Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
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हम Kashanchi प्रयोगशाला, विशेष रूप से वेन कॉक्स के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह कार्य राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान (एआई078859, एआई074410, एआई127351-01, एआई043894 और एनएस099029 से एफ.के.) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. निस्पंदन और अतिरिक्त वेसिकल्स की वर्षा (ईवीएस)
<ol><li>संक्रमित या ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं (यानी, सेल लाइनों और/या प्राथमिक कोशिकाओं) से संस्कृति supernatant तैयार करने के लिए, संस्कृति लगभग 10 एमएल देर से लॉग कोशि...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. 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रेखांकित विधि बढ़ाया EV उपज और अलगाव के लिए एक संयोजन दृष्टिकोण का उपयोग EVs से वायरस की जुदाई के लिए अनुमति देता है. प्रारंभिक सामग्री की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (यानी, सेल supernatant) वर्षा, डीजी जुदाई, और नैनोकण ?...

अनुसंधान extracellular vesicles (EVs) के आसपास केंद्रित, विशेष रूप से exossomes, EV का एक प्रकार 30-120 एनएम लेकर और तीन tetraspanin मार्करों CD81, CD9, और CD63 की उपस्थिति की विशेषता, मोटे तौर पर अलग करने के लिए तरीकों के विकास के द्वारा आकार दिया गया है और ब्याज के vesicles को शुद्ध. बहुमुखी तंत्र विच्छेदन करने की क्षमता जटिल और समय लेने वाली तकनीक है जो सामग्री, आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ विभिन्न रास्ते के माध्यम से उत्पन्न vesicles की एक विषम आबादी से बना नमूने उत्पन्न करने के कारण बाधित किया गया है, और घनत्व. हालांकि यह लगभग सभी EV अनुसंधान के लिए एक मुद्दा है, यह विशेष महत्व का है जब वायरल संक्रमण के संदर्भ में EVs का अध्ययन, virions और वायरस की तरह कणों के रूप में (VLPs) ब्याज की vesicles के लिए व्यास में समान हो सकता है. उदाहरण के लिए, मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) लगभग 100 एनएम व्यास है, जो लगभग कई प्रकार के ईवीएस के रूप में एक ही आकार का है। इस कारण से, हमने इन समस्याओं को हल करने के लिए एक उपन्यास EV आइसोलेशन कार्यप्रवाह डिज़ाइन किया है.
EV अलगाव के वर्तमान सोने के मानक ultracentrifugation है. इस तकनीक में विभिन्न आशय घनत्व का उपयोग किया जाता है, जो vesicles को प्रत्येक चरण 1,2में उच्च घनत्व कणों के अंतर अवसादन के साथ अपकेंद्रण द्वारा अलग करने की अनुमति देता है। बरकरार कोशिकाओं को हटाने के लिए कई कम गति centrifugation कदम आवश्यक हैं (300-400 x ग्राम 10 मिनट के लिए), सेल मलबे ($2,000 x ग्राम के लिए 10 मिनट), और apoptotic निकायों / इन प्रारंभिक शुद्धि उच्च गति ultracentrifugation द्वारा पीछा कर रहे हैं (100,000-200,000 x g के लिए 1.5-2 ज) तलछट EVs के लिए. धो कदम आगे EV शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है, तथापि, यह अलग EVs की संख्या में कमी में परिणाम है, जिससे कुल उपज 3,4कम . इस विधि की उपयोगिता आगे कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता द्वारा सीमित है (लगभग 1 x 108) और एक बड़े नमूना मात्रा (gt; 100 एमएल) पर्याप्त परिणाम प्राप्त करने के लिए.
