Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
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カシャンチ研究室の全メンバー、特にグウェン・コックスに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金(AI078859、AI074410、AI127351-01、AI043894、NS099029)の支援を受けています。

1. 細胞外小胞(EV)の濾過と沈殿
<ol><li>感染またはトランスフェクトされた細胞(すなわち、細胞株および/または一次細胞)から培養上清を調製するために、適切な培養培地で37°Cおよび5%CO2で5日間の後期ログ細胞の約10mLを培養する(すなわち、10%の胎児ウシを用いたRPMIまたはDMEM)血清[FBS])。 注:すべての培養培地試薬はEVを含んでおらず、90分間100,000 x gで血清を事前...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

この方法は、EVの歩留まりを高め、分離への組み合わせアプローチを使用してEVからウイルスを分離することを可能にします。比較的大量の出発物質(すなわち、細胞上清)は、沈殿、DG分離、ナノ粒子濃縮によるEV分離前に濾過することができ、最終的な体積は〜30 μLとなり、様々な中で即時使用が可能下流のアッセイ。ナノ粒子濃縮の使用は、従来の超遠心分離に比べて、これらのEV濃縮ナノ?...

細胞外小胞(EV)を中心とした研究、特にエキソソームは、30〜120nmのEVの一種であり、CD81、CD9、CD63の3つのテトラスパニンマーカーの存在を特徴とし、主に分離する方法の開発によって形成されてきた。興味のある小胞を浄化する。多面的なメカニズムを解剖する能力は、幅広い内容、サイズ、および広い範囲の異なる経路を介して生成された小胞の異種集団からなるサンプルを生成する複雑で時間のかかる技術のために妨げられてきた。密度。これはほぼすべてのEV研究の課題ですが、ウイルスやウイルス様粒子(VLP)は対象の小胞と直径が似ているため、ウイルス感染の文脈でEVを研究する際に特に重要です。例えば、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)は直径約100nmで、多くのタイプのEVとほぼ同じ大きさです。このため、これらの問題に対処するための新しい EV 分離ワークフローを設計しました。
EV分離の現在のゴールドスタンダードは超遠心分離です。この技術は、様々な小胞密度を利用して、各段階1、2で、より高密度粒子と低密度粒子の差動堆積を伴う遠心分離によって小胞を分離することを可能にする。無傷の細胞(10分間300~400xg)、細胞破片(10分間は約2,000×g)、アポトーシス体/大小胞(10分間は約10,000 x g)を除去するには、いくつかの低速遠心分離ステップが必要です。これらの初期精製は、高速超遠心分離(1.5-2時間の100,000-200,000 x g)を堆積物EVに続きます。洗浄工程は、EVの純度をさらに確保するために行われるが、これにより絶縁されたEVの数が減少し、それによって総収量3、4を低下させる。この方法の有用性は、十分な結果を達成するために、多数のセル(約1 x 108)と大きなサンプル容積(> 100 mL)の要件によってさらに制限されます。
増大する懸念に対処するために、親水性ポリマーを用いた小胞の沈殿は、近年有用な技術となっている。ポリエチレングリコール(PEG)またはその他の関連する沈殿試薬は、ユーザーが選択した試薬でサンプルをインキュベートするだけでサンプル内の小胞、ウイルス、タンパク質またはタンパク質RNA凝集体をプルダウンし、その後に単一の低速を使用することができます。遠心分離1,2,5.我々は以前に、従来の超遠心分離と比較してEVを沈殿させるためにPEGまたは関連する方法を使用すると、著しく高い収率6をもたらすと報告しました。この戦略は、高速で簡単で、追加の高価な機器を必要とせず、容易にスケーラブルであり、EV構造を保持します。しかし、この方法の無差別な性質のために、得られたサンプルは、フリータンパク質、タンパク質複合体、EVの範囲、およびビリオンを含む様々な製品を含むので、所望の集団1を得るためにさらなる精製を必要とする。 、2、7、8.
様々な降水法から得られるEVの不均一性を克服するために、密度勾配超遠心分離(DG)は、その密度に基づいて粒子をより良く分離するために利用される。この方法は、タンパク質、タンパク質複合体、ウイルスまたはウイルス様粒子(VLP)からのEVの分離を可能にする、iodixanolまたはショ糖などの密度勾配媒体を用いて段階的勾配を用いて行われる。DGはEV亜集団のより正確な分離を可能にすると考えられていたが、現在では様々な小胞の大きさと密度が重なり合うことが知られていることに注意することが重要である。例えば、エキソソームは1.08-1.22 g/mL9の浮入密度を持つことが知られており、ゴルジ(COPI+またはクラトリン+)から分離された小胞は1.05-1.12 g/mLの密度を持ち、子宮内膜網状(COPII+) 1.18-1.25 g/mL1、2、3、4、9で堆積物。さらに、外染分分をウイルス粒子を含む画分と比較したい場合、目的のウイルスの密度に応じて、HIV-1以外のウイルスが同じで平衡化する可能性が高いウイルスが存在する可能性があります。外染陽性分画2としての密度。
最後に、下流の可視化と機能的アッセイのためのEV準備の充実は、EV研究に不可欠です。EV濃縮ナノ粒子、具体的には、直径700~800nmの多機能ヒドロゲル粒子の使用は、濃縮EVの準備を達成する上で重要なステップです。彼らは選択性を促進するために多孔質の外ふるい殻によって封入された高い親和性の芳香族餌を有する。本研究で利用されるナノ粒子には、様々な試薬や生体流体からのEVの捕捉を増加させる異なるコア餌(反応性赤120 NT80;チバクロンブルーF3GA NT82)を用いた2つの異なる調製物が含まれる(材料の表を参照)。 )6,10,11,12,13,14,15.この粒子は、iodixanol画分、細胞培養上清、血漿、血清、脳脊髄液(CSF)、尿6、尿などの患者の生体流体を含む多数の出発物質からEVを容易に濃縮します。.
ここで提示する方法は、いくつかの技術を組み合わせることによって、現在のEV浄化技術の効率を向上させる。EVの降水量、密度勾配超遠心分離、粒子捕捉により、ワークフローを合理化し、サンプル要件を低減し、歩留まりを高め、すべてのEV研究で使用するより均質なEVサンプルを得ることができます。この方法は、大きな不要な小胞とVLPを除外する0.22 μmの濾過ステップと、効果的に密度に基づくEV集団全体の分離を含むため、ウイルス感染時のEVおよびその内容の調査に特に有用である。EVをバイリオンから隔離する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

