Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

We willen alle leden van het Kashanchi Lab bedanken, vooral Gwen Cox. Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, en NS099029 aan F.K.).

1. filtratie en precipitatie van extracellulaire blaasjes (Ev's)
<ol><li>Ter voorbereiding van de kweek supernatant van besmette of getransformuteerde cellen (d.w.z. cellijnen en/of primaire cellen), kweek ongeveer 10 mL laat-log cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2 in een geschikt kweekmedium (D.W.Z. RPMI of DMEM met 10% foetale runderen serum [FBS]). Opmerking: Alle reagentia voor kweekmedium moeten vrij zijn van EVs en kunnen ofwel worden aangekocht (Zie tabel met mate...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+is+released+in+extracellular+vesicles+derived+from+astrocytes:+evidence+for+Nef-mediated+neurotoxicity.">HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (1), e2542 (2017).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-9+Released+from+HIV+Tat+Stimulated+Astrocytes+Mediates+Microglial+Migration.">Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Carry+HIV+Env+and+Facilitate+Hiv+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue.">Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).</li><li>Jaworski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphotropic+virus+type+1-infected+cells+secrete+exosomes+that+contain+Tax+protein.">Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).</li><li>Heinemann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

De beschreven methode zorgt voor een verbeterde EV-opbrengst en de scheiding van het virus van EVs met behulp van een gecombineerde benadering van isolatie. Relatief grote hoeveelheden uitgangsmateriaal (d.w.z. celsupernatant) kunnen vóór de EV-isolatie worden gefilterd door precipitatie, DG scheiding en verrijking van nanodeeltjes, resulterend in een eindvolume van ~ 30 μL, waardoor direct gebruik in een verscheidenheid van downstream assays. Het gebruik van nanodeeltjes verrijking is essentieel omdat, in vergelijkin...

Onderzoek gecentreerd rond extracellulaire blaasjes (Ev's), in het bijzonder exosomen, een type EV variërend van 30-120 nm en gekenmerkt door de aanwezigheid van drie tetraspanin markers CD81, CD9 en CD63, is grotendeels gevormd door de ontwikkeling van methoden om te isoleren en Reinig de blaasjes van belang. De mogelijkheid om veelzijdige mechanismen te ontleden is belemmerd vanwege complexe en tijdrovende technieken die monsters genereren die bestaan uit een heterogene populatie van blaasjes die via verschillende trajecten worden gegenereerd met een breed scala aan inhoud, maten en Dichtheden. Hoewel dit een probleem is voor bijna alle EV-onderzoek, is het van bijzonder belang bij het bestuderen van EVS in de context van virale infectie, omdat virionen en virusachtige deeltjes (vlp's) vergelijkbaar in diameter kunnen zijn voor de blaasjes van belang. Zo is het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) ongeveer 100 nm in diameter, wat ongeveer even groot is als vele soorten Ev's. Om deze reden hebben we een nieuwe EV-isolatie workflow ontworpen om deze problemen aan te pakken.
De huidige gouden standaard van EV-isolatie is ultracentrifugatie. Deze techniek maakt gebruik van de verschillende blaasje dichtheden, waardoor de blaasjes kunnen worden gescheiden door centrifugeren met differentiële sedimentatie van hogere dichtheids deeltjes versus lagere dichtheids deeltjes in elke fase 1,2. Er zijn verschillende stappen voor het centrifugeren van lage snelheid vereist om intacte cellen te verwijderen (300-400 x g gedurende 10 min), celresten (~ 2.000 x g gedurende 10 min) en apoptotische lichamen/grote blaasjes (~ 10.000 x g gedurende 10 min). Deze initiële zuiveringen worden gevolgd door ultrasnelle ultracentrifugatie (100000-200000 x g voor 1.5-2 h) aan sediment EVS. Wasstappen worden uitgevoerd om de zuiverheid van de EV verder te waarborgen, maar dit resulteert in de vermindering van het aantal geïsoleerde ev's, waardoor de totale opbrengst 3,4wordt verlaagd. Het nut van deze methode wordt verder beperkt door de eis van een groot aantal cellen (ongeveer 1 x 108) en een groot monstervolume (&Gt; 100 ml) om adequate resultaten te bereiken.
