Name: purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Vi skulle vilja tacka alla medlemmar i Kashanchi Lab, särskilt Gwen Cox. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, och NS099029 till F.K.).

1. filtrering och utfällning av extracellulära blåsor (EVs)
<ol><li>För att förbereda kulturen supernatanten från infekterade eller transfekterade celler (dvs cellinjer och/eller primära celler), kultur cirka 10 ml sena-log celler för 5 dagar vid 37 ° c och 5% Co2 i lämpliga odlingssubstrat (dvs, RPMI eller DMEM med 10% fetal Nötkreatur serum [FBS]). Anmärkning: Alla odlingssubstrat reagenser bör vara fria från EVs, och kan antingen köpas (se tabell över material</...

<ol>
	<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>Momen-Heravi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+the+isolation+of+extracellular+vesicles.">Current methods for the isolation of extracellular vesicles.</a> Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Boriachek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Functions+and+Current+Advances+in+Isolation+and+Detection+Strategies+for+Exosome+Nanovesicles.">Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles.</a> Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).</li><li>DeMarino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+Drugs+Alter+the+Content+of+Extracellular+Vesicles+from+HIV-1-Infected+Cells.">Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Sampey, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+HIV-1-infected+Cells+Stimulate+Production+of+Pro-inflammatory+Cytokines+through+Trans-activating+Response+(TAR)+RNA.">Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).</li><li>Ahsan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Viral+RNA+and+Proteins+in+Exosomes+from+Cellular+Clones+Resistant+to+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection.">Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).</li><li>Barclay, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+uninfected+cells+activate+transcription+of+latent+HIV-1.">Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+VP40+in+Exosomes+Can+Cause+Immune+Cell+Dysfunction.">Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+VP40+Modulates+Cell+Cycle+and+Biogenesis+of+Extracellular+Vesicles.">Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Anderson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+antigens+detectable+in+CSF+exosomes+from+patients+with+retrovirus+associated+neurologic+disease:+functional+role+of+exosomes.">Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+infected+cells:+potential+for+direct+pathogenesis.">Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+HIV-1-infected+cells+contain+trans-activation+response+element+RNA.">Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).</li><li>Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+is+released+in+extracellular+vesicles+derived+from+astrocytes:+evidence+for+Nef-mediated+neurotoxicity.">HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (1), e2542 (2017).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+miR-9+Released+from+HIV+Tat+Stimulated+Astrocytes+Mediates+Microglial+Migration.">Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).</li><li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Carry+HIV+Env+and+Facilitate+Hiv+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue.">Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).</li><li>Jaworski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphotropic+virus+type+1-infected+cells+secrete+exosomes+that+contain+Tax+protein.">Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).</li><li>Heinemann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchtop+isolation+and+characterization+of+functional+exosomes+by+sequential+filtration.">Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration.</a> Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cross-flow+based+isolation+of+highly+pure+and+endocytosis-competent+extracellular+vesicles.">Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).</li><li>Heinemann, M. L., Vykoukal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Filtration:+A+Gentle+Method+for+the+Isolation+of+Functional+Extracellular+Vesicles.">Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+Flow+Filtration+for+Highly+Efficient+Concentration+of+Extracellular+Vesicles+from+Large+Volumes+of+Fluid.">Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid.</a> Cells. 7 (12), (2018).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).</li><li>Pleet, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+EVs,+and+Infections:+A+Perfect+Question+for+a+Perfect+Time.">Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).</li><li>Richards, A. L., Jackson, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Vesicle+Acidification+Promotes+Maturation+of+Infectious+Poliovirus+Particles.">Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).</li><li>Taylor, M. P., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+Cellular+Autophagy+Protein+LC3+by+Poliovirus.">Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).</li><li>Jackson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+cellular+autophagosomal+machinery+by+RNA+viruses.">Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses.</a> PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).</li><li>Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Endoplasmic+Reticulum+by+Poliovirus+Infection+and+by+Individual+Viral+Proteins:+an+Autophagy-Like+Origin+for+Virus-Induced+Vesicles.">Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles.</a> Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).</li></ol>