今日の細胞外小胞(EV)研究の分野における主要なハードルの1つは、ウイルス感染の設定で精製されたEV製剤を達成する能力です。提示された方法は、EVをバイリオン(すなわち、HIV-1)から分離することを意味し、従来の超遠心分離法と比較して、より高い効率と収率を可能にします。当社のプロトコルには、EVの降水量、密度勾配分離、粒子捕捉の3つのステップが含まれています。下流アッセイ(すなわち、ウェスタンブロット、およびPCR)は、粒子捕捉に続いて直接実行することができる。この方法は、最小限の開始ボリュームの使用を可能にする他の絶縁方法(すなわち、超遠心分離)よりも有利です。さらに、複数の超遠心分離ステップを必要とする代替EV分離方法よりもユーザーフレンドリーです。しかし、この方法は、当社の粒子から無傷のEVを溶出することは困難であるため、機能性EVアッセイの範囲に限られています。さらに、この方法は厳密に研究ベースの設定に合わせて調整され、商業的に実行可能ではありません。

PEG沈殿はEVの歩留まりを増加させる EV分離への組み合わせアプローチは、従来の超遠心分離に比べてEV回収の面で大幅に効率的であり、必要な開始材料の量が90%減少することが明らかです。EV分離における現在のゴールドスタンダードである超遠心分離は、下流アッセイに十分なEV準備を行うために約100mLの培養上清を必要としますが、当社の新しいプロ?...

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Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

このプロトコルは、EVの降水量、密度勾配超遠心分離、粒子捕捉を組み込むことにより、高効率で歩留まりのあるビリオンから離れた細胞外小胞(EV)を分離し、合理化されたワークフローと開始の削減を可能にします。すべてのEV研究で使用するための再現可能な準備をもたらす容積の条件。