Om de toenemende bezorgdheid aan te pakken, is het neerslaan van blaasjes met hydrofiele polymeren de laatste jaren een nuttige techniek geworden. Polyethyleenglycol (PEG), of andere verwante precipitatie reagentia, stelt de gebruiker in staat om de vesicles, virussen en eiwitten-of proteïne-RNA-aggregaten binnen een monster te trekken door simpelweg het monster met het reagens naar keuze te inbroed, gevolgd door een enkele lage-snelheid centrifugeren1,2,5. We hebben eerder gemeld dat het gebruik van PEG of gerelateerde methoden om EVs te precipderen in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie resulteert in een significant hogere opbrengst6. Deze strategie is snel, eenvoudig, vereist geen extra dure apparatuur, is gemakkelijk schaalbaar en behoudt de EV-structuur. Vanwege de promiscue aard van deze methode bevatten de resulterende monsters een verscheidenheid aan producten, waaronder vrije eiwitten, eiwitcomplexen, een reeks Ev's en virionen, waardoor verdere zuivering nodig is om de gewenste populatie te verkrijgen1 ,2,7,8.
Om de heterogeniteit van de uit verschillende neerslag methoden verkregen EVs te overwinnen, wordt dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DG) gebruikt om deeltjes beter te scheiden op basis van hun dichtheid. Deze methode wordt uitgevoerd met behulp van een stapsgewijze helling met behulp van een dichtheidsgradiënt medium, zoals iodixanol of sucrose, die de scheiding van EVs van eiwitten, eiwitcomplexen en virus-of virusachtige deeltjes (Vlp's) mogelijk maakt. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel er ooit werd gedacht dat DG een preciezere scheiding van EV-subpopulaties toeliet, het nu bekend is dat maten en dichtheden van verschillende blaasjes elkaar kunnen overlappen. Exosomen zijn bijvoorbeeld gekend om flotatie dichtheden van 1,08-1.22 g/ml9te hebben, terwijl blaasjes geïsoleerd van de Golgi (Copi+ of clathrin+) een dichtheden van 1.05-1.12 g/ml en die van het endoplasmische reticulum (copii+ ) sediment bij 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Bovendien, indien men exosomale fracties wil vergelijken tegen fracties die virale deeltjes bevatten, kan dit, afhankelijk van de dichtheid van het virus van belang, moeilijker worden — er zijn andere virussen dan HIV-1 die waarschijnlijk op hetzelfde dichtheden als exosomale positieve fracties2.
Tot slot is de verrijking van EV-Preps voor downstreamvisualisatie en functionele assays van vitaal belang voor EV-onderzoek. Het gebruik van EV-verrijkende nanodeeltjes, met name multi-functionele hydrogelpartikels met een diameter van 700-800 nm, is een cruciale stap in het bereiken van geconcentreerde EV-Preps. Ze bezitten een aromatische aas met een hoge affiniteit die is ingekapseld door een poreuze buitenste zeef schaal om selectiviteit te bevorderen. De nanodeeltjes die in deze studie worden gebruikt, omvatten twee verschillende preparaten met verschillende kern loten (reactieve rode 120 NT80; en Cibacron blauw F3GA NT82) die hebben aangetoond dat de inname van EVs uit verschillende reagentia en biovloeistoffen toeneemt (Zie de tabel met materialen )6,10,11,12,13,14,15. De deeltjes bieden een eenvoudige verrijking van EVS uit talrijke uitgangsmaterialen, waaronder iodixanol-fracties, supernatant van de celcultuur, evenals biovloeistoffen van patiënten zoals plasma, serum, cerebrale spinale vloeistoffen (CSF) en urine6,13 .
