Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות לכל חברי מעבדת Kashanchi, במיוחד גוון קוקס. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, ו NS099029 ל סיר f סאוויני).

1. סינון ומשקעים של שלפוחית ושלפוחיות (EVs)
<ol><li>כדי להכין את התרבות supernatant מתאים נגועים או מזוהמים (כלומר, קווי תא ו/או תאים ראשוניים), תרבות כ 10 מ ל של תאים מאוחר יומן במשך 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 במדיום התרבות המתאימה (כלומר, RPMI או DMEM גברת עם 10% העובר עוברי סרום [FBS]). הערה: כל התרבות ר...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+is+released+in+extracellular+vesicles+derived+from+astrocytes:+evidence+for+Nef-mediated+neurotoxicity.">HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (1), e2542 (2017).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-9+Released+from+HIV+Tat+Stimulated+Astrocytes+Mediates+Microglial+Migration.">Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Carry+HIV+Env+and+Facilitate+Hiv+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue.">Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).</li><li>Jaworski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphotropic+virus+type+1-infected+cells+secrete+exosomes+that+contain+Tax+protein.">Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).</li><li>Heinemann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

השיטה המותווה מאפשרת תשואה EV משופרת והפרדת הווירוס מ-EVs באמצעות גישה משולבת לבידוד. כמויות גדולות יחסית של חומרי התחלה (כלומר, תא supernatant) ניתן לסנן לפני EV בידוד על ידי משקעים, הפרדת DG, ו ננו-חלקיק העשרה, וכתוצאה מכך הנפח הסופי של ~ 30 μL, המאפשר שימוש מיידי במגוון של במורד הזרם השימוש בהעשרה ננו-?...

