Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
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우리는 카산치 연구소, 특히 그웬 콕스의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) 보조금 (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 및 NS099029 F.K.)에 의해 지원되었습니다.

1. 세포외 소포의 여과 및 강수량 (EV)
<ol><li>감염또는 형질감염된 세포(즉, 세포주 및/또는 1차 세포)로부터 배양을 상판화하기 위해, 37°C에서 5일간 후기 로그 세포의 약 10 mL을 배양하고 5%CO2를 적절한 배양 배지(즉, 10% 태아 소와 함께 RPMI 또는 DMEM)에서 배양한다. 혈청 [FBS]). 참고: 모든 배양 배지 시약은 전기 TV가 없어야 하며, 90분 동안 100,000 x g의 혈청 을 사전 초원?...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. 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L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

설명된 방법을 통해 EV 수율을 높이고 격리에 대한 조합 접근 방식을 사용하여 EV에서 바이러스를 분리할 수 있습니다. 비교적 많은 양의 출발 물질(즉, 셀 상판)은 침전, DG 분리 및 나노입자 농축에 의해 EV 격리 이전에 여과될 수 있으며, 최종 부피인 ~30 μL로 다양한 종류의 즉각적인 사용을 가능하게 합니다. 다운스트림 아세이. 나노 입자 농축의 사용은 필수적이다, 기존의 초원심분리에 비해, 이?...

