Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Kashanchi, especialmente Gwen Cox. Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) subsídios (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 e NS099029 para F.K.).

1. filtração e precipitação de vesículas extracelulares (EVs)
<ol><li>Para preparar o sobrenadante de cultura de células infectadas ou transfectadas (i.e., linhas celulares e/ou células primárias), cultura aproximadamente 10 mL de células de log tardio por 5 dias a 37 ° c e 5% CO2 em meio de cultura apropriado (i.e., RPMI ou DMEM com 10% de bovinos fetais soro [FBS]). Nota: Todos os reagentes do meio de cultura devem estar livres de EVs, podendo ser comprados (ver tabela...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. 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L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. 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H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

O método esboçado permite o rendimento aumentado de EV e a separação de vírus de EVs usando uma aproximação da combinação ao isolamento. Quantidades relativamente grandes de material de partida (ou seja, sobrenadante celular) podem ser filtradas antes do isolamento de EV por precipitação, separação de DG e enriquecimento de nanopartículas, resultando em um volume final de ~ 30 μL, permitindo o uso imediato em uma variedade de ensaios a jusante. O uso do enriquecimento de nanopartículas é essencial, uma v...

Pesquisa centrada em torno de vesículas extracelulares (EVs), especificamente exosomas, um tipo de EV variando 30-120 nm e caracterizada pela presença de três marcadores de tetraspanina CD81, CD9 e CD63, tem sido largamente moldado pelo desenvolvimento de métodos para isolar e purificar as vesículas de interesse. A capacidade de dissecar mecanismos multifacetados tem sido dificultada devido a técnicas complexas e demoradas que geram amostras compostas por uma população heterogênea de vesículas geradas através de diferentes vias com uma ampla gama de conteúdos, tamanhos e Densidades. Embora esta seja uma questão para quase todas as pesquisas EV, é de particular importância ao estudar EVs no contexto da infecção viral, como virions e vírus-como partículas (VLPs) pode ser semelhante em diâmetro para as vesículas de interesse. Por exemplo, o tipo 1 do vírus de imunodeficiência humana (HIV-1) é aproximadamente 100 nanômetro no diâmetro, que é aproximadamente o mesmo tamanho que muitos tipos de EVs. Por esse motivo, projetamos um novo fluxo de trabalho de isolamento de EV para abordar esses problemas.
O padrão ouro atual de isolamento EV é ultracentlee. Esta técnica faz uso das várias densidades da vesícula, o que permite que as vesículas sejam separadas por centrifugação com sedimentação diferencial de partículas de maior densidade versus partículas de menor densidade em cada etapa 1,2. Várias etapas de centrifugação de baixa velocidade são necessárias para remover células intactas (300-400 x g por 10 min), detritos celulares (~ 2.000 x g por 10 min) e corpos apoptóticos/grandes vesículas (~ 10.000 x g por 10 min). Estas purificações iniciais são seguidas por ultracentlee de alta velocidade (100000-200000 x g para 1.5-2 h) aos EVS do sedimento. As etapas da lavagem são executadas para assegurar mais a pureza do EV, entretanto, isto conduz à redução do número de EVS isolados, assim abaixando o rendimento total 3,4. O utilitário deste método é ainda mais limitado pela exigência de um grande número de células (aproximadamente 1 x 108) e um grande volume amostral (&Gt; 100 ml) para alcançar resultados adequados.
Para abordar as crescentes preocupações, a precipitação de vesículas com polímeros hidrofílicos tornou-se uma técnica útil nos últimos anos. O polietileno glicol (PEG), ou outros reagentes relacionados da precipitação, permite que o usuário puxe para baixo as vesículas, os vírus, e os agregados da proteína ou do proteína-RNA dentro de uma amostra simplesmente incubando a amostra com o reagente da escolha, seguido por um único de baixa velocidade centrifugação1,2,5. Nós temos relatado previamente que o uso do PEG ou de métodos relacionados para precipentar EVs em comparação com os resultados tradicionais do ultracentlee em um rendimento significativamente mais elevado6. Esta estratégia é rápida, fácil, não requer equipamentos caros adicionais, é prontamente escalável, e retém a estrutura EV. No entanto, devido à natureza promíscuo deste método, as amostras resultantes contêm uma variedade de produtos, incluindo proteínas livres, complexos proteicos, uma gama de EVs, e virions, assim, exigindo mais purificação para obter a população desejada1 ,2,7,8.
Para superar a heterogeneidade de EVs obtidos de vários métodos da precipitação, o ultracentlee do inclinação da densidade (DG) é utilizado para separar melhor partículas baseadas em sua densidade. Este método é realizado usando um gradiente Stepwise usando um meio de gradiente de densidade, como iodixanol ou sacarose, que permite a separação de EVs de proteínas, complexos proteicos, e vírus ou vírus-como partículas (VLPs). É importante notar que, embora já tenha sido pensado que a DG permitiu a separação mais precisa das subpopulações de EV, sabe-se agora que os tamanhos e densidades de várias vesículas podem se sobrepor. Por exemplo, os exosomas são conhecidos por terem densidades de flotação de 1,08-1,22 g/mL9, enquanto as vesículas isoladas do GOLGI (copi+ ou clathrin+) têm densidades de 1,05-1,12 g/ml e as do retículo endoplasmático (copii+ ) sedimento em 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Adicionalmente, se um deseja comparar frações exosomal de encontro às frações que contêm partículas virais, esta pode tornar-se mais difícil depender em cima da densidade do vírus do interesse-há uns vírus à excepção do HIV-1 que equilibram provável ao mesmo densidades como frações positivas exosomáticas2.
Finalmente, o enriquecimento de EV Preps para visualização a jusante e ensaios funcionais é vital para a pesquisa EV. O uso de nanopartículas enriquecedora de EV, especificamente, partículas de hidrogel multifuncionais que variam 700-800 nm de diâmetro, são um passo crítico na obtenção de Preps concentrados de EV. Possuem uma isca aromática da afinidade elevada que encapsulado por um escudo de peneiramento exterior poroso para promover o selectivity. As nanopartículas utilizadas neste estudo incluem duas preparações distintas com diferentes iscas de núcleo (vermelho reactivo 120 NT80; e cibacron Blue F3GA NT82) que demonstraram aumentar a captação de EVS de vários reagentes e biofluídos (ver a tabela de materiais )6,10,11,12,13,14,15. As partículas oferecem o enriquecimento fácil dos EVS dos materiais começando numerosos que incluem frações do iodixanol, sobrenadante da cultura de pilha, assim como biofluídos pacientes tais como o plasma, o soro, os líquidos espinais cerebrais (CSF), e a urina6,13 .
O método aqui apresentado melhora a eficiência das técnicas atuais de purificação de EV, combinando várias tecnologias; Precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas, para agilizar o fluxo de trabalho, reduzir os requisitos da amostra, e aumentar o rendimento para obter uma amostra EV mais homogênea para uso em todas as pesquisas EV. Este método é particularmente útil na investigação de EVs e seu conteúdo durante a infecção viral, pois inclui um passo de filtração de 0,22 μm para excluir vesículas grandes, indesejadas e VLPs e separação da população total de EV com base na densidade para efetivamente isolar EVs de virions.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