Den skisserat metod Tillåt för ökat EV avkastning och separationen av virus från EVs användande en kombination närma sig till isolering. Relativt stora mängder utgångsmaterial (dvs. cell supernatant) kan filtreras före EV-isolering genom nederbörd, DG separation och nanopartikelberikning, vilket resulterar i en slutlig volym på ~ 30 μL, vilket möjliggör omedelbar användning i en mängd nedströms analyser. Användningen av nanopartikelberikning är nödvändig eftersom, jämfört med traditionell ultracent...

Forskning centrerad kring extracellulära blåsor (EVs), specifikt exosomes, en typ av EV som sträcker sig 30-120 Nm och kännetecknas av närvaron av tre tetraspanin markörer CD81, CD9, och CD63, har till stor del formats av utvecklingen av metoder för att isolera och rena vesiklarna av intresse. Förmågan att dissekera mångfacetterade mekanismer har hindrats på grund av komplicerade och tidskrävande tekniker som genererar prover som består av en heterogen population av vesikler som genereras via olika vägar med ett brett spektrum av innehåll, storlekar och Tätheter. Även om detta är en fråga för nästan alla EV forskning, det är av särskild betydelse när man studerar EVs i samband med virusinfektion, som virioner och virusliknande partiklar (VLPs) kan vara liknande i diameter till vesikler av intresse. Till exempel, humant immunbrist virus typ 1 (HIV-1) är cirka 100 nm i diameter, vilket är ungefär samma storlek som många typer av EVs. Därför har vi utformat ett nytt EV-isolerings arbetsflöde för att lösa dessa problem.
Den nuvarande Guldstandarden för EV isolering är ultracentrifugation. Denna teknik utnyttjar de olika vesikeldensiteterna, vilket gör att vesiklarna kan separeras genom centrifugering med differentiell sedimentering av partiklar med högre densitet jämfört med partiklar med lägre densitet vid varje etapp 1,2. Flera lågfart centrifugering steg krävs för att ta bort intakt celler (300-400 x g för 10 min), cellfragment (~ 2 000 x g för 10 min), och apoptotiska organ/stora blåsor (~ 10 000 x g för 10 min). Dessa initiala reningar följs av hög hastighet ultracentrifugering (100000-200000 x g för 1.5-2 h) till sediment EVS. Tvätta steg utförs för att ytterligare säkerställa EV renhet, men detta resulterar i en minskning av antalet isolerade EVS, vilket sänker den totala avkastningen 3,4. Denna metodens nytta begränsas ytterligare av kravet på ett stort antal celler (ca 1 x 108) och en stor provvolym (&Gt; 100 ml) för att uppnå tillräckliga resultat.
För att ta itu med den växande oron har utfällning av vesikler med hydrofila polymerer blivit en användbar teknik under de senaste åren. Polyetylenglykol (PEG), eller andra relaterade nederbörd reagens, gör det möjligt för användaren att dra ner blåsor, virus, och protein eller protein-RNA aggregat i ett prov genom att helt enkelt inkuberar provet med reagens val, följt av en enda låg hastighet centrifugering1,2,5. Vi har tidigare rapporterat att användning av PEG eller relaterade metoder för att fälla ut EVS i jämförelse med traditionell ultracentrifugering resulterar i en betydligt högre avkastning6. Denna strategi är snabb, lätt, inte kräver extra dyr utrustning, är lätt skalbar, och behåller EV struktur. Men på grund av den promiskuösa karaktären hos denna metod, de resulterande proverna innehåller en mängd olika produkter, inklusive fria proteiner, proteinkomplex, en rad EVs, och virioner vilket kräver ytterligare rening för att få önskad population1 ,2,7,8.
För att övervinna heterogenitet av EVS erhålls från olika nederbörd metoder, densitet gradient ultracentrifugering (DG) utnyttjas för att bättre separera partiklar baserat på deras densitet. Denna metod utförs med hjälp av en stegvis gradient med hjälp av en densitet gradient medium, såsom iodixanol eller sackaros, som gör det möjligt för separation av EVs från proteiner, proteinkomplex, och virus eller virusliknande partiklar (VLPs). Det är viktigt att notera att även om det var en gång trodde att DG tillät mer exakt separation av EV subpopulationer, är det nu känt att storlekar och densiteter av olika blåsor kan överlappa varandra. Till exempel, exosomer är kända för att ha flotationdensiteter på 1,08-1,22 g/ml9, medan vesikler isolerade från Golgi (COPI+ eller proteinet+) har densiteter på 1,05-1,12 g/ml och de från endoplasmatiska Retikulum (copii+ ) sediment vid 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Dessutom, om man önskar att jämföra exosomala fraktioner mot fraktioner som innehåller viruspartiklar, detta kan bli svårare beroende på tätheten av viruset av intresse-det finns virus än hiv-1 som sannolikt jämvikt på samma densiteter som exosomalt positiva fraktioner2.