세포외 소포(EV)를 중심으로 한 연구는, 특히 엑소좀, 30-120 nm에 이르는 EV의 일종이며, 3개의 테트라스파닌 마커 CD81, CD9 및 CD63의 존재를 특징으로 하며, 크게 분리하고 관심의 소포를 정화. 다각적 메커니즘을 해부하는 능력은 다양한 내용, 크기 및 다양한 경로를 통해 생성 된 소포의 이기종 집단으로 구성된 샘플을 생성하는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 기술로 인해 방해되었습니다. 밀도. 이것은 거의 모든 EV 연구를 위한 문제점이있는 동안, 바이러스 감염의 맥락에서 EV를 공부할 때 특히 중요합니다, virions와 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 관심있는 소포에 직경에서 유사할 수 있기 때문에. 예를 들면, 인간 면역 결핍 바이러스 타입-1 (HIV-1)는 대략 100 nm 직경이고, 이는 많은 유형의 EV와 거의 같은 크기입니다. 이러한 이유로 이러한 문제를 해결하기 위해 새로운 EV 격리 워크플로우를 설계했습니다.
EV 절연의 현재 골드 표준은 초원심분리입니다. 이 기술은 다양한 소포 밀도를 사용하여 소포를 각 단계 1,2에서저밀도 입자대 고밀도 입자의 차동 침전으로 원심 분리하여 분리 할 수 있게합니다. 몇 가지 저속 원심 분리 단계는 손상되지 않은 세포 (10 분 동안 300-400 x g), 세포 파편 (~ 2,000 x g 10 분), 및 세포 사멸 체 / 대형 소포 (~ 10 분 동안 10 분 동안 10 분)를 제거해야합니다. 이러한 초기 정화는 퇴적 전기 전기에 고속 초원심분리 (100,000-200,000 x g 1.5-2 시간)가 뒤따릅니다. 세척 단계는 EV 순도를 더욱 보장하기 위해 수행되지만, 이로 인해 절연 된 전기 EV의 수가 감소하여 총 수율 3,4가감소합니다. 이 방법의 유틸리티는 적절한 결과를 얻기 위해 많은 수의 셀(약 1 x 108)및 큰 샘플 부피(> 100 mL)의 요구 사항에 의해 더욱 제한됩니다.
증가하는 우려를 해결하기 위해 친수성 고분자를 사용한 소포의 침전은 최근 몇 년 동안 유용한 기술이 되었습니다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 기타 관련 침전 시약은 사용자가 단순히 선택의 시약으로 샘플을 배양하여 샘플 내에서 소포, 바이러스 및 단백질 또는 단백질 RNA 응집체를 당기고 단일 저속으로 당길 수 있게 합니다. 원심 분리1,2,5. 우리는 이전에 기존의 초원심분리에 비해 전기 를 침전시키는 PEG 또는 관련 방법의 사용이 상당히 높은 수율6을초래한다는 것을 보고했다. 이 전략은 빠르고 쉽고, 추가 고가의 장비가 필요하지 않으며, 쉽게 확장 가능하며, EV 구조를 유지합니다. 그러나, 이 방법의 난잡한 특성으로 인해, 생성된 샘플은 자유 단백질, 단백질 복합체, 다양한 EV 및 바이리온을 포함한 다양한 제품을 함유하고 있으므로 원하는집단을 얻기 위해 추가적인 정제가 요구된다 1 ,2,7,8.
다양한 강수 방법에서 얻은 전기 EV의 이질성을 극복하기 위해 밀도 그라데이션 초원심분리(DG)는 밀도에 따라 입자를 더 잘 분리하는 데 활용됩니다. 이 방법은 단백질, 단백질 복합체 및 바이러스 또는 바이러스 유사 입자(VLP)로부터 EV를 분리할 수 있는 이오디산놀 또는 수크로오스와 같은 밀도 구배 배지를 사용하여 단계별 구배를 사용하여 수행됩니다. 한때 DG가 EV 하위 모집단을 보다 정밀하게 분리할 수 있다고 생각되었지만 이제는 다양한 소포의 크기와 밀도가 겹칠 수 있다는 사실이 알려져 있습니다. 예를 들어, 엑소좀은 1.08-1.22 g/mL9의 부양 밀도를가지는 것으로 알려져 있으며, 골지(COPI+ 또는 클라트린+)에서분리된 소포는 1.05-1.12 g/mL의 밀도를 가지며 소포성 망막(COPII+ ) 1.18-1.25 g /mL1,2,3,4,9에서퇴적물 . 또한, 외형 분획을 바이러스 입자를 포함하는 분획과 비교하려는 경우 관심 바이러스의 밀도에 따라 HIV-1 이외의 바이러스가 동일하게 평형화될 수 있습니다. 외인성 양성 분획과 같은 밀도2.
마지막으로, 다운스트림 시각화 및 기능적 검정을 위한 EV 준비의 강화는 EV 연구에 매우 중요합니다. EV 농축 나노 입자, 특히 직경 700-800 nm범위의 다기능 하이드로겔 입자의 사용은 농축 된 EV 준비를 달성하는 데 중요한 단계입니다. 그들은 선택성을 촉진하기 위해 다공성 외부 체질 쉘에 의해 캡슐화 높은 친화력 방향족 미끼를 보유하고 있습니다. 이 연구에서 활용된 나노 입자에는 다양한 시약 및 바이오 유체에서 전기 자동차 포획을 증가시키는 것으로 나타난 다른 코어 미끼(반응성 Red 120 NT80 및 Cibacron Blue F3GA NT82)가 있는 두 가지 뚜렷한 제제가 포함됩니다(재료 표 참조) )6,10,11,12,13,14,15. 입자는 iodixanol 분획, 세포 배양 상급자 뿐만 아니라 플라즈마, 혈청, 뇌 척수액 (CSF) 및 소변6,13과 같은 환자 생체 유체를 포함한 수많은 시작 물질에서 전기 의 쉽게 농축을 제공합니다 .
여기에 제시된 방법은 여러 기술을 결합하여 현재 EV 정제 기술의 효율성을 향상시킵니다. EV 침전, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 캡처를 통해 워크플로우를 간소화하고, 시료 요구 사항을 줄이고, 수율을 증가하여 모든 EV 연구에 사용하기 위해 보다 균일한 EV 샘플을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 0.22 μm 여과 단계를 포함하기 때문에 바이러스 감염 시 EV 및 그 내용물을 조사하는 데 특히 유용하며 밀도에 따라 크고 원치 않는 소포 및 VLP를 배제하고 총 EV 집단을 효과적으로 분리하는 단계를 포함합니다. 비리온으로부터 전기를 분리합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

