Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Vi vil gjerne takke alle medlemmer av Kashanchi Lab, spesielt Gwen Cox. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, og NS099029 til F.K.).

1. filtrering og utfelling av ekstracellulære blemmer (EV)
<ol><li>For å forberede kulturen supernatanten fra infiserte eller transfekterte celler (dvs. cellelinjer og/eller primære celler), kultur ca 10 mL av sen-log celler i 5 dager ved 37 ° c og 5% CO2 i passende kultur medium (dvs. RPMI eller DMEM med 10% fosterets storfe serum [FBS]). Merk: Alle kultur medium reagenser skal være fri for EV ' r, og kan enten kjøpes (se tabell over materialer) eller tilberedes in...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+is+released+in+extracellular+vesicles+derived+from+astrocytes:+evidence+for+Nef-mediated+neurotoxicity.">HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (1), e2542 (2017).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-9+Released+from+HIV+Tat+Stimulated+Astrocytes+Mediates+Microglial+Migration.">Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Carry+HIV+Env+and+Facilitate+Hiv+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue.">Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).</li><li>Jaworski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphotropic+virus+type+1-infected+cells+secrete+exosomes+that+contain+Tax+protein.">Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).</li><li>Heinemann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

Den skisserte metoden gir forbedret EV-utbytte og separasjon av virus fra EV ' r ved hjelp av en kombinasjon tilnærming til isolasjon. Relativt store mengder Start materiale (dvs. celle supernatanten) kan filtreres før EV-isolering av nedbør, DG-separasjon og nanopartikkel berikelse, noe som resulterer i et endelig volum på ~ 30 μL, noe som åpner for umiddelbar bruk i en rekke nedstrøms analyser. Bruken av nanopartikkel berikelse er viktig som, sammenlignet med tradisjonelle ultracentrifugation, disse EV-berikende...