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

このプロトコルは、細胞外小胞、EVを融合させながら、EVからビリオンを分離できるため、重要です。この方法は、ウイルスフリーEV準備の複数のダウンストリーム分析と特性評価のための超遠心分離の現在のゴールドスタンダードを上回るEV回復を最大化します。このプロトコルはEVとウイルス感染の研究に最適です。この方法は、HTLV、エボラ、ジカ、および多くなどの他のウイルスシステムに適応することができます。私は、この方法の初めてのユーザーがナノ粒子の調製に苦労することを期待するので、我々は慎重に我々の仕様に従うことをお勧めします。システムによっては、何らかの最適化が必要な場合があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、プロトコルの全体的な流れとニュアンスを説明するために重要であり、初めてのユーザーの時間と間違いを減らすことができます。まず、感染した細胞またはトランスフェクトされた細胞から培養上清を調製することから始めます。約10ミリリットルの後期ログ細胞を摂氏37度で5日間培養し、5%の二酸化炭素を培養し、すべての培地試薬に細胞外小胞が含まれないようにする。培養ができたら、5分間Gの3,000倍で遠心分離して細胞をペレット化し、ペレットを捨てる。滅菌0.22マイクロメートルフィルターで上清をフィルターし、きれいなチューブに濾液を集める。濾液に等量のPEG沈殿試薬を加え、チューブを数回反転して混合します。一晩摂氏4度で混合物をインキュベートします。インキュベーション後、混合物を1500回Gで30分間遠心分離し、異種の細胞外小胞、またはEV、ペレットを得た。上清を捨て、カルシウム及びマグネシウムを含まずに1XPBSの150〜300マイクロリットルでペレットを再懸濁する。密度勾配を準備しながら、氷の上にペレットを保ちます。原稿に記載されているように、6〜18%の範囲の11密度画分でイオデキサノール密度勾配培地を準備します。各チューブを渦巻きで混ぜ、密度分率を清潔で乾燥したスイングバケット超遠心チューブに重ね合わせます。再懸濁したEVペレットを層状グラデーションの上部に加え、チューブを10,000倍G、摂氏4度で90分間超遠心分離します。慎重に新しいマイクロ遠心チューブに超遠心チューブから各分を転送します。NT80、NT82、1X-PBSの等量を混合して、EV画分濃縮のためのナノ粒子の30%スラリーを調製します。ナノ粒子混合物をボルテックスして均質性を確保する。各密度の分数にスラリーの30マイクロリットルを加え、管をピペットまたは反転させることによって混ぜます。最も重要なステップは、密度勾配分離に続いて、EVを濃縮するためのナノ物品の添加です。これがなければ、EVの回復は貧弱です。密度画分を含むナノ粒子を摂氏4度で一晩回転させます。その後、密度分率を室温で5分間Gの20,000倍に遠心する。液体を捨て、EVペレットを1X-PBSで2回洗います。RNAの単離のためにペレットを調製するために、原稿の指示に従って、オートクレーブ、脱イオン水の50マイクロリットルを再中断し、濾過し、depsyで処理した。RNAは、次いで、市販のキットを使用して、単離することができます。ゲル電気泳動による分析のために、ペレットを15マイクロリットルのレムリバッファーに再懸濁します。サンプルを摂氏95度まで3分間加熱します。加熱ステップをさらに2回繰り返し、穏やかに渦を出し、熱サイクルの間にサンプルを回転させます。試料を20,000倍Gで15秒間遠心し、上澄みをゲルに直接ロードします。最良の結果を得るには、ゲルにロードされる粒子の量を制限し、100ボルトで実行して、ロードされたナノ粒子がゲルに入るのを防ぎます。PEG沈殿は、従来の超遠心分離よりも大幅に効率的なEV回収を可能にする。10ミリリットルの培養液を使用すると、このアプローチは、超遠心分離よりも約500倍高い収率をもたらす。このアプローチはまた、エキソソームの分離効率の向上をもたらし、これはより高いレベルのエキソソームマーカータンパク質を通じて明らかである。ウェスタンPLA分析は、CD81の3000倍の増加、CD63の4倍の増加およびCD9の40倍の増加を示す。さらに、このプロトコルは、HIV1感染におけるEV媒介機構の下流の研究を可能にし、EVを脊椎から隔離する。西部PLA分析は、EVが3つの割合の集団に見られることを示しています。ウイルスはそのうちの2つだけに存在しますが。EVの侵害10.8から12はウイルス汚染の無い。覚えておくべきことは、ナノ粒子が最適なEV濃縮に不可欠であるということです。彼らの追加は必須です。ウエスタンブロット、PCR、プレートベースの細胞アッセイにおける質量分析による純粋なジオメック分析などの多くの下流アッセイが行うことができる。これらは、特性評価、機械化、および/または機能研究を可能にします。この技術は、ウイルスの背景を汚染することなく、EV貨物と機能性を調べる特定の研究を可能にします。これは、病因と潜在的な治療薬の開発におけるEVの研究のための基盤を提供します。この技術の限界を克服し、EVの調製と分離を大量に適用するために、我々は、接線流ろ過などの高度なシステムを使用することを推奨します。使用する最も危険な器具は、密度勾配分離の間に、超遠心分離です。不均衡と潜在的なローターの故障を避けるために、すべての遠心管が同じ重量を重くすることを確認してください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

病原体胞の精製から<em&gt;レジオネラ菌</em&gt;感染した食細胞

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...