Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
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Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Kashanchi, in particolare Gwen Cox. Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 e NS099029 a F.K.).

1. Filtrazione e precipitazione delle vescibole extracellulari (EV)
<ol><li>Per preparare il supernatante di coltura da cellule infette o transfected (cioè linee cellulari e/o cellule primarie), coltura circa 10 mL di cellule a ritardo di sangue per 5 giorni a 37 c e 5% DI CO2 nel mezzo di coltura appropriato (cioè, RPMI o DMEM con 10% bovini fetali siero [FBS]). NOT:</</c1> Tutti i reagenti medi di coltura devono essere privi di veicoli elettrici e possono essere acquistati (vedi Tabel...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

Il metodo delineato consente una maggiore resa evlari e la separazione del virus dagli eV utilizzando un approccio combinato all'isolamento. Quantità relativamente elevate di materiale di partenza (ad es. supernatante cellulare) possono essere filtrate prima dell'isolamento EV mediante precipitazioni, separazione della DG e arricchimento delle nanoparticelle, con un volume finale di 30 saggi a valle. L'uso dell'arricchimento delle nanoparticelle è essenziale in quanto, rispetto all'ultracentrifugazione tradizionale, qu...

La ricerca incentrata sulle vescicle extracellulari (EV), in particolare gli esosomi, un tipo di Veicoli che vanno 30-120 nm e caratterizzato dalla presenza di tre marcatori tetraspanina CD81, CD9 e CD63, è stato in gran parte modellato dallo sviluppo di metodi per isolare e purificare le vesciche di interesse. La capacità di sezionare meccanismi sfaccettati è stata ostacolata a causa di tecniche complesse e dispendiose in termini di tempo che generano campioni composti da una popolazione eterogenea di vescicoli generati attraverso percorsi diversi con una vasta gamma di contenuti, dimensioni e Densità. Anche se questo è un problema per quasi tutte le ricerche EV, è di particolare importanza quando si studiano i vesc nel contesto dell'infezione virale, poiché i virioni e le particelle simili a virus (VLP) possono avere un diametro simile a quello delle vesciche di interesse. Ad esempio, il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) ha un diametro di circa 100 nm, che ha all'incirca le stesse dimensioni di molti tipi di veicoli elettrici. Per questo motivo, abbiamo progettato un nuovo flusso di lavoro di isolamento EV per risolvere questi problemi.
L'attuale gold standard di isolamento EV è l'ultracentrifugazione. Questa tecnica si avvale delle varie densità vescicolari, che permettono alle vescicoli di essere separate dalla centrifugazione differenziale con sedimentazione differenziale di particelle ad alta densità rispetto a particelle a densità inferiore in ogni fase 1,2. Sono necessari diversi gradini di centrifugazione a bassa velocità per rimuovere le cellule intatte (300-400 x g per 10 min), i detriti cellulari (2.000 x g per 10 minuti) e i corpi apoptotici e le grandi vesciche (10.000 x g per 10 min). Queste purificazioni iniziali sono seguite da ultracentrifugazione ad alta velocità (100,000-200,000 x g per 1,5-2 h) per sedimentare EV. Vengono eseguite fasi di lavaggio per garantire ulteriormente la purezza dei veicoli elettrici, tuttavia, ciò comporta la riduzione del numero di VE isolate, riducendo così la resa totale 3,4. L'utilità di questo metodo è ulteriormente limitata dal requisito di un gran numero di celle (circa 1 x 108) e un grande volume di campionamento (> 100 mL) per ottenere risultati adeguati.
Per affrontare le crescenti preoccupazioni, la precipitazione delle vescicole con polimeri idrofili è diventata una tecnica utile negli ultimi anni. Il glicole in polietilene (PEG), o altri reagenti di precipitazioni correlati, consente all'utente di abbattere le vescicole, i virus e gli aggregati proteina o proteina-RNA all'interno di un campione semplicemente incubando il campione con il reagente di scelta, seguito da un singolo centrifugazione1,2,5. Abbiamo già riferito che l'uso di PEG o metodi correlati per precipitare EV rispetto ai tradizionali risultati di ultracentrifugazione in un rendimento significativamente più alto6. Questa strategia è veloce, facile, non richiede ulteriori attrezzature costose, è prontamente scalabile e mantiene la struttura EV. Tuttavia, a causa della natura promiscua di questo metodo, i campioni risultanti contengono una varietà di prodotti tra cui proteine libere, complessi proteici, una gamma di EV e virioni che richiedono quindi un'ulteriore purificazione per ottenere la popolazione desiderata1 ,2,7,8.
Per superare l'eterogeneità dei VE ottenuti da vari metodi di precipitazione, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità (DG) viene utilizzata per separare meglio le particelle in base alla loro densità. Questo metodo viene eseguito utilizzando un gradiente stepwise utilizzando un mezzo di gradiente di densità, come iodixanol o saccarosio, che consente la separazione degli EV da proteine, complessi proteici e particelle di virus o virus (VLP). È importante notare che, mentre una volta si pensava che la DG consentisse una separazione più precisa delle sottopopolazioni EV, è ormai noto che le dimensioni e le densità delle varie vesciche possono sovrapporsi. Ad esempio, gli esosomi sono noti per avere densità di galleggiamento di 1,08-1,22 g/mL9, mentre le vescicole isolate dal Golgi (COPI ) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticulum endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticulum degli endoplasmici (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) ) sedimento a 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Inoltre, se si desidera confrontare le frazioni esosomiche con le frazioni contenenti particelle virali, questo può diventare più difficile a seconda della densità del virus di interesse, ci sono virus diversi dall'HIV-1 che probabilmente equilibrato allo stesso densità come frazioni positive esosomiche2.
Infine, l'arricchimento dei presupposti EV per la visualizzazione a valle e i saggi funzionali è fondamentale per la ricerca EV. L'uso di nanoparticelle che arricchiscono EV, in particolare, particelle di idrogel multifunzionali di 700-800 nm di diametro, sono un passo fondamentale per raggiungere prep EV concentrate. Possiedono un'esca aromatica ad alta affinità che incapsulata da un guscio di setaccio esterno poroso per promuovere la selettività. Le nanoparticelle utilizzate in questo studio includono due distinti preparati con esche di base diverse (Reactive Red 120 NT80; e Cibacron Blue F3GA NT82) che hanno dimostrato di aumentare la cattura dei veli da vari reagenti e biofluidi (vedi la Tabella dei Materiali )6,10,11,12,13,14,15. Le particelle offrono un facile arricchimento degli EV da numerosi materiali di partenza, tra cui frazioni di iodixanolo, colture cellulari supernatali, nonché biofluidi pazienti come plasma, siero, fluidi spinali cerebrali (CSF) e urina6,13 .
Il metodo qui presentato migliora l'efficienza delle attuali tecniche di purificazione dei videoimpres con diverse tecnologie; Precipitazione EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle, per semplificare il flusso di lavoro, ridurre i requisiti di campionamento e aumentare la resa per ottenere un campione EV più omogeneo da utilizzare in tutte le ricerche EV. Questo metodo è particolarmente utile nello studio dei veicoli elettrici e del loro contenuto durante l'infezione virale in quanto include un passaggio di filtrazione di 0,22 m per escludere le vesciche e i VLP di grandi dimensioni e indesiderati e la separazione della popolazione totale di Veicoli leggeri in base alla densità per isolare i veicoli elettrici dai virioni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