De hier gepresenteerde methode verbetert de efficiëntie van de huidige EV-zuiverings technieken door verschillende technologieën te combineren; EV neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, en deeltjes opname, om de workflow te stroomlijnen, monster vereisten te verminderen en de opbrengst te verhogen om een meer homogene EV-sample te verkrijgen voor gebruik in alle EV-onderzoek. Deze methode is met name nuttig bij het onderzoek naar EVs en de inhoud ervan tijdens virale infectie, omdat het een filtratie stap van 0,22 μm bevat om grote, ongewenste blaasjes en Vlp's uit te sluiten en de totale EV-populatie te scheiden op basis van dichtheid om effectief Isoleer EVs uit virionen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

Een van de belangrijkste obstakels op het gebied van extracellulair blaasje (EV) onderzoek vandaag is het vermogen om gezuiverde EV preparaten in een virale infectie setting te bereiken. De gepresenteerde methode is bedoeld om EVs uit de buurt van virionen (d.w.z. HIV-1) te isoleren, waardoor een hogere efficiëntie en opbrengst mogelijk is in vergelijking met conventionele ultracentrifugingsmethoden. Ons protocol bevat drie stappen: EV neerslag, dichtheidsgradiënt scheiding en deeltjes opname. Downstream assays (d.w.z. Western Blot en PCR) kunnen direct na het vastleggen van deeltjes worden uitgevoerd. Deze methode is voordelig ten opzichte van andere isolatie methoden (d.w.z. ultracentrifugatie) omdat het gebruik van minimale start volumes mogelijk maakt. Bovendien is het gebruiksvriendelijker dan alternatieve EV-isolatie methoden waarvoor meerdere ultracentrifugingsstappen nodig zijn. De gepresenteerde methode is echter beperkt in de reikwijdte van functionele EV-testen, omdat het moeilijk is om ongeschonden EVs uit onze deeltjes te eldelen. Bovendien is deze methode afgestemd op een strikt op onderzoek gebaseerde instelling en zou deze niet commercieel levensvatbaar zijn.

PEG-neerslag verhoogt de EV-opbrengst Onze combinatie benadering van EV-isolatie is aanzienlijk efficiënter in termen van EV-terugwinning in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie, zoals blijkt uit de reductie van 90% in het volume van het benodigde startmateriaal. Ultracentrifugatie, de huidige gouden standaard in EV-isolatie, vereist ongeveer 100 mL cultuur supernatant om een adequate EV-prep voor downstream-assays te produceren, terwijl ons nieuwe protoco...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev's) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Dit protocol is belangrijk omdat het extracellulaire vikjes, EV's, door een combinatie van technologieën concentreert, terwijl het mogelijk maakt voor scheiding van virions uit de buurt van EV's. Deze methode maximaliseert EV herstel boven de huidige gouden standaard van ultracentrifugatie voor meerdere downstream analyse en karakterisering van virus-vrije EV preps. Dit protocol is ideaal voor de studie van EV's en virale infecties.Deze methode kan worden aangepast aan andere virussystemen, zoals HTLV, Ebola, Zika en meer. Ik zou verwachten dat een eerste keer gebruiker van deze methode te worstelen met nanodeeltjes voorbereiding, dus we raden zorgvuldig na onze specificaties. Afhankelijk van het systeem kan enige optimalisatie nodig zijn.Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk voor het illustreren van de algehele werkstroom en nuances van het protocol, die tijd en fouten voor de eerste keer gebruikers zal verminderen. Begin met het voorbereiden van cultuur supernatant van geïnfecteerde of transfected cellen. Kweek ongeveer 10 milliliter late blokcellen gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, om ervoor te zorgen dat alle middelgrote reagentia vrij zijn van extracellulaire vesicles.Wanneer de cultuur klaar is, pellet de cellen door centrifugatie op 3,000 keer G gedurende vijf minuten en gooi de pellet. Filtreer de supernatant met een steriel 0,22 micrometerfilter en verzamel het filtraat in een schone buis. Voeg een gelijk volume peg-neerslagreagentia toe aan het filtraat en keer de buis meerdere keren om te mengen.Incubeer het mengsel op vier graden Celsius 's nachts. Na de incubatie, centrifugeren het mengsel op 1500 keer G gedurende 30 minuten, om een heterogene extracellulaire blaasje, of EV, pellet opleveren. