Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
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Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio de Kashanchi, especialmente a Gwen Cox. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 y NS099029 a F.K.).

1. Filtración y precipitación de vesículas extracelulares (EV)
<ol><li>Para preparar el sobrenadante de cultivo a partir de células infectadas o transfectó (es decir, líneas celulares y/o células primarias), el cultivo de aproximadamente 10 ml de células de registro tardío durante 5 días a 37 oC y 5% de CO2 en un medio de cultivo adecuado (es decir, RPMI o DMEM con 10% de suero [FBS]). NOTA: Todos los reactivos de medios de cultivo deben estar libres de vehículos eléctricos, y...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. 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L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. 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H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

El método descrito permite mejorar el rendimiento de los vehículos eléctricos y la separación del virus de los vehículos eléctricos mediante un enfoque combinado para el aislamiento. Las cantidades relativamente grandes de material de partida (es decir, sobrenadante celular) se pueden filtrar antes del aislamiento del EV por precipitación, separación DG y enriquecimiento de nanopartículas, lo que resulta en un volumen final de 30 ol, lo que permite un uso inmediato en una variedad de ensayos aguas abajo. El uso ...

La investigación centrada en vesículas extracelulares (EV), específicamente exosomas, un tipo de EV que va de 30-120 nm y se caracteriza por la presencia de tres marcadores de tetraspanrina CD81, CD9 y CD63, ha sido moldeada en gran medida por el desarrollo de métodos para aislar y purificar las vesículas de interés. La capacidad de diseccionar mecanismos multifacéticos se ha visto obstaculizada debido a técnicas complejas y que consumen mucho tiempo que generan muestras compuestas por una población heterogénea de vesículas generadas a través de diferentes vías con una amplia gama de contenidos, tamaños y Densidades. Si bien esto es un problema para casi todas las investigaciones de vehículos eléctricos, es de particular importancia cuando se estudian los vehículos eléctricos en el contexto de la infección viral, ya que los viriones y partículas similares a virus (VLP) pueden ser similares en diámetro a las vesículas de interés. Por ejemplo, el Virus de Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 (VIH-1) tiene aproximadamente 100 nm de diámetro, que es aproximadamente del mismo tamaño que muchos tipos de vehículos eléctricos. Por esta razón, hemos diseñado un nuevo flujo de trabajo de aislamiento EV para abordar estos problemas.
El estándar de oro actual de aislamiento EV es ultracentrifugación. Esta técnica hace uso de las diversas densidades vesículas, lo que permite separar las vesículas por centrifugación con sedimentación diferencial de partículas de mayor densidad frente a partículas de menor densidad en cada etapa 1,2. Se requieren varias etapas de centrifugación de baja velocidad para eliminar las células intactas (300-400 x g durante 10 min), los desechos celulares (2.000 x g durante 10 min) y los cuerpos apoptóticos/vesículas grandes (10.000 x g durante 10 min). Estas purificaciones iniciales son seguidas por la ultracentrifugación de alta velocidad (100,000-200,000 x g para 1.5-2 h) a los vehículos eléctricos sedimentados. Los pasos de lavado se realizan para asegurar aún más la pureza ev, sin embargo, esto resulta en la reducción del número de vehículos eléctricos aislados, reduciendo así el rendimiento total 3,4. La utilidad de este método está limitada aún más por el requisito de un gran número de celdas (aproximadamente 1 x 108) y un gran volumen de muestra (> 100 ml) para lograr resultados adecuados.
