Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Kashanchi, en particulier Gwen Cox. Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, et NS099029 à F.K.).

1. Filtration et précipitation des vésicules extracellulaires (VEV)
<ol><li>Pour préparer le supernatant de culture à partir de cellules infectées ou transfectées (c.-à-d. lignées cellulaires et/ou cellules primaires), la culture d'environ 10 ml de cellules de bois tardif pendant 5 jours à 37 oC et de 5 % de CO2 dans un milieu de culture approprié (c.-à-d. RPMI ou DMEM avec 10 % de bovins foetaux sérum [FBS]). REMARQUE: Tous les réactifs moyens de culture doivent être exempt...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+is+released+in+extracellular+vesicles+derived+from+astrocytes:+evidence+for+Nef-mediated+neurotoxicity.">HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (1), e2542 (2017).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-9+Released+from+HIV+Tat+Stimulated+Astrocytes+Mediates+Microglial+Migration.">Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Carry+HIV+Env+and+Facilitate+Hiv+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue.">Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).</li><li>Jaworski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphotropic+virus+type+1-infected+cells+secrete+exosomes+that+contain+Tax+protein.">Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).</li><li>Heinemann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

La méthode décrite permet d'améliorer le rendement des véhicules électriques et la séparation du virus des véhicules électriques en utilisant une approche combinée de l'isolement. Des quantités relativement importantes de matériau de départ (c.-à-d. supernatant cellulaire) peuvent être filtrées avant l'isolement des véhicules électriques par les précipitations, la séparation de la DG et l'enrichissement par nanoparticules, ce qui donne un volume final de 30 l, ce qui permet une utilisation immédiate d...