Uno dei principali ostacoli nel campo della ricerca sulla vescicolo extracellulare (EV) oggi è la capacità di ottenere preparati EV purificati in un ambiente di infezione virale. Il metodo presentato ha lo scopo di isolare i VE lontano dai virioni (cioè L'HIV-1), consentendo una maggiore efficienza e resa rispetto ai metodi di ultracentrifugazione convenzionali. Il nostro protocollo contiene tre passaggi: precipitazione EV, separazione del gradiente di densità e cattura delle particelle. I saggi a valle (ad esempio, western blot e PCR) possono essere eseguiti direttamente dopo la cattura delle particelle. Questo metodo è vantaggioso rispetto ad altri metodi di isolamento (ad esempio, ultracentrifugation) in quanto consente l'uso di volumi di partenza minimi. Inoltre, è più facile da usare rispetto ai metodi alternativi di isolamento EV che richiedono più passaggi di ultracentrifugation. Tuttavia, il metodo presentato è limitato nella sua portata di saggi EV funzionali in quanto è difficile elusioni esitari dalle nostre particelle. Inoltre, questo metodo è adattato a un ambiente strettamente basato sulla ricerca e non sarebbe commercialmente fattibile.

Le precipitazioni PEG aumentano la resa EV Il nostro approccio combinato all'isolamento EV è significativamente più efficiente in termini di recupero EV rispetto all'ultracentrifugazione tradizionale, come evidente dalla riduzione del 90% del volume di materiale di partenza richiesto. Ultracentrifugation, l'attuale gold standard in isolamento EV, richiede circa 100 mL di coltura supernatant per produrre un'adeguata preparazione EV per i test a valle, mentre il nostro...

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Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell'avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l'uso in tutte le ricerche EV.