세포외 소포 (EV) 연구 오늘의 필드에 있는 중요한 장애물의 한은 바이러스성 감염 조정에 있는 정제한 EV 준비를 달성하는 기능입니다. 제시된 방법은 기존의 초원심분리 방법에 비해 더 높은 효율과 수율을 허용하는 비리온(즉, HIV-1)으로부터 EV를 분리하기 위한 것입니다. 당사의 프로토콜에는 EV 강수량, 밀도 구배 분리 및 입자 캡처의 세 단계가 포함되어 있습니다. 다운스트림 어세이(즉, 웨스턴 블롯 및 PCR)는 입자 캡처 직후에 실행할 수 있습니다. 이 방법은 최소한의 시작 볼륨을 사용할 수 있으므로 다른 절연 방법(즉, 초원심분리)보다 유리합니다. 또한, 여러 초원심분리 단계를 요구하는 대체 EV 절연 방법보다 사용자 친화적이다. 그러나, 제시된 방법은 우리의 입자로부터 손상되지 않은 EV를 용출하기 어렵기 때문에 기능적 EV 어종의 범위에 제한된다. 또한,이 방법은 엄격하게 연구 기반 설정으로 조정되며 상업적으로 실행 가능하지 않을 것입니다.

PEG 강수량은 EV 수율을 증가 EV 절연에 대한 당사의 조합 접근 방식은 기존의 초원심분리에 비해 EV 회수 측면에서 훨씬 더 효율적이며, 필요한 출발 물질의 부피를 90% 감소시킴으로써 명백히 드러납니다. EV 절연의 현재 금 본위제인 초원심분리는 하류 분석에 적합한 EV 준비를 생성하기 위해 약 100 mL의 배양 상판이 필요하지만, 우리의 새로운 프로토콜은 10 mL...

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Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