Forskning sentrert rundt ekstracellulære blemmer (EV), spesielt exosomes, en type EV spenner 30-120 NM og preget av tilstedeværelsen av tre tetraspanin markører CD81, CD9, og CD63, har i stor grad blitt formet av utviklingen av metoder for å isolere og rense blemmer av interesse. Evnen å analysere mangesidig mekanismer har blitt hindret på grunn av komplekse og tidkrevende teknikker som genererer prøver bestående av en heterogen befolkning av blemmer generert via ulike trasé med et bredt spekter av innhold, størrelser, og Tettheter. Selv om dette er et problem for nesten alle EV forskning, er det av særlig betydning når man studerer EV ' er i sammenheng med viral infeksjon, som virions og virus-lignende partikler (VLPs) kan være lik i diameter til blemmer av interesse. For eksempel, humant immunsvikt virus type 1 (HIV-1) er ca 100 NM i diameter, som er omtrent samme størrelse som mange typer av EV ' er. Derfor har vi utviklet en ny EV-isolasjons arbeidsflyt for å løse disse problemene.
Den nåværende gullstandarden for EV-isolering er ultracentrifugation. Denne teknikken gjør bruk av de ulike vesicle tettheten, som gjør at blemmer å bli separert av sentrifugering med differensial sedimentering av høyere tetthet partikler versus lavere tetthet partikler på hver etappe 1,2. Flere lav hastighet sentrifugering trinn er nødvendig for å fjerne intakte celler (300-400 x g i 10 min), celle rusk (~ 2 000 x g i 10 min), og apoptotisk organer/store blemmer (~ 10 000 x g i 10 min). Disse innledende renselser etterfølges av høyhastighets ultracentrifugation (100000-200000 x g for 1,5-2 h) til sediment EV-biler. Vasketrinn utføres for å ytterligere sikre EV renhet, men dette resulterer i reduksjon av antall isolerte el-biler, og dermed senke total yield 3,4. Denne metoden ' s nytte er ytterligere begrenset av kravet om et stort antall celler (ca 1 x 108) og et stort utvalg volum (&Gt; 100 ml) for å oppnå tilstrekkelige resultater.
For å møte de økende bekymringene, har utfelling av blemmer med hydrofile polymerer blitt en nyttig teknikk de siste årene. Polyetylen glykol (PEG), eller andre relaterte nedbør reagenser, gjør det mulig for brukeren å trekke ned blemmer, virus og protein eller protein-RNA-aggregater i en prøve ved å incubating prøven med reagens av valget, etterfulgt av en enkelt lav hastighet sentrifugering1,2,5. Vi har tidligere rapportert at bruk av PEG eller relaterte metoder for å fremskynde EV ' s i forhold til tradisjonelle ultracentrifugation resultater i en betydelig høyere avkastning6. Denne strategien er rask, enkel, krever ikke ekstra kostbart utstyr, er lett skalerbar, og beholder EV struktur. På grunn av den tilfeldige karakteren til denne metoden, inneholder de resulterende prøvene en rekke produkter, inkludert frie proteiner, protein komplekser, en rekke av EV ' r, og virions som dermed krever ytterligere rensing for å oppnå ønsket befolkning1 ,2,7,8.
For å overvinne heterogenitet av EV ' er innhentet fra ulike utfelling metoder, er tetthet gradient ultracentrifugation (DG) benyttet for å bedre separate partikler basert på deres tetthet. Denne metoden utføres ved hjelp av en trinnvis gradering ved hjelp av en tetthet gradient medium, for eksempel iodixanol eller sukrose, som gjør det mulig for separasjon av EV ' r fra proteiner, protein komplekser, og virus eller virus-lignende partikler (VLPs). Det er viktig å merke seg at mens det en gang var antatt at DG tillot mer presis separasjon av EV-subpopulasjoner, er det nå kjent at størrelser og tetthet av ulike blemmer kan overlappe hverandre. For eksempel er exosomes kjent for å ha flyte tettheten av 1.08-1.22 g/mL9, mens blemmer isolert fra GOLGI (COPI+ or clathrin+) har tettheten av 1.05-1.12 g/ml og de fra endoplasmatiske retikulum (COPII+ ) sediment ved 1.18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. I tillegg, hvis man ønsker å sammenligne exosomal fraksjoner mot fraksjoner som inneholder virale partikler, kan dette bli vanskeligere avhengig av tettheten av viruset av interesse-det er virus enn HIV-1 som trolig likevekt på samme tetthet som exosomal positive fraksjoner2.
Til slutt er berikelse av EV-forbereder for nedstrøms visualisering og funksjonelle analyser avgjørende for EV-forskning. Bruken av EV-berikende nanopartikler, spesielt, multi-funksjonelle hydrogel partikler som spenner 700-800 NM i diameter, er et kritisk skritt for å oppnå konsentrert EV forbereder. De har en høy affinitet aromatiske agn som innkapslet av en porøs ytre sikt skall å fremme selektivitet. Nanopartikler som benyttes i denne studien omfatter to forskjellige preparater med ulike kjerne agn (reaktiv rød 120 NT80; og Cibacron Blue F3GA NT82) som har vist å øke fangst av EV ' r fra ulike reagenser og biofluids (se tabell over materialer )6,10,11,12,13,14,15. Partiklene tilbyr enkel berikelse av EV ' r fra mange start materialer, inkludert iodixanol fraksjoner, cellekultur supernatanten, samt pasient biofluids som plasma, serum, cerebral spinal væsker (CSF) og urin6,13 .
Metoden som presenteres her forbedrer effektiviteten av dagens EV rensing teknikker ved å kombinere flere teknologier; EV nedbør, tetthet gradient ultracentrifugation, og partikkel fangst, for å effektivisere arbeidsflyten, redusere prøve krav, og øke avkastningen for å få en mer homogen EV prøve for bruk i all EV forskning. Denne metoden er spesielt nyttig i etterforskningen av EV ' r og deres innhold under viral infeksjon som inkluderer en 0,22 μm filtrerings trinn for å utelukke store, uønskede blemmer og VLPs og separasjon av den totale EV befolkningen basert på tetthet til effektivt isolere EV ' r fra virions.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