מחקר ממורכז סביב שלפוחיות ושלפוחית (EVs), במיוחד אקסוזומים, סוג של EV החל 30-120 ננומטר ומאופיין על ידי נוכחות של שלושה הטטרספב סמנים CD81, CD9, ו CD63, יש בעיקר עיצב על ידי פיתוח שיטות לבידוד ו לטהר את שלפוחית העניין. היכולת לבתר את המנגנונים הפנים היתה מעכבת עקב טכניקות מורכבות וגוזלת זמן היוצרות דגימות המורכבות מאוכלוסיה הטרוגנית של ושלפוחיות באמצעות מסלולים שונים עם מגוון רחב של תוכן, גדלים ו צפיפויות. בעוד זה בעיה עבור כמעט כל מחקר EV, זה חשוב במיוחד כאשר לימוד EVs בהקשר של זיהום נגיפי, כמו הריטונים וחלקיקים כמו וירוס (אחמי ם) יכול להיות דומה בקוטר של שלפוחיות של ריבית. לדוגמה, הנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) הוא כ 100 ננומטר בקוטר, וזה בערך באותו גודל כמו סוגים רבים של EVs. מסיבה זו, עיצבנו עבודה בידוד EV הרומן כדי לטפל בנושאים אלה.
התקן הזהב הנוכחי של EV בידוד הוא מאוד. טכניקה זו עושה שימוש בצפיפויות שונות של שלפוחית השמש, אשר מאפשר שלפוחיות להיות מופרדים על ידי צנטריפוגה עם משקעי דיפרנציאליות של חלקיקים בצפיפות גבוהה יותר לעומת חלקיקי צפיפות נמוכה בכל שלב 1,2. כמה צעדים צנטריפוגה במהירות נמוכה נדרשים להסיר תאים שלמים (300-400 x g עבור 10 דקות), פסולת תא (~ 2,000 x g עבור 10 דקות), ו האפוטוטיק גופים/שלפוחיות גדולות (~ 10,000 x g עבור 10 דקות). הפוריאות הראשונית מלווה במהירות גבוהה (100,000-200000 x g עבור 1.5-2 h) כדי משקעים EVs. לשטוף את השלבים מבוצעים כדי להבטיח את הטוהר EV, אולם, התוצאה היא ירידה של מספר EVs מבודדים, ובכך הפחתת התשואה הכוללת 3,4. כלי השירות של שיטה זו מוגבל עוד יותר על-ידי דרישת מספר גדול של תאים (כ 1 x 108) ונפח גדול לדוגמה (&Gt; 100 mL) כדי להשיג תוצאות מתאימות.
כדי לטפל בחששות ההולכת וגוברת, משקעים של שלפוחיות עם פולימרים הידרופילי הפכו לטכניקה שימושית בשנים האחרונות. פוליאתילן גליקול (פג), או ריאגנטים משקעים קשורים אחרים, מאפשר למשתמש למשוך למטה את שלפוחיות, וירוסים, חלבון או חלבון-RNA אגרגטים בתוך מדגם על-ידי מודסת את המדגם עם מגיב הבחירה, ואחריו מהירות אחת נמוכה צנטריפוגה1,2,5. אנו דיווחו בעבר כי השימוש ב-יתד או שיטות הקשורות לזרז EVs בהשוואה לתוצאות מסורתיות ה, בתשואה גבוהה משמעותית6. אסטרטגיה זו היא מהירה, קלה, אינה דורשת ציוד יקר נוסף, הוא מדרגי בקלות, ושומר על מבנה EV. עם זאת, בשל האופי המופקר של שיטה זו, הדגימות המתקבלות מכילות מגוון של מוצרים, כולל חלבונים בחינם, מכלולי חלבונים, מגוון של EVs, והריטונס ובכך דורשים טיהור נוסף כדי להשיג את האוכלוסייה הרצויה1 ,2,7,8.
כדי להתגבר על הטרוגניות של EVs שהתקבלו משיטות משקעים שונות, צפיפות מעבר הצבע הדרגתי (DG) מנוצל לחלקיקים נפרדים יותר מבוסס על הצפיפות שלהם. שיטה זו מבוצעת באמצעות מעבר הדרגתי באמצעות בינוני מעבר הדרגתי, כגון יודיאקרול או סוכרוז, המאפשר הפרדת EVs מחלבונים, מכלולי חלבונים, וירוסים או חלקיקים כמו וירוס (אחמי ם). חשוב לציין, שבזמן שבעבר חשבו שDG מאפשרת הפרדה מדויקת יותר של אוכלוסיות המשנה EV, ידוע כיום כי גדלים וצפיפויות של שלפוחיות שונות יכולות לחפוף. למשל, אקסוזומים ידועים שיש צפיפות ציפה של 1.08-1.22 g/mL9, ואילו שלפוחיות מבודדות מ-golgi (copi+ או clathrin רין+) יש צפיפויות של 1.05-1.12 g/mL ואלה מתוך הרשתית רשתית פלזמית (copi+ ) משקע ב-1.18 1.25 גרם/mL 1,2,3,4,9. בנוסף, אם אדם משתוקק להשוות שברים אקזומליים נגד שברים המכילים חלקיקים נגיפי, זה עשוי להיות קשה יותר בהתאם לצפיפות של וירוס של עניין-יש וירוסים אחרים מאשר HIV-1 כי סביר להניח באופן זהה צפיפויות שברים חיוביים שלאקזומ2.
בסופו של דבר, העשרה של EV שיטת ' עבור הדמיה במורד הזרם ומוסר פונקציונלי חיוני למחקר EV. השימוש בחלקיקים EV-מעשיר, במיוחד, רב תפקודי הידרוג'ל חלקיקים כי טווח 700-800 ננומטר בקוטר, הם צעד קריטי בהשגת מרוכז EV preps. הם בעלי פיתיון ארומטי בעלי אהדה גבוהה אשר כשעברו על ידי מעטפת ניפוי החיצונית נקבובי לקדם סלקטיביות. חלקיקי חלקיקים מנוצל במחקר זה כוללים שתי הכנות שונות עם פיתיונות ליבה שונה (מגיב אדום 120 NT80; ו cibacron כחול F3GA NT82) אשר הראו כדי להגדיל את הלכידה של EVs מתוך ריאגנטים שונים ביולואידים (לראות את הטבלה של חומרים )6,10,11,12,13,14,15. החלקיקים מציעים העשרה קלים של EVs מחומרי התחלה רבים כולל שברים יודיקסרול, התרבות התאית סופרנטאנט, כמו גם ביולואידים מטופלים כגון פלזמה, סרום, נוזלי עמוד השדרה מוחין (שדרתי), ושתן6,13 .
השיטה המוצגת כאן משפרת את היעילות של טכניקות הטיהור הנוכחיות של EV על ידי שילוב של מספר טכנולוגיות; EV משקעים, צפיפות מעבר הצבע הדרגתי, ולכידת חלקיקים, כדי לייעל את זרימת העבודה, להפחית את הדרישות לדוגמה, ולהגדיל את התשואה כדי להשיג מדגם הומוגנית יותר EV לשימוש בכל EV מחקר. שיטה זו היא שימושית במיוחד בחקירת EVs ותוכנם במהלך זיהום נגיפי כפי שהיא כוללת צעד סינון 0.22 יקרומטר כדי להוציא את החלק הגדול, לא רצוי ושלפוחיות מים והפרדה של אוכלוסיית EV סה כ מבוסס על צפיפות כדי ביעילות בודד את EVs מהריטונים

