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Carry+HIV+Env+and+Facilitate+Hiv+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue.">Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).</li><li>Jaworski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphotropic+virus+type+1-infected+cells+secrete+exosomes+that+contain+Tax+protein.">Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).</li><li>Heinemann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

Den skitserede metode giver mulighed for forbedret EV-udbytte og adskillelse af virus fra EVs ved hjælp af en kombination tilgang til isolation. Relativt store mængder af udgangsmateriale (dvs. celle supernatant) kan filtreres før EV-isolation ved udfældning, GD separation og tilsætning af nanopartikel, hvilket resulterer i et endeligt volumen på ~ 30 μL, hvilket giver mulighed for umiddelbar brug i en række downstream-assays. Brugen af nanopartikel berigelse er afgørende, da disse EV-berigende nanopartikler i f...

Forskning centreret omkring ekstracellulære vesikler (EVs), specielt exosomer, en type af EV spænder 30-120 nm og karakteriseret ved tilstedeværelsen af tre tetraspanin markører CD81, CD9, og CD63, er i vid udstrækning blevet formet af udviklingen af metoder til at isolere og rense de vesikler af interesse. Evnen til at dissekere mangesidede mekanismer er blevet hæmmet på grund af komplekse og tidskrævende teknikker, der genererer prøver bestående af en heterogen population af vesikler genereret via forskellige veje med en bred vifte af indhold, størrelser og Tætheder. Selv om dette er et problem for næsten alle EV forskning, det er af særlig betydning, når man studerer EVs i forbindelse med viral infektion, som virions og virus-lignende partikler (VLPs) kan være ens i diameter til vesikler af interesse. For eksempel er humant immundefekt virus type 1 (HIV-1) ca. 100 nm i diameter, hvilket er omtrent samme størrelse som mange typer EVs. Derfor har vi udviklet en ny EV-isolations arbejdsgang for at løse disse problemer.
Den nuværende guld standard af EV isolation er ultracentrifugering. Denne teknik gør brug af de forskellige vesikale tætheder, som gør det muligt at separere vesikler ved centrifugering med differentiel sedimentering af højere densitet partikler versus nedre tæthed partikler på hver etape 1,2. Der kræves flere Centrifugerings trin med lav hastighed for at fjerne intakte celler (300-400 x g i 10 minutter), cellerester (~ 2.000 x g i 10 min) og apoptotiske organer/store vesikler (~ 10.000 x g i 10 min). Disse indledende rensninger efterfølges af højhastigheds ultracentrifugering (100000-200000 x g for 1,5-2 timer) til sediment evt. Vaske trin udføres for yderligere at sikre EV renhed, men dette resulterer i reduktionen af antallet af isolerede EVS, hvilket sænker det samlede udbytte 3,4. Denne metodes nytte er yderligere begrænset af kravet om et stort antal celler (ca. 1 x 108) og et stort prøvevolumen (&Gt; 100 ml) for at opnå tilstrækkelige resultater.