En av de store hekk innen ekstracellulære vesicle (EV) forskning i dag er evnen til å oppnå renset EV forberedelser i en viral infeksjon innstilling. Den presenterte metoden er ment å isolere EV ' r bort fra virions (dvs. HIV-1), noe som åpner for en høyere effektivitet og utbytte sammenlignet med konvensjonelle ultracentrifugation metoder. Vår protokoll inneholder tre trinn: EV nedbør, tetthet gradient separasjon, og partikkel fangst. Nedstrøms analyser (f.eks. Western Blot og PCR) kan kjøres direkte etter partikkel fangst. Denne metoden er fordelaktig fremfor andre isolasjons metoder (dvs. ultracentrifugation) som det gir mulighet for bruk av minimale Start volumer. Videre er det mer brukervennlig enn alternative EV isolasjons metoder som krever flere ultracentrifugation trinn. Den presenterte metoden er imidlertid begrenset i sitt omfang av funksjonelle EV-analyser, da det er vanskelig å eluere intakte el-biler fra våre partikler. Videre er denne metoden skreddersydd mot en strengt forskning-basert innstilling og ville ikke være kommersielt levedyktig.

PEG nedbør øker EV yield Vår kombinasjon tilnærming til EV isolasjon er betydelig mer effektiv i forhold til EV utvinning i forhold til tradisjonelle ultracentrifugation, som tydelig av 90% reduksjon i volumet av Start materialet som kreves. Ultracentrifugation, den nåværende gullstandarden i EV-isolasjon, krever omtrent 100 mL kultur supernatanten for å produsere en tilstrekkelig EV-prep for nedstrøms analyser, mens vår nye protokoll bare krever 10 mL. Denne ...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Denne protokollen isolerer ekstracellulære blemmer (EV-er) unna virions med høy effektivitet og utbytte ved å innlemme EV nedbør, tetthet gradient ultracentrifugation, og partikkel fangst for å muliggjøre en strømlinjeformet arbeidsflyt og en reduksjon av Start volum krav, noe som resulterer i reproduserbar forberedelser til bruk i all EV forskning.