Para abordar las crecientes preocupaciones, la precipitación de vesículas con polímeros hidrófilos se ha convertido en una técnica útil en los últimos años. El polietilenglicol (PEG), u otros reactivos de precipitación relacionados, permite al usuario bajar las vesículas, virus y agregados de proteína o proteína-ARN dentro de una muestra simplemente incubando la muestra con el reactivo de elección, seguido de un solo valor de baja velocidad centrifugación1,2,5. Hemos informado previamente que el uso de PEG o métodos relacionados para precipitar los vehículos eléctricos en comparación con los resultados tradicionales de ultracentrifugación en un rendimiento significativamente mayor6. Esta estrategia es rápida, fácil, no requiere equipos caros adicionales, es fácilmente escalable y retiene la estructura EV. Sin embargo, debido a la naturaleza promiscua de este método, las muestras resultantes contienen una variedad de productos, incluyendo proteínas libres, complejos proteicos, una gama de vehículos eléctricos y viriones que requieren una mayor purificación para obtener la población deseada1 ,2,7,8.
Para superar la heterogeneidad de los vehículos eléctricos obtenidos a partir de diversos métodos de precipitación, la ultracentrifugación de gradiente de densidad (DG) se utiliza para separar mejor las partículas en función de su densidad. Este método se lleva a cabo utilizando un gradiente escalonado utilizando un medio de gradiente de densidad, como iodixanol o sacarosa, que permite la separación de los vehículos eléctricos de proteínas, complejos proteicos y partículas similares a virus (VLP). Es importante señalar que, si bien una vez se pensó que la DG permitía una separación más precisa de las subpoblaciones de vehículos eléctrico, ahora se sabe que los tamaños y densidades de varias vesículas pueden superponerse. Por ejemplo, se sabe que los exosomas tienen densidades de flotación de 1,08-1,22 g/mL9,mientras que las vesículas aisladas del Golgi (COPI+ o clathrin+) tienen densidades de 1,05-1,12 g/ml y las del retículo endoplasmático (COPII+ ) sedimento sin 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Además, si uno desea comparar fracciones exosomales con fracciones que contienen partículas virales, esto puede llegar a ser más difícil dependiendo de la densidad del virus de interés, hay virus distintos del VIH-1 que probablemente se equilibran al mismo tiempo densidades como fracciones positivas exosómicas2.
Por último, el enriquecimiento de los preparativos de EV para la visualización posterior y los ensayos funcionales es vital para la investigación de vehículos eléctrico. El uso de nanopartículas enriquecedoras de EV, específicamente partículas de hidrogel multifuncionales que miden 700-800 nm de diámetro, son un paso crítico para lograr preparaciones concentradas del EV. Poseen un cebo aromático de alta afinidad que encapsulado por una concha de tamizado exterior poroso para promover la selectividad. Las nanopartículas utilizadas en este estudio incluyen dos preparaciones distintas con diferentes cebos de núcleo (Reactivo Rojo 120 NT80; y Cibacron Azul F3GA NT82) que han demostrado aumentar la captura de vehículos eléctricos de diversos reactivos y biofluidos (ver la Tabla de Materiales )6,10,11,12,13,14,15. Las partículas ofrecen un fácil enriquecimiento de los vehículos eléctricos de numerosos materiales de partida, incluyendo fracciones de iodixanol, sobrenadante de cultivo celular, así como biofluidos del paciente como plasma, suero, fluidos cefalorraquídeos (CSF) y orina6,13 .
El método presentado aquí mejora la eficiencia de las técnicas actuales de purificación de EV mediante la combinación de varias tecnologías; Precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas, para agilizar el flujo de trabajo, reducir los requisitos de la muestra y aumentar el rendimiento para obtener una muestra de EV más homogénea para su uso en toda la investigación ev. Este método es particularmente útil en la investigación de los vehículos eléctricos y su contenido durante la infección viral, ya que incluye un paso de filtración de 0,22 m para excluir vesículas y VLP grandes y no deseadas y la separación de la población total de vehículos eléctricos en función de la densidad para aislar los vehículos eléctricos de los viriones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