For at imødegå de voksende bekymringer, er udfældning af vesikler med hydrofile polymerer blevet en nyttig teknik i de seneste år. Polyethylenglycol (PEG) eller andre relaterede nedfældnings reagenser gør det muligt for brugeren at trække vesikler, vira og protein-eller protein-RNA-aggregater i en prøve ved blot at inkube prøven med den foretrukne reagens efterfulgt af en enkelt lavhastigheds centrifugering1,2,5. Vi har tidligere rapporteret, at brugen af PEG eller relaterede metoder til at udfældes EVs i forhold til traditionelle ultracentrifugering resultater i et betydeligt højere udbytte6. Denne strategi er hurtig, nem, kræver ikke ekstra dyrt udstyr, er let skalerbar, og bevarer EV struktur. Men på grund af den promiøse karakter af denne metode, de resulterende prøver indeholder en række produkter, herunder frie proteiner, protein komplekser, en række EVs, og virions dermed kræver yderligere rensning for at opnå den ønskede population1 ,2,7,8.
For at overvinde den heterogenitet af EVs opnået fra forskellige nedbør metoder, tæthed gradient ultracentrifugering (DG) udnyttes til bedre at adskille partikler baseret på deres tæthed. Denne metode udføres ved hjælp af en trinvis gradient ved hjælp af en tæthed gradient medium, såsom iodixanol eller saccharose, som giver mulighed for adskillelse af EVs fra proteiner, protein komplekser, og virus eller virus-lignende partikler (Vlp'er). Det er vigtigt at bemærke, at selv om det engang var tanken, at GD tillod en mere præcis adskillelse af EV-delpopulationer, er det nu kendt, at størrelser og tætheder af forskellige vesikler kan overlappe hinanden. For eksempel vides det, at exosomer har flotations tætheder på 1,08-1.22 g/ml9, mens vesikler isoleret fra Golgi (Copi+ eller clathrin+) har en tæthed på 1,05-1.12 g/ml og dem fra endoplasmatiske reticulum (copii+ ) sediment ved 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Desuden, hvis man ønsker at sammenligne exosomale fraktioner mod fraktioner, der indeholder virale partikler, kan dette blive vanskeligere afhængigt af tætheden af virus af interesse-der er vira andre end HIV-1, der sandsynligvis ækvibrere på samme tæthed som exosomale positive fraktioner2.
Endelig er berigelse af EV-Preps for downstream-visualisering og funktionelle analyser afgørende for EV-forskningen. Brugen af EV-berigende nanopartikler, specifikt, multi-funktionelle hydrogel partikler, der spænder 700-800 nm i diameter, er et afgørende skridt i at opnå koncentrerede EV Preps. De besidder en høj affinitet aromatisk agn, som indkapslet af en porøs ydre sigtige Shell til at fremme selektivitet. De nanopartikler, der anvendes i denne undersøgelse, omfatter to særskilte præparater med forskellige kerne lomidler (reaktiv rød 120 NT80; og Cibacron Blue F3GA NT82), som har vist sig at øge indfangningen af EVs fra forskellige reagenser og biofluider (Se tabellen over materialer )6,10,11,12,13,14,15. Partiklerne giver let berigelse af EVS fra talrige udgangsmaterialer, herunder iodixanol fraktioner, cellekultur supernatant, samt patientens biofluider såsom plasma, serum, cerebrale spinal væsker (CSF), og urin6,13 .
Den metode, der præsenteres her, forbedrer effektiviteten af de nuværende EV rensningsteknikker ved at kombinere flere teknologier; EV nedbør, tæthed gradient ultracentrifugering, og partikel opsamling, at strømline arbejdsprocessen, reducere prøvekrav, og øge udbyttet for at opnå en mere homogen EV prøve til brug i alle EV forskning. Denne metode er særlig nyttig i undersøgelsen af evt og deres indhold under virus infektion, da det omfatter et 0,22 μm filtreringstrin for at udelukke store, uønskede vesikler og Vlp'er og adskillelse af den samlede EV-population baseret på tæthed for effektivt at Isoler EVs fra virions.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