La recherche centrée sur les vésicules extracellulaires (VE), en particulier les exosomes, un type de VE allant de 30 à 120 nm et caractérisée par la présence de trois marqueurs de tétraspaninCD81, CD9 et CD63, a été en grande partie façonnée par le développement de méthodes d'isolement et de purifier les vésicules d'intérêt. La capacité de disséquer les mécanismes multiformes a été entravée en raison de techniques complexes et chronophages qui génèrent des échantillons composés d'une population hétérogène de vésicules générées par différentes voies avec un large éventail de contenus, tailles, et Densités. Bien qu'il s'agisse d'un problème pour presque toutes les recherches sur les véhicules électriques, il est particulièrement important lorsqu'il s'agit d'étudier les véhicules électriques dans le contexte de l'infection virale, car les virions et les particules virales (VLP) peuvent avoir un diamètre similaire aux vésicules d'intérêt. Par exemple, le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) mesure environ 100 nm de diamètre, ce qui est à peu près la même taille que de nombreux types de véhicules électriques. Pour cette raison, nous avons conçu un nouveau flux de travail d'isolement EV pour résoudre ces problèmes.
L'étalon-or actuel de l'isolement EV est l'ultracentrifugation. Cette technique utilise les différentes densités vésicules, ce qui permet aux vésicules d'être séparées par centrifugation avec sédimentation différentielle de particules de densité plus élevée par rapport aux particules de densité inférieure à chaque étape 1,2. Plusieurs étapes de centrifugation à basse vitesse sont nécessaires pour enlever les cellules intactes (300-400 x g pendant 10 min), les débris cellulaires (2 000 x g pour 10 min) et les corps apoptotiques/grandes vésicules (10 000 x g pendant 10 min). Ces purifications initiales sont suivies d'une ultracentrifugation à grande vitesse (100 000 à 200 000 x g pour 1,5 à 2 h) vers les véhicules électriques sédimentaires. Des étapes de lavage sont effectuées pour assurer davantage la pureté de EV, cependant, ceci a comme conséquence la réduction du nombre d'EV isolés, abaissant de ce fait le rendement total 3,4. L'utilité de cette méthode est encore limitée par l'exigence d'un grand nombre de cellules (environ 1 x 108) et d'un grand volume d'échantillon (-gt; 100 ml) pour obtenir des résultats adéquats.
Pour répondre aux préoccupations croissantes, la précipitation de vésicules avec des polymères hydrophiles est devenue une technique utile ces dernières années. Le polyéthylène glycol (PEG), ou d'autres réactifs de précipitation séquencés connexes, permet à l'utilisateur de démonter les vésicules, les virus et les agrégats de protéines ou d'ARN protéiques dans un échantillon en couvainant simplement l'échantillon avec le réactif de choix, suivi d'une seule vitesse basse centrifugation1,2,5. Nous avons précédemment signalé que l'utilisation de PEG ou de méthodes connexes pour précipiter les véhicules électriques par rapport à l'ultracentrifugation traditionnelle entraîne un rendement significativement plus élevé6. Cette stratégie est rapide, facile, ne nécessite pas d'équipement supplémentaire coûteux, est facilement évolutive, et conserve la structure EV. Cependant, en raison de la nature promiscuité de cette méthode, les échantillons résultants contiennent une variété de produits comprenant des protéines libres, des complexes de protéine, une gamme de véhicules électriques, et des virions nécessitant ainsi une purification supplémentaire pour obtenir la population désirée1 ,2,7,8.
Pour surmonter l'hétérogénéité des véhicules électriques obtenus à partir de diverses méthodes de précipitation, l'ultracentrifugation du gradient de densité (DG) est utilisée pour mieux séparer les particules en fonction de leur densité. Cette méthode est réalisée à l'aide d'un gradient stepwise à l'aide d'un milieu de gradient de densité, comme l'iodixanol ou le saccharose, qui permet la séparation des véhicules électriques des protéines, des complexes protéiques et des particules virales ou virales (VLP). Il est important de noter que, bien qu'on ait pensé autrefois que la DG permettait une séparation plus précise des sous-populations de veaux, on sait maintenant que les tailles et les densités de diverses vésicules peuvent se chevaucher. Par exemple, on sait que les exosomes ont des densités de flottaison de 1,08-1,22 g/mL9, tandis que les vésicules isolées du Golgi (COPIou clathrine) ont des densités de 1,05-1,12 g/mL et celles du reticu(COPII) ) sédiments à 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. En outre, si l'on désire comparer les fractions exosomal avec les fractions contenant des particules virales, cela peut devenir plus difficile en fonction de la densité du virus d'intérêt , il existe des virus autres que le VIH-1 qui sont probablement en équilibre densités comme fractions positives exosomales2.
Enfin, l'enrichissement des préparations EV pour la visualisation en aval et les essais fonctionnels est essentiel à la recherche sur les véhicules électriques. L'utilisation de nanoparticules enrichies de véhicules électriques, en particulier de particules hydrogel multifonctionnelles de 700 à 800 nm de diamètre, constituent une étape cruciale dans la réalisation de préparations concentrées pour les véhicules électriques. Ils possèdent un appât aromatique à haute affinité qui est encapsulé par une coquille de tamisage externe poreuse pour favoriser la sélectivité. Les nanoparticules utilisées dans cette étude comprennent deux préparations distinctes avec des appâts de base différents (Réactive Red 120 NT80; et Cibacron Blue F3GA NT82) qui ont montré qu'elles augmentaient la capture des véhicules électriques à partir de divers réactifs et biofluides (voir le Tableau des matériaux )6,10,11,12,13,14,15. Les particules offrent l'enrichissement facile des véhicules électriques à partir de nombreux matériaux de départ, y compris les fractions d'iodixanol, supernatant de culture cellulaire, ainsi que les biofluides patients tels que le plasma, le sérum, les fluides rachidiens (CSF), et l'urine6,13 .
La méthode présentée ici améliore l'efficacité des techniques actuelles de purification des véhicules électriques en combinant plusieurs technologies; Précipitation synveux, ultracentrifugation du gradient de densité et captage des particules, afin de rationaliser le flux de travail, de réduire les besoins en échantillons et d'augmenter le rendement afin d'obtenir un échantillon de VE plus homogène pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques. Cette méthode est particulièrement utile dans l'étude des véhicules électriques et de leur contenu pendant l'infection virale, car elle comprend une étape de filtration de 0,22 m pour exclure les vésicules et les VLP de grande taille et indésirables et la séparation de la population totale de véhicules électriques en fonction de la densité afin d'en faire efficacement isoler les véhicules électriques des virions.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