Uno de los principales obstáculos en el campo de la investigación de vesículas extracelulares (EV) hoy en día es la capacidad de lograr preparaciones de EV purificadas en un entorno de infección viral. El método presentado está destinado a aislar los vehículos eléctricos lejos de los viriones (es decir, VIH-1), lo que permite una mayor eficiencia y rendimiento en comparación con los métodos de ultracentrifugación convencionales. Nuestro protocolo contiene tres pasos: precipitación EV, separación de gradiente de densidad y captura de partículas. Los ensayos aguas abajo (es decir, Western blot y PCR) se pueden ejecutar directamente después de la captura de partículas. Este método es ventajoso sobre otros métodos de aislamiento (es decir, ultracentrifugación) ya que permite el uso de volúmenes de inicio mínimos. Además, es más fácil de usar que los métodos alternativos de aislamiento EV que requieren múltiples pasos de ultracentrifugación. Sin embargo, el método presentado está limitado en su alcance de ensayos de EV funcionales, ya que es difícil eluir los vehículos eléctricos intactos de nuestras partículas. Además, este método se adapta a un entorno estrictamente basado en la investigación y no sería comercialmente viable.

La precipitación DE PEG aumenta el rendimiento de EV Nuestro enfoque combinado para el aislamiento EV es significativamente más eficiente en términos de recuperación de EV en comparación con la ultracentrifugación tradicional, como lo demuestra la reducción del 90% en el volumen de material de partida requerido. La ultracentrifugación, el estándar de oro actual en aislamiento EV, requiere aproximadamente 100 ml de sobrenadante de cultivo para producir una prep...

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Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Este protocolo aísla las vesículas extracelulares (EV) lejos de los viriones con alta eficiencia y rendimiento mediante la incorporación de precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas para permitir un flujo de trabajo simplificado y una reducción del inicio requisitos de volumen, lo que resulta en preparaciones reproducibles para su uso en todas las investigaciones de vehículos eléctrico.