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Questo protocollo è significativo perché concentra vescicole extracellulari, veicoli elettrici, attraverso una combinazione di tecnologie, consentendo al contempo la separazione dei virioni dai veicoli elettrici. Questo metodo massimizza il recupero dell'EV al di sopra dell'attuale gold standard di ultracentrifugazione per l'analisi multipla a valle e la caratterizzazione di prep EV senza virus. Questo protocollo è ideale per lo studio di EV e infezioni virali.Questo metodo può essere adattato ad altri sistemi virali, come HTLV, Ebola, Zika e altro ancora. Mi aspetterei che un utente per la prima volta di questo metodo lotta con la preparazione delle nanoparticelle, quindi ti consigliamo di seguire attentamente le nostre specifiche. Potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione, a seconda del sistema.La dimostrazione visiva di questo metodo è importante per illustrare il flusso di lavoro complessivo e le sfumature del protocollo, che ridurranno tempi ed errori per gli utenti per la prima volta. Inizia preparando il supernatante della coltura da cellule infette o trasfette. Coltura circa 10 millilitri di cellule log tardive per cinque giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, assicurandosi che tutti i reagenti medi siano liberi da vescicole extracellulari.Quando la coltura è pronta, pellet le cellule per centrifugazione a 3.000 volte G per cinque minuti e scartare il pellet. Filtrare il supernatante con un filtro sterile da 0,22 micrometri e raccogliere il filtrato in un tubo pulito. Aggiungere un volume uguale di reagenti di precipitazione PEG al filtrato e invertire il tubo più volte per mescolare.Incubare la miscela a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela a 1500 volte G per 30 minuti, per produrre una vescicola extracellulare eterogenea, o EV, pellet. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 150-300 microlitri di 1X PBS, senza calcio e magnesio.Mantenere il pellet sul ghiaccio, mentre si prepara un gradiente di densità. Preparare il mezzo gradiente di densità iodixanolo con 11 frazioni di densità, che vanno dal sei al 18% di iodixanolo, come descritto nel manoscritto. Mescolare ogni tubo vortice e sovrapporre le frazioni di densità in un tubo ultracentrifugo a secchio oscillante pulito e asciutto.Aggiungere il pellet EV ri-sospeso nella parte superiore della sfumatura stratificata e ultracentrifugare il tubo a 10.000 volte G e quattro gradi Celsius per 90 minuti. Trasferire con cura ogni frazione dal tubo ultracentrifugo a un nuovo tubo di microcentrifugo. Preparare un liquame al 30% di nanoparticelle per l'arricchimento delle frazioni EV, mescolando volumi uguali di NT80, NT82 e 1X-PBS.Vortice la miscela di nanoparticelle per garantire omogeneità. Aggiungere 30 microlitri del liquame ad ogni frazione di densità e mescolare tubazione o invertire i tubi. Il passaggio più critico è l'aggiunta dei nano-articoli per concentrare gli EV, seguendo la separazione del gradiente di densità.Senza questo, il recupero dell'EV è scarso. Ruotare la nanoparticella contenente frazioni di densità durante la notte, a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare le frazioni di densità a 20.000 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.Scartare il liquido e lavare il pellet EV due volte con 1X-PBS. Per preparare il pellet per l'isolamento dell'RNA, sospenderlo di 50 microlitri di acqua autoclavata, deionizzata, filtrata e trattata con depsy, secondo le indicazioni manoscritte. L'RNA può quindi essere isolato, utilizzando un kit commerciale.Per l'analisi con elettroforesi gel, sospendere di nuovo il pellet in 15 microlitri di tampone Laemmli. Riscaldare il campione a 95 gradi Celsius per tre minuti. Ripetere il passaggio di riscaldamento altre due volte, vortice delicatamente e filatura del campione tra i cicli di calore.Centrifugare il campione per 15 secondi a 20.000 volte G e caricare il supernatante direttamente sul gel. Per ottenere i migliori risultati, limitare la quantità di particelle caricate sul gel ed eseguito a 100 volt, per evitare che eventuali nanoparticelle caricate entrino nel gel. Le precipitazioni PEG consentono un recupero ev significativamente più efficiente rispetto alla tradizionale ultracentrifugazione.Quando si utilizzano 10 millilitri di coltura, questo approccio si traduce in una resa circa 500 volte superiore rispetto all'ultracentrifugazione. Questo approccio si traduce anche in una maggiore efficienza di isolamento degli esosomi, che è evidente attraverso livelli più elevati di proteine marcatori esosomi. L'analisi western PLA mostra, un aumento di 3000 volte del CD81, un aumento di quattro volte del CD63 e un aumento di 40 volte del CD9.Inoltre, questo protocollo consente studi a valle dei meccanismi mediati dall'EV nell'infezione da HIV1, isolando i veicoli elettrici dalle verioni. L'analisi del PLA occidentale mostra che gli EV si trovano in tre popolazioni frazionarie. Mentre il virus è presente solo in due di loro.L'infrazione di EV da 10,8 a 12 è priva di contaminazione da virus. La cosa più importante da ricordare è che le nanoparticelle sono cruciali per un arricchimento ottimale dell'EV. La loro aggiunta è d'un must.Molti saggi a valle, come western blot, PCR, pure diomech analysis by mass spectrometry in test cellulari a base di piastre possono essere eseguiti. Questi consentono studi di caratterizzazione, meccanicistici e/o funzionali. Questa tecnica consente studi specifici che esaminano il carico e la funzionalità dell'EV senza contaminare lo sfondo virale.Ciò fornisce una base per lo studio dei veicoli elettrici nella patogenesi e nello sviluppo di potenziali terapie. Per superare i limiti di questa tecnica e applicare la preparazione e l'isolamento dell'EV a grandi volumi, si consiglia l'uso di sistemi avanzati, come la filtrazione del flusso tangenziale. Lo strumento più pericoloso da usare è l'ultracentrifugo, durante la separazione del gradiente di densità.Assicurarsi che tutti i tubi di centrifuga pesino allo stesso modo, per evitare squilibri e potenziali guasti al rotore.

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