L'un des principaux obstacles dans le domaine de la recherche sur la vésicule extracellulaire (VE) aujourd'hui est la capacité d'atteindre des préparations év.s.rpure dans un environnement d'infection virale. La méthode présentée vise à isoler les véhicules électriques loin des virions (c.-à-d. le VIH-1), ce qui permet une efficacité et un rendement plus élevés par rapport aux méthodes conventionnelles d'ultracentrifugation. Notre protocole contient trois étapes : précipitation sev, séparation du gradient de densité et capture des particules. Les essais en aval (c.-à-d. western blot et PCR) peuvent être exécutés directement après la capture des particules. Cette méthode est avantageuse par rapport à d'autres méthodes d'isolement (c.-à-d. ultracentrifugation) car elle permet l'utilisation de volumes de départ minimes. En outre, il est plus convivial que les méthodes alternatives d'isolation EV nécessitant plusieurs étapes d'ultracentrifugation. Cependant, la méthode présentée est limitée dans sa portée d'essais fonctionnels EV car il est difficile d'éluter les véhicules électriques intacts de nos particules. En outre, cette méthode est adaptée à un cadre strictement fondé sur la recherche et ne serait pas commercialement viable.

Les précipitations PEG augmentent le rendement des véhicules électriques Notre approche combinée à l'isolement EV est significativement plus efficace en termes de récupération EV par rapport à l'ultracentrifugation traditionnelle, comme en témoigne la réduction de 90% du volume de matériel de départ requis. L'ultracentrifugation, l'étalon-or actuel dans l'isolement des véhicules électriques, nécessite environ 100 ml de supernatant de culture pour produi...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) loin des virions à haut rendement et à haut rendement en incorporant les précipitations EV, l'ultracentrifugation du gradient de densité et la capture des particules pour permettre un flux de travail rationalisé et une réduction du démarrage volumes, ce qui entraîne des préparations reproductibles pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques.

Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Ce protocole est significatif parce qu’il concentre les vésicules extracellulaires, les VE, à travers une combinaison de technologies, tout en permettant la séparation des virions loin des VE. Cette méthode maximise la récupération ev au-dessus de l’étalon-or actuel de l’ultracentrifugation pour l’analyse en aval multiple et la caractérisation des préparations ev sans virus. Ce protocole est idéal pour l’étude des ve et des infections virales.Cette méthode peut être adaptée à d’autres systèmes de virus, tels que le HTLV, Ebola, Zika, et plus encore. Je m’attends à ce qu’un premier utilisateur de cette méthode lutte avec la préparation des nanoparticules, nous vous recommandons donc de suivre attentivement nos spécifications. Une certaine optimisation peut être nécessaire, selon le système.La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour illustrer le flux de travail global et les nuances du protocole, ce qui réduira le temps et les erreurs pour les utilisateurs pour la première fois. Commencez par préparer le supernatant de culture à partir de cellules infectées ou transfectées. Culture d’environ 10 millilitres de cellules en rondins tardifs pendant cinq jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant que tous les réaccès moyens sont exempts de vésicules extracellulaires.Quand la culture est prête, pelleter les cellules par centrifugation à 3000 fois G pendant cinq minutes et jeter la pastille. Filtrer le supernatant à l’aide d’un filtre stérile de 0,22 micromètre et recueillir le filtrate dans un tube propre. Ajouter un volume égal de réaccents de précipitation PEG au filtrate et inverser le tube plusieurs fois pour mélanger.Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, centrifuger le mélange à 1500 fois G pendant 30 minutes, pour donner une vésicule extracellulaire hétérogène, ou EV, granulé. Jetez le supernatant et suspendez la pastille en 150 à 300 microlitres de 1X PBS, sans calcium et magnésium.Gardez la pastille sur la glace, tout en préparant un gradient de densité. Préparer le milieu de gradient de densité iodoxanol avec 11 fractions de densité, allant de six à 18% iodixanol, tel que décrit dans le manuscrit. Mélanger chaque tube par vortex et superposer les fractions de densité dans un tube d’ultracentrifugeuse à godets propre et sec.Ajouter la pastille EV re-suspendue au sommet du gradient superposé et ultracentrifuger le tube à 10 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 90 minutes. Transférez soigneusement chaque fraction du tube d’ultracentrifugeuse à un nouveau tube de microcentrifugeuse. Préparer une boue de 30% de nanoparticules pour l’enrichissement de la fraction EV, en mélangeant des volumes égaux de NT80, NT82 et 1X-PBS.Vortex le mélange de nanoparticules pour assurer l’homogénéité. Ajouter 30 microlitres de boue à chaque fraction de densité et mélanger en pipetage ou en inversant les tubes. L’étape la plus critique est l’ajout des nano-articles pour concentrer les EV, suivant la séparation du gradient de densité.Sans cela, la récupération ev est pauvre. Faites pivoter la nanoparticule contenant des fractions de densité pendant la nuit, à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez les fractions de densité à 20 000 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.Jeter le liquide et laver la pastille EV deux fois avec 1X-PBS. Pour préparer la pastille à l’isolement de l’ARN, suspendez-la 50 microlitres d’eau autoclavée et déionisée, filtrée et traitée avec depsie, selon les directives manuscrites. L’ARN peut alors être isolé, à l’aide d’un kit commercial.Pour analyse avec électrophorèse gel, re-suspendre la pastille dans 15 microlitres de tampon Laemmli. Chauffer l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Répétez l’étape de chauffage deux fois de plus, en tourbillonnant doucement et en faisant tourner l’échantillon entre les cycles de chaleur.Centrifugez l’échantillon pendant 15 secondes à 20 000 fois G, et chargez le supernatant directement sur le gel. Pour de meilleurs résultats, limitez la quantité de particules chargées sur le gel et exécutez-la à 100 volts, afin d’empêcher les nanoparticules chargées d’entrer dans le gel. Les précipitations PEG permettent une récupération significativement plus efficace des EV que l’ultracentrifugation traditionnelle.Lors de l’utilisation de 10 millilitres de culture, cette approche se traduit par un rendement environ 500 fois plus élevé que l’ultracentrifugation. Cette approche se traduit également par une efficacité d’isolement accrue des exosomes, ce qui est évident à travers des niveaux plus élevés de protéines marqueurs exosome. L’analyse occidentale de l’APL montre une augmentation de 3000 fois du CD81, une quadruple augmentation du CD63 et une augmentation de 40 fois le CD9.En outre, ce protocole permet d’études en aval des mécanismes 201 de l’infection par le VIH1, en isolant les VE des verions. L’analyse de l’APL de l’Ouest montre que les VE se trouvent dans trois populations fractionnées. Alors que le virus n’est présent que dans deux d’entre eux.L’infraction d’EV 10,8 à 12 sont exemptes de contamination par le virus. La chose la plus importante à retenir est que les nanoparticules sont cruciales pour l’enrichissement optimal des EV. Leur ajout est un must.Beaucoup d’analyses en aval, telles que la tache occidentale, PCR, analyse pure de diomech par spectrométrie de masse dans les analyses cellulaires basées sur des plaques peuvent être exécutées. Ceux-ci permettent des études de caractérisation, mécanistes et/ou fonctionnelles. Cette technique permet des études spécifiques qui examinent la cargaison ev et la fonctionnalité sans contaminer le fond viral.Ceci fournit une base pour étudier ev dans la pathogénie et le développement des thérapeutiques potentielles. Afin de surmonter les limites de cette technique et d’appliquer la préparation et l’isolement des VE à de grands volumes, nous recommandons l’utilisation de systèmes avancés, tels que la filtration tangentielle du débit. L’instrument le plus dangereux à utiliser est l’ultracentrifugeuse, pendant la séparation du gradient de densité.Assurez-vous que tous les tubes de centrifugeuse pèsent le même poids, afin d’éviter le déséquilibre et la défaillance potentielle du rotor.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification de vacuoles agent pathogène à partir<em&gt; Legionella</em&gt; Infectées par les phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield purification de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Mérozoïtes Pour utilisation en opsonisants Anticorps dosages

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Évaluation de la fonction vésiculaire extracellulaire au cours de l’Infection palustre

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

L’Assemblée et la Purification du Prototype spumavirus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...