Purificación de preparaciones de vesícula extracelular de alto rendimiento lejos del virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Este protocolo es significativo porque concentra vesículas extracelulares, vehículos eléctricos, a través de una combinación de tecnologías, al tiempo que permite la separación de viriones lejos de los vehículos eléctricos. Este método maximiza la recuperación de EV por encima del estándar de oro actual de ultracentrifugación para múltiples análisis aguas abajo y caracterización de preparaciones EV libres de virus. Este protocolo es ideal para el estudio de los vehículos eléctricos y las infecciones virales.Este método se puede adaptar a otros sistemas de virus, como la HTLV, el ébola, el zika y más. Yo esperaría que un usuario por primera vez de este método para luchar con la preparación de nanopartículas, por lo que recomendamos seguir cuidadosamente nuestras especificaciones. Puede ser necesaria alguna optimización, dependiendo del sistema.La demostración visual de este método es importante para ilustrar el flujo de trabajo general y los matices del protocolo, lo que reducirá el tiempo y los errores para los usuarios por primera vez. Comience por preparar el sobrenadante de cultivo de células infectadas o trans infectadas. Cultivo de aproximadamente 10 mililitros de células de tronco tardías durante cinco días a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono, asegurándose de que todos los reactivos medios estén libres de vesículas extracelulares.Cuando el cultivo esté listo, pele el pellet de las células por centrifugación a 3.000 veces G durante cinco minutos y deseche el pellet. Filtrar el sobrenadante con un filtro estéril de 0,22 micrómetros y recoger el filtrado en un tubo limpio. Añadir un volumen igual de reactivos de precipitación PEG al filtrado, e invertir el tubo varias veces para mezclar.Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, centrifugar la mezcla a 1500 veces G durante 30 minutos, para producir una vesícula extracelular heterogénea, o EV, pellet. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 150 a 300 microlitros de 1X PBS, sin calcio ni magnesio.Mantenga el pellet sobre hielo, mientras prepara un gradiente de densidad. Preparar el medio de gradiente de densidad de iodixanol con 11 fracciones de densidad, que van de seis a 18%iodixanol, como se describe en el manuscrito. Mezcle cada tubo por vórtice y capa de las fracciones de densidad en un tubo de ultracentrífuga de cubo oscilante limpio y seco.Agregue el pellet EV re-suspendido a la parte superior del gradiente en capas y ultracentrifríe el tubo a 10.000 veces G, y cuatro grados Celsius durante 90 minutos. Transfiera cuidadosamente cada fracción del tubo de ultracentrífuga a un nuevo tubo de microcentrífuga. Preparar un 30% de lodos de nanopartículas para el enriquecimiento de fracciones EV, mezclando volúmenes iguales de NT80, NT82 y 1X-PBS.Vórtice la mezcla de nanopartículas para asegurar la homogeneidad. Añadir 30 microlitros de la suspensión a cada fracción de densidad y mezclar pipeteando o invirtiendo los tubos. El paso más crítico es la adición de los nano-artículos para concentrar los EV, después de la separación del gradiente de densidad.Sin esto, la recuperación de EV es pobre. Gire la nanopartícula que contiene fracciones de densidad durante la noche, a cuatro grados centígrados. A continuación, centrifugar las fracciones de densidad a 20.000 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.Deseche el líquido y lave el pellet EV dos veces con 1X-PBS. Para preparar el pellet para el aislamiento de ARN, re-suspenderlo 50 microlitros de agua autoclavizada, desionizada, filtrada y tratada con depsy, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. El ARN se puede aislar, utilizando un kit comercial.Para el análisis con electroforesis de gel, vuelva a suspender el pellet en 15 microlitros de tampli de laemmli. Caliente la muestra a 95 grados centígrados durante tres minutos. Repita el paso de calentamiento dos veces más, vórtice suavemente y girando la muestra hacia abajo entre ciclos de calor.Centrifugar la muestra durante 15 segundos a 20.000 veces G, y cargue el sobrenadante directamente sobre el gel. Para obtener mejores resultados, limite la cantidad de partículas cargadas en el gel, y ejecútela a 100 voltios, para evitar que las nanopartículas cargadas entren en el gel. La precipitación PEG permite una recuperación EV significativamente más eficiente que la ultracentrifugación tradicional.Cuando se utilizan 10 mililitros de cultivo, este enfoque da como resultado un rendimiento de aproximadamente 500 veces mayor que la ultracentrifugación. Este enfoque también resulta en una mayor eficiencia de aislamiento de los exosomas, que es evidente a través de mayores niveles de proteínas marcadoras exosomas. El análisis de PLA occidental muestra, un aumento de 3000 veces en CD81, un aumento de cuatro veces en CD63 y un aumento de 40 veces en CD9.Además, este protocolo permite estudios posteriores de mecanismos mediados por EV en la infección por VIH1, aislando los vehículos eléctricos de los veriones. El análisis pla occidental muestra que los vehículos eléctricos se encuentran en tres poblaciones fraccionarias. Mientras que el virus está presente en sólo dos de ellos.La infracción de EV 10.8 a 12 está libre de contaminación por virus. Lo más importante a recordar es que las nanopartículas son cruciales para un enriquecimiento ev óptimo. Su adición es imprescindible.Se pueden realizar muchos ensayos aguas abajo, como la mancha occidental, la PCR, el análisis de diomez pura por espectrometría de masas en ensayos celulares basados en placas. Estos permiten la caracterización, estudios mecánicos y/o funcionales. Esta técnica permite estudios específicos que examinan la carga EV y la funcionalidad sin contaminar el fondo viral.Esto proporciona una base para el estudio de los vehículos eléctricos en la patogénesis y el desarrollo de posibles terapias. Para superar las limitaciones de esta técnica, y para aplicar la preparación y el aislamiento de EV a grandes volúmenes, recomendamos el uso de sistemas avanzados, como la filtración de flujo tangencial. El instrumento más peligroso de usar es la ultracentrífuga, durante la separación del gradiente de densidad.Asegúrese de que todos los tubos centrífugos pesan igual, para evitar desequilibrios y posibles fallos del rotor.

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