En af de store forhindringer i området for ekstracellulær vesikelprotein (EV) forskning i dag er evnen til at opnå renset EV præparater i en viral infektion indstilling. Den præsenterede metode er beregnet til at isolere EVs væk fra virions (dvs., HIV-1), giver mulighed for en højere effektivitet og udbytte i forhold til konventionelle ultracentrifugering metoder. Vores protokol indeholder tre trin: EV nedbør, tæthed gradient adskillelse, og partikel opsamling. Downstream-assays (dvs., Western blot, og PCR) kan køres direkte efter partikel opsamling. Denne metode er fordelagtig i forhold til andre isolations metoder (dvs. ultracentrifugering), da den gør det muligt at anvende minimale start volumener. Desuden er det mere brugervenlig end alternative EV isolation metoder, der kræver flere ultracentrifugering trin. Men den præsenterede metode er begrænset i sit omfang af funktionelle EV assays, da det er vanskeligt at elueres intakt EVS fra vores partikler. Desuden er denne metode skræddersyet til en strengt forskningsbaseret indstilling og vil ikke være kommercielt levedygtig.

PEG nedbør øger EV udbytte Vores kombination tilgang til EV isolation er betydeligt mere effektiv med hensyn til EV opsving i forhold til traditionelle ultracentrifugering, som det fremgår af 90% reduktion i mængden af udgangsmateriale, der kræves. Ultracentrifugering, den nuværende guld standard i EV isolation, kræver ca. 100 mL kultur supernatanten at producere en passende EV prep for downstream assays, mens vores roman protokol kræver kun 10 mL. Denne redukt...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Denne protokol isolerer ekstracellulære vesikler (EVs) væk fra virions med høj effektivitet og udbytte ved at indarbejde EV nedbør, tæthed gradient ultracentrifugering, og partikel opsamling for at muliggøre en strømlinet arbejdsgang og en reduktion af start volumen krav, hvilket resulterer i reproducerbare præparater til brug i al forskning i EV.