Um dos obstáculos principais no campo da pesquisa extracelular do vesícula (EV) é hoje a habilidade de conseguir preparações purified do EV em um ajuste viral da infecção. O método apresentado destina-se a isolar EVs longe de virions (ou seja, HIV-1), permitindo uma maior eficiência e rendimento em comparação com os métodos convencionais de ultracentilugação. Nosso protocolo contém três etapas: precipitação de EV, separação de gradiente de densidade e captura de partículas. Os ensaios a jusante (i.e., Western blot e PCR) podem ser executados diretamente após a captura de partículas. Este método é vantajoso sobre outros métodos do isolamento (isto é, ultracentlee) porque permite o uso de volumes começando mínimos. Além disso, é mais amigável do que métodos alternativos do isolamento de EV que exigem etapas múltiplas do ultracentlee. Entretanto, o método apresentado é limitado em seu espaço de ensaios funcionais do EV porque é difícil eluir EVS intactos de nossas partículas. Além disso, este método é adaptado para um ajuste estritamente baseado em pesquisa e não seria comercialmente viável.

Precipitação de PEG aumenta o rendimento de EV Nossa abordagem de combinação para o isolamento de EV é significativamente mais eficiente em termos de recuperação de EV em comparação com a ultracentlee tradicional, como evidente pela redução de 90% no volume de material de partida necessário. Ultracentlee, o padrão ouro atual no isolamento EV, requer aproximadamente 100 mL de sobrenadante de cultura para produzir uma preparação adequada de EV para ensaios...

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Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) longe de virions com alta eficiência e rendimento através da incorporação de precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas para permitir um fluxo de trabalho simplificado e uma redução de partida requisitos de volume, resultando em preparações reprodutíveis para uso em todas as pesquisas EV.