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 150 tot 300 microliter 1X PBS, zonder calcium en magnesium.Houd de pellet op ijs, terwijl de voorbereiding van een dichtheid gradiënt. Bereid het iodixanol dichtheidsgradiëntmedium voor met 11 dichtheidsfracties, variërend van zes tot 18%iodixanol, zoals beschreven in het manuscript. Meng elke buis door vortexing en laag de dichtheid fracties in een schone en droge swingende emmer ultracentrifuge buis.Voeg de opnieuw opgehangen EV-pellet toe aan de bovenkant van het gelaagde verloop en ultracentrifuge de buis op 10, 000 keer G en vier graden Celsius gedurende 90 minuten. Breng elke fractie voorzichtig over van de ultracentrifugebuis naar een nieuwe microcentrifugebuis. Bereid een 30% drijfmest van nanodeeltjes voor EV-fractieverrijking, door gelijke volumes van NT80, NT82 en 1X-PBS te mengen.Vortex het nanodeeltjesmengsel om homogeniteit te garanderen. Voeg 30 microliter van de drijfmest toe aan elke dichtheidsfractie en meng door de buizen te pipetten of om te keren. De meest kritische stap is de toevoeging van de nano-artikelen om EV's te concentreren, na de dichtheid gradiënt scheiding.Zonder dit, EV herstel is slecht. Draai het nanodeeltje met dichtheidsfracties 's nachts, op vier graden Celsius. Dan centrifugeren de dichtheid fracties op 20,000 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Gooi de vloeistof weg en was de EV pellet twee keer met 1X-PBS. Om de pellet voor te bereiden op RNA isolatie, opnieuw op te schorten 50 microliters van autoclaved, gedeïoniseerd water, gefilterd en behandeld met depsie, volgens het manuscript richtingen. Het RNA kan dan worden geïsoleerd, met behulp van een commerciële kit.Voor analyse met gel elektroforese, opnieuw opschorten de pellet in 15 microliters van Laemmli buffer. Verwarm het monster gedurende drie minuten op 95 graden Celsius. Herhaal de verwarming stap twee keer, vortexing zachtjes en spinnen het monster naar beneden tussen de warmte cycli.Centrifugeren het monster gedurende 15 seconden op 20.000 keer G en laad het supernatant direct op de gel. Voor de beste resultaten, beperk de hoeveelheid deeltjes geladen op de gel, en voer het op 100 volt, om te voorkomen dat geladen nanodeeltjes van het invoeren van de gel. PEG neerslag zorgt voor aanzienlijk efficiënter EV herstel, dan traditionele ultracentrifugatie.Bij het gebruik van 10 milliliter cultuur resulteert deze aanpak in een ongeveer 500 keer hogere opbrengst dan ultracentrifugatie. Deze aanpak resulteert ook in een verhoogde isolatie-efficiëntie van exosomen, wat duidelijk is door hogere niveaus van exosoom marker eiwitten. Western PLA analyse toont aan, een 3000 keer de stijging van cd81, een viervoudige toename van CD63 en een 40-voudige toename van CD9.Bovendien, dit protocol maakt het mogelijk voor downstream-studies van EV gemedieerde mechanismen in HIV1-infectie, door het isoleren van EV's van verions. Westerse PLA analyse toont aan dat EV's zijn te vinden in drie fractie populaties. Terwijl het virus aanwezig is in slechts twee van hen.EV's overtreding 10,8 tot en met 12 zijn vrij van virusbesmetting. Het belangrijkste om te onthouden is dat de nanodeeltjes cruciaal zijn voor een optimale EV-verrijking. Hun toevoeging is een must.Veel downstream tests, zoals western blot, PCR, pure diomech analyse door massaspectrometrie in plaat-gebaseerde cellulaire testen kunnen worden uitgevoerd. Deze zorgen voor karakterisering, mechanistische en/of functionele studies. Deze techniek maakt specifieke studies mogelijk die EV-lading en -functionaliteit onderzoeken zonder virale achtergrond te besmetten.Dit biedt een basis voor het bestuderen van EV's in pathogenese en de ontwikkeling van potentiële therapieën. Om de beperkingen van deze techniek te overwinnen en EV-voorbereiding en isolatie toe te passen op grote volumes, raden we het gebruik van geavanceerde systemen aan, zoals tangentiale stroomfiltratie. Het gevaarlijkste te gebruiken instrument is de ultracentrifuge, tijdens de dichtheidsgradiëntscheiding.Zorg ervoor dat alle centrifugebuizen hetzelfde gewicht, om onbalans en potentiële rotor falen te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Zuivering van Pathogeen vacuolen uit<em&gt; Legionella</em&gt;-Geïnfecteerde Fagocyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Detectie en verwijdering van de Nuclease besmetting tijdens het zuiveringsproces ongehinderd van recombinante Prototype schuimend Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Vergadering en zuivering van Prototype schuimend Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...