बढ़ती चिंताओं को दूर करने के लिए, हाइड्रोफिलिक पॉलिमर के साथ vesicles की वर्षा हाल के वर्षों में एक उपयोगी तकनीक बन गया है। पॉलीथीन ग्लाइकोल (PEG), या अन्य संबंधित वर्षा अभिकर्मकों, उपयोगकर्ता बस पसंद के अभिकर्मक के साथ नमूना incubating द्वारा एक नमूना के भीतर vesicles, वायरस, और प्रोटीन या प्रोटीन-RNA समुच्चय नीचे खींचने के लिए अनुमति देता है, एक भी कम गति के बाद अपकेंद्रण1,2,5. हमने पहले सूचित किया है कि पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन की तुलना में ईवीएस को वेग देने के लिए खूंटी या संबंधित विधियों का उपयोग काफी अधिकउपज6 में होता है . इस रणनीति तेज है, आसान है, अतिरिक्त महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, आसानी से स्केलेबल है, और EV संरचना को बरकरार रखता है. हालांकि, इस विधि की promiscuous प्रकृति के कारण, जिसके परिणामस्वरूप नमूने मुक्त प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, EVs की एक श्रृंखला, और virions इस प्रकार वांछित जनसंख्या प्राप्त करने के लिए आगे शुद्धि की आवश्यकता सहित उत्पादों की एक किस्म होतेहैं 1 ,2,7,8.
विभिन्न वर्षण विधियों से प्राप्त ईवीएस की विषमता को दूर करने के लिए घनत्व प्रवणता अतिकेंद्रीकरण (डीजी) का उपयोग उनके घनत्व के आधार पर बेहतर पृथक कणों के लिए किया जाता है। इस विधि को एक घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग कर के रूप में एक stepwise ढाल का उपयोग किया जाता है, जैसे iodixanol या sucrose, जो प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, और वायरस या वायरस की तरह कणों (VLPs) से EVs के जुदाई के लिए अनुमति देता है. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, जबकि यह एक बार सोचा था कि डीजी EV subpopulations के अधिक सटीक जुदाई के लिए अनुमति दी, अब यह ज्ञात है कि आकार और विभिन्न vesicles के घनत्व ओवरलैप कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक्सोसोम के पास 1.08-1.22 g/mL9का फ्लोटेशन घनत्व होता है, जबकि गोलगी (COPI+ या क्लथ्रिन+) से अलग किए गए vesicles में 1.05-1.12 g/mL और अंत:द्रव्यीय जालिका (COPI+ से अलग किया जाता है । ) तलछट 1.18-1.25ग्राम / इसके अतिरिक्त, यदि कोई वायरल कणों वाले अंशों के विरुद्ध एक्सोसोमल भिन्नों की तुलना करना चाहता है, तो यह ब्याज के वायरस के घनत्व के आधार पर अधिक कठिन हो सकता है-एचआईवी-1 के अलावा अन्य वायरस हैं जो संभवतः एक ही पर साम्य हैं घनत्व के रूप में exosomal सकारात्मक भिन्न2.
अंत में, बहाव दृश्य और कार्यात्मक परख के लिए EV preps के संवर्धन EV अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है. EV समृद्ध नैनोकणों का उपयोग, विशेष रूप से, बहु कार्यात्मक hydrogel कणों कि व्यास में 700-800 एनएम रेंज, केंद्रित EV preps को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम हैं. वे एक उच्च आत्मीयता खुशबूदार चारा जो चयन को बढ़ावा देने के लिए एक झरझरा बाहरी sieving खोल द्वारा encapsulated के अधिकारी. इस अध्ययन में उपयोग किए गए नैनोकणों में विभिन्न कोर चारा (रिएक्टिव रेड 120 NT80; और सिबाक्रोन ब्लू F3GA NT82) के साथ दो अलग-अलग तैयारी शामिल हैं, जो विभिन्न अभिकर्मकों और बायोफ्लूइड्स से ईवीएस पर कब्जा बढ़ाने के लिए दिखाए गए हैं (सामग्री की तालिका देखें) )6,10,11,12,13,14,15. कणों iodixanol भिन्न, सेल संस्कृति supernatant, साथ ही इस तरह के प्लाज्मा, सीरम, मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ (सीएसएफ), और मूत्र6,13 के रूप में रोगी biofluids सहित कई प्रारंभिक सामग्री से EVs के आसान संवर्धन प्रदान करते हैं .
यहाँ प्रस्तुत विधि कई प्रौद्योगिकियों के संयोजन के द्वारा वर्तमान EV शुद्धि तकनीक की दक्षता में सुधार; EV वर्षा, घनत्व ढाल ultracentrifugation, और कण पर कब्जा, कार्यप्रवाह को कारगर बनाने के लिए, नमूना आवश्यकताओं को कम करने, और सभी EV अनुसंधान में उपयोग के लिए एक अधिक समरूप EV नमूना प्राप्त करने के लिए उपज में वृद्धि. इस विधि EVs और वायरल संक्रमण के दौरान उनकी सामग्री की जांच में विशेष रूप से उपयोगी है के रूप में यह एक 0.22 डिग्री निस्पंदन कदम बड़े, अवांछित vesicles और VLPs और कुल EV जनसंख्या के जुदाई को प्रभावी ढंग से प्रभावी ढंग से घनत्व के आधार पर बाहर करने के लिए भी शामिल है virions से EVs को अलग.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