Rensing av High Yield ekstracellulære vesicle preparater bort fra virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Denne protokollen er betydelig fordi den konsentrerer ekstracellulære vesikler, EV-er, gjennom en kombinasjon av teknologier, samtidig som den tillater separasjon av virsjoner vekk fra EV-er. Denne metoden maksimerer EV-gjenoppretting over den nåværende gullstandarden for ultracentrifugation for flere nedstrøms analyse og karakterisering av virusfrie EV-preps. Denne protokollen er ideell for studiet av Ev og virusinfeksjoner.Denne metoden kan tilpasses andre virussystemer, for eksempel HTLV, Ebola, Zika og mer. Jeg forventer at en førstegangsbruker av denne metoden sliter med nanopartikkelforberedelse, så vi anbefaler nøye å følge våre spesifikasjoner. Noen optimalisering kan være nødvendig, avhengig av systemet.Visuell demonstrasjon av denne metoden er viktig for å illustrere den generelle arbeidsflyten og nyansene i protokollen, noe som vil redusere tid og feil for førstegangsbrukere. Start med å forberede kultur supernatant fra infiserte eller trans infiserte celler. Kultur ca 10 milliliter sen loggceller i fem dager ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, og sørg for at alle mellomstore reagenser er fri for ekstracellulære vesikler.Når kulturen er klar, pellet cellene ved sentrifugering ved 3000 ganger G i fem minutter og kast pelleten. Filtrer supernatanten med et sterilt 0,22 mikrometerfilter og samle filtratet i et rent rør. Tilsett et likt volum peg nedbør reagenser til filtratet, og inverter røret flere ganger for å blande.Inkuber blandingen ved fire grader Celsius over natten. Etter inkubasjonen sentrifuger blandingen ved 1500 ganger G i 30 minutter, for å gi en heterogen ekstracellulær vesikkel, eller EV, pellet. Kast det overnaturlige, og suspender pelleten på plass igjen i 150 til 300 mikroliter 1X PBS, uten kalsium og magnesium.Hold pellet på is, mens du forbereder en tetthet gradient. Forbered iodixanol tetthet gradient medium med 11 tetthet fraksjoner, alt fra seks til 18% iodixanol, som beskrevet i manuskriptet. Bland hvert rør ved å virvle og lag tetthetsfraksjonene i et rent og tørt svingende bøtte ultracentrifuge rør.Legg den re-suspenderte EV pellet til toppen av lagdelt gradient og ultracentrifuge røret på 10, 000 ganger G, og fire grader Celsius i 90 minutter. Overfør forsiktig hver brøkdel fra ultracentrifuge-røret til et nytt mikrocentrifugerør. Forbered en 30% slurry av nanopartikler for EV-brøkberikelse, ved å blande like volumer av NT80, NT82 og 1X-PBS.Vortex nanopartikkelblandingen for å sikre homogenitet. Tilsett 30 mikroliter av slammet til hver tetthetsfraksjon og bland ved enten pipettering eller invertering av rørene. Det mest kritiske trinnet er tillegg av nanoartiklene for å konsentrere EV-er, etter tetthetsgradientseparasjonen.Uten dette er EV-utvinningen dårlig. Roter nanopartikkelen som inneholder tetthetsfraksjoner over natten, ved fire grader Celsius. Sentrifuger deretter tetthetsfraksjonene ved 20 000 ganger G i fem minutter ved romtemperatur.Kast væsken og vask EV pellet to ganger med 1X-PBS. For å forberede pellet for RNA isolasjon, re-suspendere det 50 mikroliter av autoklavet, deionisert vann, filtrert og behandlet med depsy, i henhold til manuskriptet retninger. RNA kan deretter isoleres ved hjelp av et kommersielt sett.For analyse med gelelektroforese, re-suspendere pellet i 15 mikroliter laemmli buffer. Varm prøven til 95 grader Celsius i tre minutter. Gjenta varmetrinnet to ganger til, virvle forsiktig og spinne prøven ned mellom varmesykluser.Sentrifuger prøven i 15 sekunder ved 20 000 ganger G, og last supernatanten direkte på gelen. For best resultat, begrens mengden partikler lastet på gelen, og kjør den på 100 volt, for å forhindre at lastede nanopartikler kommer inn i gelen. PEG nedbør gir betydelig mer effektiv EV utvinning, enn tradisjonell ultracentrifugation.Når du bruker 10 milliliter kultur, resulterer denne tilnærmingen i en ca 500 ganger høyere avkastning enn ultracentrifugation. Denne tilnærmingen resulterer også i økt isolasjonseffektivitet av eksosomer, noe som er tydelig gjennom høyere nivåer av eksosomerproteiner. Western PLA analyse viser, en 3000 ganger økning i CD81, en firedobling i CD63 og en 40 ganger økning i CD9.Videre tillater denne protokollen nedstrøms studier av EV medierte mekanismer i HIV1-infeksjon, ved å isolere EV-er fra verions. Western PLA analyse viser at EV er funnet i tre brøkdel populasjoner. Mens viruset er til stede i bare to av dem.Ev brudd 10.8 til 12 er fri for virusforurensning. Det viktigste å huske er at nanopartiklene er avgjørende for optimal EV-berikelse. Deres tillegg er et must.Mange nedstrøms analyser, som vestlig flekk, PCR, ren diomech analyse av massespektrometri i platebaserte cellulære analyser kan utføres. Disse tillater karakterisering, mekanistiske og/eller funksjonelle studier. Denne teknikken gjør det mulig for spesifikke studier som undersøker EV-last og funksjonalitet uten å forurense viral bakgrunn.Dette gir et grunnlag for å studere EV i patogenese og utvikling av potensielle terapeutiske midler. For å overvinne begrensningene i denne teknikken, og for å bruke EV-forberedelse og isolasjon på store volumer, anbefaler vi bruk av avanserte systemer, for eksempel tangential strømningsfiltrering. Det farligste instrumentet å bruke er ultracentrifuge, under tetthet gradient separasjon.Pass på at alle sentrifugerør vekter det samme, for å unngå ubalanse og potensiell rotorsvikt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity Rensing av influensavirus ribonucleoprotein Komplekser fra Chromatin av infiserte celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Rensing av Patogen vakuoler fra<em&gt; Legionella</em&gt;-Infiserte fagocytter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redning av rekombinant Newcastle Disease Virus fra cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rensing av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites For bruk i Opsonizing Antistoff Analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

En effektiv og High Yield metode for isolering av mus dendrittiske cellen Delsett

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Oppdagelse og fjerning av Nuclease forurensning under rensing av rekombinant Prototype skummende Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Evaluering av ekstracellulære Vesicle funksjonen under Malaria smitte

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montering og rensing av Prototype skummende Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...