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

אחד המכשולים העיקריים בתחום של שלפוחית לפוחית מחקרית (EV) מחקר היום היא היכולת להשיג ההכנות EV מטוהרים בסביבה זיהום נגיפי. השיטה המוצגת נועדה לבודד את EVs הרחק מן הריטונים (כלומר, HIV-1), המאפשר יעילות גבוהה יותר ותשואה בהשוואה לשיטות המקובלות המקובלת. הפרוטוקול שלנו מכיל שלושה שלבים: משקעים EV, צפיפות מעבר הצבע ולכידת חלקיקים. במורד הזרם (כלומר, אבן החשופה המערבית ו-PCR) ניתן להפעיל ישירות לאחר לכידת החלקיקים. שיטה זו היא יתרון על שיטות אחרות בידוד (כלומר, ultracent, באמצעות) כפי שהיא מאפשרת שימוש באמצעי אחסון מינימלי המתחיל. יתר על כן, הוא ידידותי יותר למשתמש מאשר שיטות חלופיות EV בידוד המחייב שלבים מרובים ultracentהדו. עם זאת, את השיטה המוצגת מוגבלת היקף הפונקציונלי של EV בחני כפי שקשה לעשות EVs שלם מתוך החלקיקים שלנו. יתרה מזאת, שיטה זו מותאמת להגדרה מבוססת מחקר בלבד ולא תהיה מבחינה מסחרית.

פג המשקעים מגדילה את תשואה EV הגישה המשולבת שלנו לבידוד EV הוא יעיל יותר באופן משמעותי במונחים של התאוששות EV לעומת המסורתית ultracentהתחברות, כפי שניכר על ידי 90% צמצום הנפח של הפעלת חומר נדרש. עם זאת, התקן הזהב הנוכחי ב EV בידוד, דורש כ 100 mL של התרבות supernatant לייצר EV הכנה נ?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

פרוטוקול זה מבודד ושלפוחיות שלפוחית (EVs) הרחק מריטונים עם יעילות גבוהה ותשואה על ידי שילוב משקעים EV, צפיפות הדרגתי מעבר הצבע, ולכידת חלקיקים כדי לאפשר זרימת עבודה יעילה והפחתה של התחלת דרישות נפח, וכתוצאה מכך ההכנות לשימוש בכל מחקר EV.

טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מרכז ארסים חוץ-תאיים, כלי רכב חשמליים, באמצעות שילוב של טכנולוגיות, תוך מתן אפשרות להפרדת virions הרחק מרכבים חשמליים. שיטה זו ממקסמת את התאוששות EV מעל תקן הזהב הנוכחי של ultracentrifugation לניתוח ואפיון מרובה במורד הזרם של הכנות EV ללא וירוסים. פרוטוקול זה הוא אידיאלי לחקר זיהומים EV ו ויראלי.שיטה זו יכולה להיות מותאמת למערכות וירוסים אחרות, כגון HTLV, אבולה, זיקה, ועוד. הייתי מצפה משתמש בפעם הראשונה של שיטה זו להיאבק עם הכנת חלקיקים, ולכן אנו ממליצים בזהירות בעקבות המפרטים שלנו. ייתכן שיהיה צורך במיטוב מסוים, בהתאם למערכת.הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה להמחשת זרימת העבודה הכוללת ואת הניואנסים של הפרוטוקול, אשר יפחיתו זמן וטעויות עבור משתמשים בפעם הראשונה. התחל בהכנת תרבות על-טבעית מתאים נגועים או מתחלפיים. תרבות כ -10 מיליליטר של תאי יומן מאוחרים במשך חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לוודא כי כל בריאגנטים בינוניים הם ללא זרע חוץ תאי.כאשר התרבות מוכנה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3, 000 פעמים G במשך חמש דקות להשליך את גלולה. מסננים את העל-טבעי באמצעות מסנן מיקרומטר סטרילי של 0.22 ואוסף את הסינון בצינור נקי. מוסיפים נפח שווה של רייגנטים משקעים PEG לסינון, ולהפוך את הצינור מספר פעמים לערבב.הדגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס לילה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התערובת ב 1500 פעמים G במשך 30 דקות, כדי להניב זן חוץ תאי הטרוגניים, או EV, גלולה. השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור ב-150 עד 300 מיקרוליטרים של פיב"ג 1X, ללא סידן ומגנזיום.שמור את גלולה על קרח, תוך הכנת שיפוע צפיפות. הכינו את המדיום שיפוע צפיפות יודיקסנול עם 11 שברי צפיפות, הנעים בין שישה ל -18% יודיקסנול, כמתואר בכתב היד. מערבבים כל צינור על ידי מערבולת ושכבת שברי הצפיפות לתוך צינור דלי מתנדנד נקי ויבש אולטרהצנטריפוגה.מוסיפים את גלולת EV המושעית מחדש לראש השיפוע השכבתי ו ultracentrifuge הצינור ב 10, 000 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. מעבירים בזהירות כל שבר מצינור האולטרהצנטריפוגה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. הכן 30% תרחיף של חלקיקים להעשרת שברי EV, על-ידי ערבוב כמויות שוות של NT80, NT82 ו- 1X-PBS.מערבולת תערובת הננו-חלקיקים כדי להבטיח הומוגניות. מוסיפים 30 מיקרוליטרים של תרחיף לכל שבר צפיפות ומערבבים על ידי צינורות או היפוך הצינורות. השלב הקריטי ביותר הוא תוספת של ננו מאמרים לרכז EV של, בעקבות ההפרדה הדרגתית צפיפות.בלי זה, התאוששות EV הוא עני. סובב את הננו-חלקיק המכיל שברי צפיפות בן לילה, בארבע מעלות צלזיוס. ואז צנטריפוגה שברי הצפיפות ב 20, 000 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.להשליך את הנוזל ולשטוף את גלולת EV פעמיים עם 1X-PBS. כדי להכין את גלולה לבידוד RNA, להשעות אותו מחדש 50 microliters של מים autoclaved, deionized, מסונן ומטופל עם דמפסיה, על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן ניתן לבודד את ה- RNA באמצעות ערכה מסחרית.לניתוח עם אלקטרופורזה ג'ל, להשעות מחדש את גלולה ב 15 microliters של חיץ Laemmli. מחממים את הדגימה ל-95 מעלות במשך שלוש דקות. חזור על שלב החימום פעמיים נוספות, מערבולת בעדינות וסובב את המדגם למטה בין מחזורי החום.צנטריפוגה את הדגימה במשך 15 שניות ב 20, 000 פעמים G, ולהעמיס את supernatant ישירות על הג'ל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להגביל את כמות החלקיקים טעון על הג'ל, ולהפעיל אותו ב 100 וולט, כדי למנוע כל חלקיקים טעונים מלהיכנס לג'ל. משקעים PEG מאפשר התאוששות יעילה יותר באופן משמעותי EV, מאשר אולטרה צנטריפוגה מסורתית.בעת שימוש ב-10 מיליליטר של תרבות, גישה זו גורמת לתפוקה גבוהה פי 500 בערך מאשר אולטרהצנטריפוגה. גישה זו מביאה גם ליעילות בידוד מוגברת של אקסוזומים, אשר ניכרת באמצעות רמות גבוהות יותר של חלבוני סמן אקסוזום. ניתוח PLA המערבי מראה, עלייה של פי 3000 CD81, עלייה של פי ארבעה CD63 וגידול של פי 40 CD9.יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר מחקרים במורד הזרם של מנגנונים מתווכו EV בזיהום HIV1, על ידי בידוד EV של מ verions. ניתוח PLA המערבי מראה כי EV של נמצאים בשלוש אוכלוסיות שבר. בעוד הנגיף קיים רק בשניים מהם.העבירה של EV 10.8 עד 12 הם ללא זיהום וירוס. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא כי חלקיקים חיוניים להעשרה אופטימלית EV. התוספת שלהם היא חובה.ניתן לבצע בדיקות רבות במורד הזרם, כגון כתם מערבי, PCR, ניתוח דיומאך טהור על ידי ספקטרומטריית מסה בתשקיף תאי מבוסס צלחת. אלה מאפשרים אפיון, מחקרים מכניסטיים ו/או פונקציונליים. טכניקה זו מאפשרת מחקרים ספציפיים הבוחנים מטען EV ופונקציונליות מבלי לזהם רקע ויראלי.זה מספק בסיס לחקר EV של פתוגנזה ופיתוח של טיפולים פוטנציאליים. כדי להתגבר על המגבלות של טכניקה זו, ולהחיל הכנת EV ובידוד על כמויות גדולות, אנו ממליצים על שימוש במערכות מתקדמות, כגון סינון זרימה משיק. המכשיר המסוכן ביותר לשימוש הוא אולטרהצנטריפוגה, במהלך הפרדת שיפוע צפיפות.ודא כי כל צינורות צנטריפוגה משקל זהה, כדי למנוע חוסר איזון וכישלון רוטור פוטנציאלי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

טיהור vacuoles הפתוגן מ<em&gt; הלגיונלה</em&gt; נגועים phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...