extracellular vesicle (EV) अनुसंधान के क्षेत्र में प्रमुख बाधाओं में से एक आज एक वायरल संक्रमण सेटिंग में शुद्ध EV तैयारी को प्राप्त करने की क्षमता है. प्रस्तुत विधि virions से दूर EVs को अलग करने के लिए होती है (यानी, एचआईवी-1), पारंपरिक ultracentrifugation तरीकों की तुलना में एक उच्च दक्षता और उपज के लिए अनुमति देता है. हमारे प्रोटोकॉल तीन कदम शामिल हैं: EV वर्षा, घनत्व ढाल जुदाई, और कण पर कब्जा. डाउनस्ट्रीम परख (यानी, पश्चिमी धब्बा, और पीसीआर) सीधे कण पर कब्जा निम्नलिखित चलाया जा सकता है। यह विधि अन्य अलगाव तरीकों पर फायदेमंद है (यानी, ultracentrifugation) के रूप में यह कम से कम शुरू संस्करणों के उपयोग के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, यह कई ultracentrifugation कदम की आवश्यकता होती है वैकल्पिक EV अलगाव तरीकों की तुलना में अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल है. हालांकि, प्रस्तुत विधि कार्यात्मक EV assays के अपने दायरे में सीमित है के रूप में यह हमारे कणों से बरकरार EVs elute करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, इस विधि एक कड़ाई से अनुसंधान आधारित सेटिंग की दिशा में सिलवाया है और व्यावसायिक रूप से व्यवहार्य नहीं होगा.

खूंटी वर्षण ईवी उपज बढ़ जाती है EV अलगाव के लिए हमारे संयोजन दृष्टिकोण काफी अधिक EV वसूली के मामले में कुशल के रूप में पारंपरिक ultracentrifugation की तुलना में है, के रूप में शुरू सामग्री की मात्रा ...

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Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

इस प्रोटोकॉल ev वर्षा, घनत्व ढाल ultracentrifugation को शामिल करके उच्च दक्षता और उपज के साथ virions से दूर extracellular vesicles (EVs) अलग, और कण पर कब्जा एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह और शुरू करने की कमी के लिए अनुमति देने के लिए मात्रा आवश्यकताओं, सभी EV अनुसंधान में उपयोग के लिए reproduible तैयारी में जिसके परिणामस्वरूप.