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Este protocolo é significativo porque concentra vesículas extracelulares, EVs, através de uma combinação de tecnologias, ao mesmo tempo que permite a separação de virions longe dos EVs. Este método maximiza a recuperação de EV acima do padrão ouro atual de ultracentrifugação para análise múltipla a jusante e caracterização de preparações EV livres de vírus. Este protocolo é ideal para o estudo de EV's e infecções virais.Esse método pode ser adaptado a outros sistemas de vírus, como HTLV, Ebola, Zika e muito mais. Eu esperaria que um usuário pela primeira vez deste método lutasse com a preparação de nanopartículas, por isso recomendamos seguir cuidadosamente nossas especificações. Alguma otimização pode ser necessária, dependendo do sistema.A demonstração visual deste método é importante para ilustrar o fluxo de trabalho global e as nuances do protocolo, o que reduzirá o tempo e os erros para os usuários iniciantes. Comece por preparar a cultura sobrenante de células infectadas ou transfectadas. Cultura aproximadamente 10 mililitros de células de tronco tardias por cinco dias a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono, certificando-se de que todos os reagentes médios estão livres de vesículas extracelulares.Quando a cultura estiver pronta, pelota as células por centrifugação a 3.000 vezes G por cinco minutos e descarte a pelota. Filtre o supernatante com um filtro estéril de 0,22 micrômetros e colete o filtrado em um tubo limpo. Adicione um volume igual de reagentes de precipitação PEG ao filtrado e inverta o tubo várias vezes para misturar.Incubar a mistura a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação, centrifufique a mistura a 1500 vezes G por 30 minutos, para produzir uma vesícula extracelular heterogênea, ou EV, pelota. Descarte o supernascer e suspenda a pelota em 150 a 300 microlitres de 1X PBS, sem cálcio e magnésio.Mantenha a pelota no gelo, enquanto prepara um gradiente de densidade. Prepare o meio gradiente de densidade iodixanol com 11 frações de densidade, variando de seis a 18% de iodixanol, como descrito no manuscrito. Misture cada tubo por vórtice e coloque as frações de densidade em um tubo de ultracentrifuge de balde limpo e seco.Adicione a pelota EV re-suspensa ao topo do gradiente em camadas e ultracentrifugar o tubo a 10.000 vezes G e quatro graus Celsius por 90 minutos. Transfira cuidadosamente cada fração do tubo ultracentrífuga para um novo tubo de microcentrífuga. Prepare um chorume de 30% de nanopartículas para enriquecimento de fração de EV, misturando volumes iguais de NT80, NT82 e 1X-PBS.Vórtice a mistura de nanopartículas para garantir a homogeneidade. Adicione 30 microliters da pasta a cada fração de densidade e misture por pipetar ou inverter os tubos. O passo mais crítico é a adição dos nano-artigos para concentrar os EV's, após a separação do gradiente de densidade.Sem isso, a recuperação do EV é ruim. Gire a nanopartícula contendo frações de densidade durante a noite, a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugar as frações de densidade a 20.000 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente.Descarte o líquido e lave a pelota EV duas vezes com 1X-PBS. Para preparar a pelota para o isolamento do RNA, suspenda-a 50 microliters de água autoclavada, deionizada, filtrada e tratada com depsia, de acordo com as instruções do manuscrito. O RNA pode então ser isolado, usando um kit comercial.Para análise com eletroforese de gel, suspenda novamente a pelota em 15 microlitres de tampão Laemmli. Aqueça a amostra a 95 graus Celsius por três minutos. Repita o passo de aquecimento mais duas vezes, vórtice suavemente e girando a amostra entre os ciclos de calor.Centrifugar a amostra por 15 segundos a 20.000 vezes G, e carregar o supernante diretamente no gel. Para obter melhores resultados, limite a quantidade de partículas carregadas no gel, e execute-a a 100 volts, para evitar que quaisquer nanopartículas carregadas entrem no gel. A precipitação peg permite uma recuperação ev significativamente mais eficiente do que a ultracentrifugação tradicional.Ao usar 10 mililitros de cultura, essa abordagem resulta em um rendimento aproximadamente 500 vezes maior do que a ultracentrifugação. Essa abordagem também resulta em um aumento da eficiência de isolamento dos exosóis, o que é evidente através de níveis mais elevados de proteínas marcadoras exósiais. A análise do PLA ocidental mostra que um aumento de 3000 vezes no CD81, um aumento de quatro vezes no CD63 e um aumento de 40 vezes no CD9.Além disso, este protocolo permite estudos a jusante de mecanismos mediados por VE na infecção pelo HIV1, isolando os VE de verões. A análise do PLA Ocidental mostra que os EV são encontrados em três populações fracionárias. Enquanto o vírus está presente em apenas dois deles.A infração do EV 10,8 a 12 está livre de contaminação do vírus. A coisa mais importante a se lembrar é que as nanopartículas são cruciais para o enriquecimento ideal do EV. A adição deles é imperdível.Muitos ensaios a jusante, como mancha ocidental, PCR, análise pura de diomeca por espectrometria de massa em ensaios celulares baseados em placas podem ser realizados. Estes permitem a caracterização, estudos mecanicistas e/ou funcionais. Esta técnica permite estudos específicos que examinam a carga e a funcionalidade de EV sem contaminar o fundo viral.Isso fornece uma base para estudar os EV em patogênese e desenvolvimento de potenciais terapêuticas. Para superar as limitações dessa técnica, e aplicar a preparação e isolamento de EV a grandes volumes, recomendamos o uso de sistemas avançados, como filtragem de fluxo tangencial. O instrumento mais perigoso a ser usado é o ultracentrifuuge, durante a separação gradiente de densidade.Certifique-se de que todos os tubos de centrífuga ponderem o mesmo, para evitar desequilíbrio e potencial falha do rotor.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Imunologia e Infecção

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Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purificação de vacúolos patógeno de<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados Fagócitos

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