Rensning af ekstracellulære vesikulære præparater med høj udbytte afstand fra virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Denne protokol er vigtig, fordi den koncentrerer ekstracellulære vesikler, elbiler, gennem en kombination af teknologier, samtidig med at der er mulighed for adskillelse af virioner væk fra elbiler. Denne metode maksimerer EV opsving over den nuværende guld standard for ultracentrifugering for flere downstream analyse og karakterisering af virus-fri EV preps. Denne protokol er ideel til undersøgelse af EV's og virusinfektioner.Denne metode kan tilpasses andre virussystemer, såsom HTLV, Ebola, Zika og meget mere. Jeg forventer en første gang bruger af denne metode til at kæmpe med nanopartikel forberedelse, så vi anbefaler omhyggeligt at følge vores specifikationer. Nogle optimering kan være nødvendig, afhængigt af systemet.Visuel demonstration af denne metode er vigtig for at illustrere det overordnede arbejdsflow og nuancerne i protokollen, hvilket vil reducere tid og fejl for første gangsbrugere. Start med at forberede kultur supernatant fra inficerede eller transfekterede celler. Kultur ca. 10 milliliter sene logceller i fem dage ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, og sørg for, at alle medium reagenser er fri for ekstracellulære vesikler.Når kulturen er klar, pellet cellerne ved centrifugering på 3, 000 gange G i fem minutter og kassér pellet. Supernatanten filtreres med et sterilt 0,22 mikrometerfilter, og filtratet opsamls i et rent rør. Tilsæt en tilsvarende mængde PEG nedbør reagenser til filtrat, og invertere røret flere gange for at blande.Inkuber blandingen ved fire grader Celsius natten over. Efter inkubationen centrifugeres blandingen ved 1500 gange G i 30 minutter for at give en heterogen ekstracellulær vesicle eller EV-pellet. Kassér supernatanten, og suspension pellet i 150 til 300 mikroliter af 1X PBS, uden calcium og magnesium.Hold pellet på is, mens du forbereder en tæthed gradient. Forbered iodixanoltæthed gradient medium med 11 densitet fraktioner, der spænder fra seks til 18% iodixanol, som beskrevet i manuskriptet. Bland hvert rør ved at vortexing og lag densitet fraktioner i en ren og tør svingende spand ultracentrifuge rør.Tilsæt den re-suspenderet EV pellet til toppen af lagdelte gradient og ultracentrifuge røret ved 10, 000 gange G, og fire grader Celsius i 90 minutter. Overfør forsigtigt hver fraktion fra ultracentrifugerøret til et nyt mikrocentrifugerør. Der forbered en 30% gylle af nanopartikler til EV-fraktionsberigelse ved at blande lige store mængder NT80, NT82 og 1X-PBS.Vortex nanopartikelblandingen for at sikre homogenitet. Der tilsættes 30 mikroliter af gyllen til hver massetæthedsfraktion, og der blandes enten ved at røre eller vende rørene. Det mest kritiske skridt er tilføjelsen af nano-artikler til at koncentrere EV's, efter densitet gradient adskillelse.Uden dette, ev opsving er dårlig. Drej nanopartikel, der indeholder tæthed fraktioner natten over, ved fire grader Celsius. Derefter centrifuge densitet fraktioner på 20, 000 gange G i fem minutter ved stuetemperatur.Kassér væsken og vask EV-pellets to gange med 1X-PBS. For at forberede pellet til RNA isolation, re-suspendere det 50 mikroliter af autoklavede, deioniseret vand, filtreret og behandlet med depsi, i henhold til manuskriptet retninger. RNA kan derefter isoleres ved hjælp af et kommercielt kit.Til analyse med gelelektrophoresis skal pelleten igen suspenderes i 15 mikroliter af Laemmli-buffer. Varm prøven til 95 grader Celsius i tre minutter. Gentag opvarmningstrinnet to gange mere, vortexing forsigtigt og spinding prøven ned mellem varme cykler.Centrifuge prøven i 15 sekunder ved 20,000 gange G, og læg supernatanten direkte på gelen. For de bedste resultater, begrænse mængden af partikler lastet på gelen, og køre det på 100 volt, for at forhindre eventuelle lastede nanopartikler i at komme ind i gelen. PEG nedbør giver mulighed for betydeligt mere effektiv EV opsving, end traditionelle ultracentrifugering.Når du bruger 10 milliliter kultur, denne fremgangsmåde resulterer i en ca 500 gange højere udbytte end ultracentrifugering. Denne tilgang resulterer også i en øget isolationseffektivitet af exosomer, hvilket er tydeligt gennem højere niveauer af exosome markør proteiner. Western PLA analyse viser, en 3000 fold stigning i CD81, en fire gange stigning i CD63 og en 40 gange stigning i CD9.Desuden giver denne protokol mulighed for downstream-undersøgelser af EV medieret mekanismer i HIV1-infektion, ved at isolere EV's fra verions. Western PLA analyse viser, at EV's findes i tre fraktioner populationer. Mens virus er til stede i kun to af dem.EV's overtrædelse 10,8 til 12 er fri for virusforurening. Det vigtigste at huske er, at nanopartiklerne er afgørende for optimal EV-berigelse. Deres tilføjelse er et must.Mange downstream-analyser, såsom western blot, PCR, ren diomech analyse ved massespektrometri i pladebaserede cellulære analyser kan udføres. Disse giver mulighed for karakterisering, mekanistiske og / eller funktionelle undersøgelser. Denne teknik giver mulighed for specifikke undersøgelser, der undersøger EV last og funktionalitet uden at forurene viral baggrund.Dette giver et grundlag for at studere EV's i patogenese og udvikling af potentielle terapeutiske. For at overvinde begrænsningerne i denne teknik, og for at anvende EV forberedelse og isolering til store mængder, anbefaler vi brug af avancerede systemer, såsom tangential flow filtrering. Det farligste instrument, der skal anvendes, er ultracentrifuge under tæthedens gradientadskillelse.Sørg for, at alle centrifugerør vejer ens for at undgå ubalance og potentiel rotorsvigt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrensning af Influenzavirus ribonukleoprotein komplekser fra kromatin af inficerede celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Oprensning af Patogen vakuoler fra<em&gt; Legionella</em&gt;-Inficerede Fagocytter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redning af rekombinant Newcastle Disease-virus fra cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Oprensning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites Til brug i opsoniserende antistofanalyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

En effektiv og High Yield Metode til Isolering af Mouse Dendritiske celle-undergrupper

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Registrering og fjernelse af nukleasen forurening under oprensning af rekombinante Prototype skummende Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Evaluering af ekstracellulære vesikel funktion under Malaria infektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Forsamling og rensning af Prototype skummende Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...