이 프로토콜은 기술의 조합을 통해 세포외 소포, EV를 농축하는 동시에 EV에서 비온을 분리할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 방법은 여러 다운스트림 분석 및 바이러스 없는 EV 준비의 특성화를 위해 현재 의 금 표준보다 EV 복구를 극대화합니다. 이 프로토콜은 EV 및 바이러스 감염연구에 이상적입니다.이 방법은 HTLV, 에볼라, Zika 등과 같은 다른 바이러스 시스템에 적응할 수 있습니다. 나는이 방법의 처음 사용자가 나노 입자 준비와 투쟁 할 것으로 예상, 그래서 우리는 신중하게 우리의 사양을 따르는 것이 좋습니다. 시스템에 따라 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.이 방법의 시각적 데모는 프로토콜의 전체 작업 흐름과 뉘앙스를 설명하는 데 중요하며, 이는 처음 사용자의 시간과 실수를 줄입니다. 감염되었거나 감염된 세포에서 배양 상체를 준비하는 것으로 시작합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5일간 늦은 로그 셀의 약 10밀리리터를 배양하여 모든 중간 시약이 세포외 소포가 없는지 확인합니다.배양이 준비되면, 5 분 동안 3, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛과 펠릿을 폐기. 멸균 0.22 마이크로미터 필터로 상체를 걸러내고 깨끗한 튜브에서 여과물을 수집합니다. PEG 강수량 시약의 동일한 볼륨을 여과에 추가하고 튜브를 여러 번 반전하여 혼합합니다.하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 혼합물을 배양합니다. 인큐베이션 후, 30분 동안 1500배 G로 혼합물을 원심분리하여 이질적인 세포외 소포 또는 EV, 펠릿을 산출한다. 상체를 버리고 칼슘과 마그네슘없이 1X PBS의 150 ~ 300 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.밀도 그라데이션을 준비하는 동안 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 원고에 설명된 대로 6~18%의 iodixanol에 이르는 11밀도 분획으로 iodixanol 밀도 그라데이션 배지를 준비한다. 각 튜브를 소용돌이에 섞고 밀도 분획을 깨끗하고 건조한 스윙 버킷 울트라 센트리후지 튜브에 레이어드합니다.다시 중단된 EV 펠릿을 10, 000회 G, 섭씨 4도에서 10, 000회, 섭씨 4도의 층이 있는 그라데이션 의 상단에 90분간 추가합니다. 각 분획을 초원심분리기 튜브에서 새로운 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 이송합니다. NT80, NT82 및 1X-PBS의 동일한 볼륨을 혼합하여 EV 분수 농축을 위해 나노 입자의 30 %의 슬러리를 준비합니다.균일성을 보장하기 위해 나노 입자 혼합물을 소용돌이. 슬러리의 마이크로리터 30개를 각 밀도 분획에 넣고 튜브를 피펫팅하거나 반전시켜 섞는다. 가장 중요한 단계는 밀도 그라데이션 분리에 따라 EV를 농축하기 위해 나노 아티클을 첨가하는 것입니다.이없이, EV 복구는 가난하다. 밤새 밀도 분획을 포함하는 나노 입자를 섭씨 4도에서 회전합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 20, 000 배 G에서 밀도 분획을 원심 분리합니다.액체를 버리고 1X-PBS로 EV 펠릿을 두 번 세척하십시오. RNA 절연을 위한 펠릿을 준비하기 위하여는, 원고 지시에 따라, 학문, deionized 물, 여과 및 depsy로 취급의 50 마이크로리터를 다시 중단합니다. RNA는 상업적인 키트를 사용하여 격리될 수 있습니다.젤 전기 전구로 분석을 위해 Laemmli 버퍼의 15 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 샘플을 섭씨 95도로 3분간 가열합니다. 가열 단계를 두 번 더 반복하여 부드럽게 소용돌이를 가하고 열 주기 사이에 샘플을 아래로 회전시합니다.원심 분리는 20, 000배 G에서 15초 동안 샘플을 원심분리하고, 상신을 젤에 직접 적재합니다. 최상의 결과를 위해, 젤에 적재된 입자의 양을 제한하고, 100볼트로 실행하여 적재된 나노입자가 젤에 유입되는 것을 방지합니다. PEG 강수량은 기존의 초원심분리보다 훨씬 더 효율적인 EV 복구를 가능하게 합니다.10 밀리리터의 배양을 사용할 때, 이 접근 방식은 초원심분리기보다 약 500배 더 높은 수율을 초래합니다. 이 접근법은 또한 엑소좀의 증가된 격리 효율을 초래하며, 이는 더 높은 수준의 엑소솜 마커 단백질을 통해 분명하게 드러납니다. 서부 PLA 분석에 따르면 CD81이 3000배 증가, CD63의 4배 증가, CD9의 40배 증가.또한, 이 프로토콜은 EV의 변기를 격리하여 HIV1 감염에서 EV 매개 메커니즘의 다운스트림 연구를 허용합니다. 서부 PLA 분석에 따르면 EV는 3개의 분수 집단에서 발견됩니다. 바이러스는 그(것)들의 단지 2에서 존재하는 동안.EV의 위반 10.8에서 12까지바이러스 오염이 없습니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 나노 입자가 최적의 EV 농축에 중요하다는 것입니다. 그들의 추가는 필수입니다.플레이트 계 세포 분석에서 질량 분석법에 의한 서양 블롯, PCR, 순수 디오메치 분석과 같은 많은 하류 분석이 수행될 수 있다. 이러한 특성화를 허용, 기계론적, 및/또는 기능 적 연구. 이 기술을 사용하면 바이러스 성 배경을 오염하지 않고 EV 화물 및 기능을 검사하는 특정 연구를 할 수 있습니다.이것은 잠재적인 치료의 병기 및 발달에 있는 EV의 공부를 위한 기초를 제공합니다. 이 기술의 한계를 극복하고 EV 준비 및 격리를 대량으로 적용하려면 접선 흐름 여과와 같은 고급 시스템의 사용을 권장합니다. 가장 위험한 계측기는 밀도 그라데이션 분리 중에 초원심분리기입니다.모든 원심분리기 튜브가 불균형과 잠재적 로터 실패를 피하기 위해 동일한 가중치를 두는지 확인하십시오.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

병원체 Vacuoles의 정제에서<em&gt; Legionella</em&gt; - 감염된 Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...