Slutligen, anrikning av EV Preps för nedströms visualisering och funktionella analyser är avgörande för EV forskning. Användningen av EV-berikande nanopartiklar, särskilt multifunktionella hydrogel partiklar som spänner 700-800 nm i diameter, är ett kritiskt steg för att uppnå koncentrerad EV Preps. De besitter en hög affinitet aromatiska bete som inkapslade av en porös yttre siktning skal för att främja selektivitet. De nanopartiklar som används i denna studie omfattar två distinkta preparat med olika kärn beten (reaktiv röd 120 NT80; och Cibacron Blue F3GA NT82) som har visat sig öka fångsten av EVs från olika reagenser och biofluider (se tabellen över material )6,10,11,12,13,14,15. Partiklarna erbjuder enkel anrikning av EVS från många utgångsmaterial inklusive iodixanol fraktioner, cellkultur supernatant, samt patient biofluider såsom plasma, serum, cerebral spinal vätskor (CSF), och urin6,13 .
Den metod som presenteras här förbättrar effektiviteten i nuvarande EV reningsteknik genom att kombinera flera tekniker; EV nederbörd, densitet lutning ultracentrifugation, och partikelavskiljning, att effektivisera arbetsflödet, minska provkraven, och öka avkastningen för att få en mer homogen EV prov för användning i all EV forskning. Denna metod är särskilt användbar i undersökningen av EVs och deras innehåll under virusinfektion eftersom det innehåller ett 0,22 μm filtrerings steg för att utesluta stora, oönskade blåsor och VLPs och separation av den totala EV populationen baserat på densitet för att effektivt isolera EVs från virions.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEM CD4+ Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>117</td>
			<td>CEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca and Mg (1X)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoMAX Opti-Enhancer</td>
			<td>Systems Biosciences</td>
			<td>EXOMAX24A-1</td>
			<td>PEG precipitation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB3</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 infected U937 Cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>165</td>
			<td>U1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter 0.2 &#181;m SFCA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT80)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN1030</td>
			<td>Reactive Red 120 core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrap (NT82)</td>
			<td>Ceres Nanosciences</td>
			<td>CN2010</td>
			<td>Cibacron Blue F3GA core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-980 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250mL</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube, 14x89mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of high yield extracellular vesicle preparations away from virus

En av de största hindren inom området extracellulär vesikel (EV) forskning idag är förmågan att uppnå renade EV preparat i en viral Infection inställning. Den presenterade metoden är tänkt att isolera EVS bort från virioner (dvs hiv-1), vilket möjliggör en högre effektivitet och avkastning jämfört med konventionella ultracentrifugering metoder. Vårt protokoll innehåller tre steg: EV nederbörd, densitet gradient separation och partikel fångst. Nedströms analyser (dvs, Western blot, och PCR) kan köras direkt efter partikel fångst. Denna metod är fördelaktig framför andra isoleringsmetoder (dvs. ultracentrifugation) eftersom det möjliggör användning av minimala startvolymer. Dessutom är det mer användarvänligt än alternativa EV isoleringsmetoder som kräver flera ultracentrifugering steg. Den presenterade metoden är dock begränsad i sin omfattning av funktionella EV-analyser eftersom det är svårt att eluera intakt EVs från våra partiklar. Dessutom är denna metod skräddarsydd för en strikt forskningsbaserad miljö och skulle inte vara kommersiellt gångbar.