वायरस से दूर उच्च उपज extracellular Vesicle तैयारी की शुद्धि

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह ईवीएस से दूर विरियंस को अलग करने की अनुमति देते हुए प्रौद्योगिकियों के संयोजन के माध्यम से एक्सासेलर वेसिकल्स, ईवीएस को केंद्रित करता है। यह विधि वायरस मुक्त ईवी प्रेप के कई डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और लक्षण वर्णन के लिए अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के वर्तमान सोने के मानक से ऊपर ईवी रिकवरी को अधिकतम करती है। यह प्रोटोकॉल ईवी और वायरल संक्रमणों के अध्ययन के लिए आदर्श है।इस विधि को एचटीएलवी, इबोला, ज़िका आदि जैसे अन्य वायरस प्रणालियों के अनुकूल किया जा सकता है। मैं इस विधि के पहली बार उपयोगकर्ता से नैनोपार्टिकल तैयारी के साथ संघर्ष करने की उम्मीद करूंगा, इसलिए हम अपने विनिर्देशों का सावधानीपूर्वक पालन करने की सलाह देते हैं। सिस्टम के आधार पर कुछ अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।इस विधि का दृश्य प्रदर्शन प्रोटोकॉल के समग्र कार्य प्रवाह और बारीकियों को चित्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए समय और गलतियों को कम करेगा। संक्रमित या संक्रमित कोशिकाओं से संस्कृति सुपरनेट तैयार करके शुरू करें। संस्कृति लगभग 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर पांच दिनों के लिए देर लॉग कोशिकाओं के लगभग 10 मिलीलीटर, सुनिश्चित करें कि सभी मध्यम reagents बाह्राश वेसिकल्स से मुक्त कर रहे हैं।जब संस्कृति तैयार हो जाए, तो कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 3, 000 बार जी पर अपकेंद्री द्वारा गोली दें और गोली को त्याग दें। एक बाँझ 0.22 माइक्रोमीटर फिल्टर के साथ सुपरनेट को फ़िल्टर करें और एक साफ ट्यूब में फिलट्रेट एकत्र करें। फिलट्रेट में खूंटी वर्षा अभिकर् तार की बराबर मात्रा जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए ट्यूब को कई बार उलटा करें।इस मिश्रण को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, एक विषम बाह्राश वेसिकल, या ईवी, गोली उपज के लिए, 30 मिनट के लिए 1500 बार जी पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। सुपरनैंट को त्यागें, और कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना, 1X पीबीएस के 150 से 300 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।घनत्व ढाल तैयार करते समय, बर्फ पर गोली रखें। पांडुलिपि में वर्णित छह से 18% आयडिक्सनॉल से लेकर 11 घनत्व अंशों के साथ iodixanol घनत्व ढाल माध्यम तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब को भंवर से मिलाएं और घनत्व के अंशों को एक साफ और सूखी झूल बाल्टी अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में लेयर करें।10, 000 बार जी, और 90 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर स्तरित ढाल और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब के शीर्ष पर फिर से निलंबित ईवी गोली जोड़ें। ध्यान से अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब से प्रत्येक अंश को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एनटी80, एनटी82 और 1X-पीबीएस की समान मात्रा को मिलाकर, ईवी अंश संवर्धन के लिए नैनोकणों का 30% घोल तैयार करें।एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए नैनोपार्टिकल मिश्रण भंवर। प्रत्येक घनत्व अंश में घोल के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूबों को पाइपिंग या उलटा करके मिलाएं। सबसे महत्वपूर्ण कदम नैनो के अलावा लेख है EV ध्यान केंद्रित करने के लिए, घनत्व ढाल जुदाई के बाद ।इसके बिना ईवी रिकवरी खराब है । चार डिग्री सेल्सियस पर, घनत्व अंशों से युक्त नैनोपार्टिकल को रात भर घुमाएं। फिर कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 20, 000 बार जी पर घनत्व अंशों अपकेंद्रित्र ।तरल को त्यागें और ईवी गोली को 1X-पीबीएस के साथ दो बार धोएं। आरएनए अलगाव के लिए गोली तैयार करने के लिए, पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार, ऑटोक्लेव, डिवोनाइज्ड पानी, फ़िल्टर और डीप्सी के साथ इलाज के ५० माइक्रोलीटर को फिर से निलंबित करें । आरएनए तो अलग किया जा सकता है, एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर ।जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ विश्लेषण के लिए, लैमली बफर के 15 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। तीन मिनट के लिए नमूना 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। हीटिंग चरण को दो बार और दोहराएं, धीरे-धीरे भंवर और गर्मी चक्र के बीच नमूना नीचे कताई।20, 000 बार जी पर 15 सेकंड के लिए नमूना अपकेंद्रित्र, और जेल पर सीधे सुपरनैंट लोड। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, जेल पर लोड किए गए कणों की मात्रा को सीमित करें, और किसी भी लोडेड नैनोकणों को जेल में प्रवेश करने से रोकने के लिए इसे 100 वोल्ट पर चलाएं। खूंटी वर्षा पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन की तुलना में काफी अधिक कुशल ईवी वसूली के लिए अनुमति देता है।संस्कृति के 10 मिलीलीटर का उपयोग करते समय, इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन की तुलना में लगभग 500 गुना अधिक उपज होती है। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप एक्सोसोम्स की अलगाव दक्षता में भी वृद्धि होती है, जो एक्सोसोम मार्कर प्रोटीन के उच्च स्तर के माध्यम से स्पष्ट होती है। पश्चिमी पीएलए विश्लेषण से पता चलता है, सीडी 81 में 3000 गुना वृद्धि, सीडी 63 में चार गुना वृद्धि और सीडी 9 में 40 गुना वृद्धि हुई है।इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एचआईवी1 संक्रमण में EV मध्यस्थता तंत्र के डाउनस्ट्रीम अध्ययनों के लिए अनुमति देता है, ईवी को वेरियंस से अलग करके। पश्चिमी पीएलए विश्लेषण से पता चलता है कि EV तीन अंश आबादी में पाए जाते हैं । जबकि यह वायरस उनमें से केवल दो में मौजूद है।ईवी का उल्लंघन 10.8 से 12 के बीच वायरस संदूषण से मुक्त हैं। याद रखने वाली सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि नैनोकण इष्टतम ईवी संवर्धन के लिए महत्वपूर्ण हैं। उनके अलावा बहुत जरूरी है ।प्लेट-आधारित सेलुलर परख में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पश्चिमी दाग, पीसीआर, शुद्ध डायोमेच विश्लेषण जैसे कई डाउनस्ट्रीम परख किए जा सकते हैं। ये लक्षण वर्णन, यंत्रवादी, और/या कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं । यह तकनीक विशिष्ट अध्ययनों के लिए अनुमति देती है जो वायरल पृष्ठभूमि को दूषित किए बिना ईवी कार्गो और कार्यक्षमता की जांच करते हैं।यह रोगजनन और संभावित चिकित्सा विज्ञान के विकास में ईवी के अध्ययन के लिए एक नींव प्रदान करता है। इस तकनीक की सीमाओं को दूर करने के लिए, और बड़ी मात्रा में ईवी तैयारी और अलगाव लागू करने के लिए, हम उन्नत प्रणालियों के उपयोग की सलाह देते हैं, जैसे स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन। उपयोग करने के लिए सबसे खतरनाक उपकरण घनत्व ढाल जुदाई के दौरान अल्ट्रासेंट्रफ्यूज है।सुनिश्चित करें कि सभी अपकेंद्रित्र ट्यूब एक ही वजन, असंतुलन और संभावित रोटर विफलता से बचने के लिए।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