PEG nederbörd ökar EV avkastning Vår kombination inställning till EV isolering är betydligt effektivare när det gäller EV återhämtning jämfört med traditionell ultracentrifugation, som framgår av 90% minskning av volymen av startmaterial som krävs. Ultracentrifugation, den nuvarande guldmynt standard i EV isolering, kräver cirka 100 mL av kulturen supernatanten att producera en adekvat EV prep för nedströms analyser, medan vårt nya protokoll kräver en...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus at JoVE.com

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Detta protokoll isolerar extracellulära blåsor (EVs) bort från virioner med hög verkningsgrad och avkastning genom att införliva EV nederbörd, densitet lutning ultracentrifugation, och partikel fångst för att möjliggöra ett förenklat arbetsflöde och en minskning av Start volym krav, vilket resulterar i reproducerbara preparat för användning i all EV forskning.

Rening av högavkastande extracellulära vesikel preparat bort från virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Detta protokoll är betydande eftersom det koncentrerar extracellulära vesicles, EVs, genom en kombination av teknik, samtidigt som det möjliggör separation av virions bort från EVs. Denna metod maximerar EV återhämtning över den nuvarande guldmyntfoten av ultracentrifugering för flera nedströms analys och karakterisering av virus-free EV preps. Detta protokoll är idealiskt för studier av EV: s och virusinfektioner.Denna metod kan anpassas till andra virussystem, såsom HTLV, Ebola, Zika, och mer. Jag förväntar mig en första gången användare av denna metod att kämpa med nanopartikel beredning, så vi rekommenderar noggrant efter våra specifikationer. Viss optimering kan vara nödvändig, beroende på systemet.Visuell demonstration av denna metod är viktigt för att illustrera det övergripande arbetsflödet och nyanser av protokollet, vilket kommer att minska tid och misstag för första gången användare. Börja med att förbereda kultur supernatant från infekterade eller transfekterade celler. Odla cirka 10 milliliter sena loggceller i fem dagar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid, se till att alla medelstora reagenser är fria från extracellulära vesiklar.När odlingen är klar pelletar cellerna genom centrifugeringen vid 3, 000 gånger G i fem minuter och kasta pelleten. Filtrera supernatanten med ett sterilt 0,22 mikrometerfilter och samla filtratet i ett rent rör. Tillsätt en lika stor volym av PEG-reagenser för nederbörd till filtratet, och invertera röret flera gånger för att blanda.Inkubera blandningen vid fyra grader Celsius över natten. Efter inkubationen centrifugera blandningen vid 1500 gånger G i 30 minuter, för att ge en heterogen extracellulär vesikel, eller EV, pellet. Kasta supernatanten och dra upp pelleten på 150 till 300 mikroliter 1X PBS, utan kalcium och magnesium.Håll pelleten på is, samtidigt som du förbereder en densitetsgradient. Förbered iodixanol densitet gradient medium med 11 densitet fraktioner, allt från sex till 18%iodixanol, som beskrivs i manuskriptet. Blanda varje rör genom att vortexa och lager tätheten fraktionerna i en ren och torr svängande hink ultracentrifug rör.Tillsätt den återupphängda EV-pelleten till toppen av den skiktade gradienten och ultracentrifugröret vid 10 000 gånger G och fyra grader Celsius i 90 minuter. Överför försiktigt varje fraktion från ultracentrifugröret till ett nytt mikrocentrifugrör. Förbered en 30%slurry av nanopartiklar för EV-fraktionsberikning, genom att blanda lika stora volymer av NT80, NT82 och 1X-PBS.Vortexa nanopartikelblandningen för att säkerställa homogenitet. Tillsätt 30 mikroliter av uppslamningen till varje densitetsfraktion och blanda genom att antingen pipettera eller invertera rören. Det mest kritiska steget är tillägget av nano-artiklar för att koncentrera EV: s, efter densiteten gradient separation.Utan detta är EV återhämtning dålig. Rotera nanopartikeln som innehåller densitetsfraktioner över natten, vid fyra grader Celsius. Därefter centrifugera densitetsfraktionerna vid 20, 000 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur.Kassera vätskan och tvätta EV-pelleten två gånger med 1X-PBS. För att förbereda pelleten för RNA-isolering, åter upphäva den 50 mikroliter av autoklaverat, avjoniserat vatten, filtrerat och behandlat med depsy, enligt manuskriptriktningarna. RNA kan sedan isoleras, med hjälp av en kommersiell kit.För analys med gelelektrofores, återuppstäng pelleten i 15 mikroliter av Laemmli buffert. Värm provet till 95 grader Celsius i tre minuter. Upprepa värmesteget ytterligare två gånger, virvelning försiktigt och snurra provet ner mellan värmecykler.Centrifugera provet i 15 sekunder vid 20 000 gånger G, och fyll på supernatanten direkt på gelen. För bästa resultat, begränsa mängden partiklar som laddas på gelen, och kör den på 100 volt, för att förhindra att laddade nanopartiklar kommer in i gelen. PEG nederbörd möjliggör betydligt effektivare EV återhämtning, än traditionella ultracentrifugering.Vid användning av 10 milliliter av kultur resulterar detta tillvägagångssätt i en cirka 500 gånger högre avkastning än ultracentrifugeringen. Detta tillvägagångssätt resulterar också i en ökad isoleringseffektivitet av exosomer, vilket är uppenbart genom högre nivåer av exosomen markör proteiner. Western PLA analys visar, en 3000 faldig ökning av CD81, en fyra faldig ökning av CD63 och en 40 faldig ökning av CD9.Vidare, detta protokoll möjliggör nedströms studier av EV medierad mekanismer i HIV1 infektion, genom att isolera EV: s från verions. Västra PLA analys visar att EV: s finns i tre fraktionerna populationer. Medan viruset finns i endast två av dem.EV: s överträdelse 10,8 genom 12 är fria från virus kontaminering. Det viktigaste att komma ihåg är att nanopartiklarna är avgörande för optimal EV-anrikning. Deras tillägg är ett måste.Många nedströms analyser, såsom western blot, PCR, ren diomech analys genom masspektrometri i plattan-baserade cellulära analyser kan utföras. Dessa möjliggör karakterisering, mekanistiska och/eller funktionella studier. Denna teknik möjliggör specifika studier som undersöker EV last och funktionalitet utan att förorena viral bakgrund.Detta ger en grund för att studera EV: s i patogenes och utveckling av potentiella therapeutics. För att övervinna begränsningarna i denna teknik, och att tillämpa EV förberedelse och isolering till stora volymer, rekommenderar vi användning av avancerade system, såsom tangentiellt flöde filtrering. Det farligaste instrumentet att använda är ultracentrifugen, under densitetsgradientseparationen.Se till att alla centrifugrör väger lika mycket, för att undvika obalans och potentiellt rotorfel.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Rening av patogener vakuoler från<em&gt; Legionella</em&gt;-Infekterade Fagocyter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rening av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites för användning i opsoniserande Antibody analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

En effektiv och High Yield Metod för isolering av mus dendritiska cellundergrupper

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Upptäckt och borttagning Nuclease kontamination vid rening av rekombinant prototyp skummande Virus integras

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Utvärdering av extracellulära vesikler funktion under malariainfektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montering och rening av prototyp skummande Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...