इन्फ्लुएंजा वायरस के लिए उच्च throughput जांच विधि

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

संक्रमित कोशिकाओं की Chromatin से इन्फ्लुएंजा वायरस Ribonucleoprotein के परिसर संबंध शुद्धीकरण

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

पैथोजन vacuoles की शुद्धि से<em&gt; लीजोनेला</em&gt; संक्रमित phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

सीडीएनए से संयोजक न्यूकासल रोग वायरस का बचाव

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

हाई यील्ड शोधन की<em&gt; प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emOpsonizing एंटीबॉडी Assays में इस्तेमाल के लिए&gt; खंडजाणु

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

माउस वृक्ष के समान सेल सबसेट के अलगाव के लिए एक कुशल और उच्च उपज विधि

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

न्युट्रोफिल अलगाव और विश्लेषण करने के लिए चिकित्सीय एजेंट लिंफोमा सेल संवेदनशीलता में उनकी भूमिका का निर्धारण करने के लिए

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

पता लगाने और संयोजक प्रोटोटाइप फोम वायरस Integrase के शोधन के दौरान Nuclease संदूषण को हटाने

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

मलेरिया संक्रमण के दौरान Extracellular पुटिका समारोह का मूल्यांकन

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

विधानसभा और प्रोटोटाइप फोम वायरस Intasomes का शुद्धिकरण

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...