Name: detection of retrotransposition activity of hot line-1s by long-distance inverse pcr
Uploaded: 2019-07-27T13:00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR at JoVE.com

Vi vil gerne takke alle vores medforfattere i artiklen, hvor denne metode blev først beskrevet14, især Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara og ESA Pitkänen for værdifulde diskussioner under udviklingen af metoden. L.K. er finansieret af Finlands Akademi (tilskudsnummer 25996, 292789, 306026 og 314394), Sigrid Juselius Foundation og det finske Cancer selskab. B.P. er modtager af universitetet i Helsinki Research Foundation ph. d. Studentship, en finsk Cancer Society afhandling Grant, og en doktor forskning tilskud fra Ida Montinin Säätiö. Vi takker også Teemu Masalin (University of Helsinki) og kul Shrestha fra L.K. forskergruppe for at hjælpe os med video produktion.

Denne forskning blev godkendt af bestyrelsen for institutions revision og det etiske udvalg på Helsinkis Universitets Hospital. Underskrevet informeret samtykke blev indhentet fra emnet for den blodprøve, der anvendes til at påvise denne protokol.
1. design af inverse primere og udvælgelse af begrænsnings enzymer (Bioinformatik)
<ol><li>Bestemmelse af en linje 1-tilknyttet entydig kode<ol>
<li>Download den TTC28-line-1 SEKVENS i fasta format fra en linje-1 database, såsom L1Base17. L1base-ID'ET for TTC28-linje-1 er 135.</li>
		<li>Medtag 5 KB sekvens ledsage både 5 ́ og 3 ́ ender af linjen-1 sekvens og anmærke det i et tekstbehandlingsprogram. Bemærk: her er linje-1 ledsage sekvens kommenteret i brun skrifttype, og linje-1 sekvens er i grå skrifttype (supplerende fil).</li>
		<li>Indtast 1 kb sekvens nedstrøms for udvalgte linje-1's cognate PAS i en PAS forudsigelse værktøj såsom polyadq18 eller Dragon polya spotter19 og annotering alle polyadenylation signal i dette 1 kb vindue. Bemærk: Hvis der ikke er nogen PAS i 1 kb-vinduet, Søg efter PAS i næste 1 kb vindue nedstrøms. TTC28-line-1's egne svage pas er fremhævet i pink og alle de andre pas i 1 kb vindue nedstrøms er fremhævet med rødt (supplerende fil).</li>
		<li>Anmærk sekvensen mellem slutningen af linje-1's cognate PAS og den stærkeste PAS downstream som "Unique tag". Bemærk: "Unique tag" af TTC28-line-1 er fremhævet med gult (supplerende fil).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design af inverse primere<ol>
<li>Design inverse PCR primere ved at indtaste "Unique tag"-sekvensen i et webbaseret primer-design værktøj som primer 3 (http://bioinfo.UT.ee/primer3-0.4.0/) eller ncbi's primer-blast (https://www.NCBI.NLM.NIH.gov/Tools/primer-blast/). Da primer-par designet af disse værktøjer står over for hinanden og letter konventionel PCR, skal du bruge den omvendte komplement funktion for primer pair til at udføre inverse PCR. Bemærk: da linje 1 transducere er stærkt afkortet ved deres 5 ' ende, og størrelsen af den transducerede region er meget variabel, har til formål at holde afstanden mellem de to inverse primere minimal, ved at indstille "PCR produkt længde" parameter i NCBI primer-blast til Minimum. I tilfælde af flere PAS inden for det unikke tag, designe flere primer par, der svarer til forskellige PASs. Design primere tæt på pas, som linje-1 indsættelser initierer fra 3 ́enden af RNA-mellem produktet og 5 ' enden er trinløst afkortet. Her blev tre primer par designet, fremhævet i Teal og grøn, svarende til tre stærke polyadenylations signaler i det unikke tag af TTC28 line-1 (supplerende fil).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valg af begrænsnings enzymer<ol>
<li>Fordøje linjen-1 sekvens sammen med dens 5 KB upstream og downstream flanker i silico ved hjælp af web-baseret værktøj såsom restrictionmapper. Dette vil give en omfattende liste over restriktionsenzymer, der fordøjer denne region, genererer forskellige begrænsnings fragmenter.</li>
		<li>Vælg restriktionsenzymer, der skærer den indfødte locus af linje-1 som følger: ved 5 ' enden, enten opstrøms for LINJEN-1 's 5 ́end eller langt 5 ́enden af LINJEN-1 selv, og ved 3 ' enden, nedstrøms for LINE-1's unikke tag. Bemærk: det valgte restriktionsenzym bør være ufølsomt over for DNA-methylering, bør være varme-inaktiverbar, og bør generere forskudt "klæbrig" ender, der supplerer hinanden. For at demonstrere LDI-PCR anvendes SACi restriktions enzymet, der skærer DNA på gagctc-steder, der er fremhævet her i lysegrøn, (supplerende fil).</li>
		<li>Vær opmærksom på begrænsningen fragment størrelse lavet af udvalgte restriktionsenzymer. Dette bør ikke være længere end 12 KB, da det måske ikke effektivt forstærkes af PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. lave cirkulære DNA-skabeloner til langdistance-inverse PCR
<ol><li>DNA-udvinding og kvalitetsvurdering<ol>
<li>Uddrag genomisk DNA fra prøver (tumor eller blod) ved hjælp af kommercielt tilgængelige DNA ekstraktions kits, der kan udtrække god kvalitet, høj molekylvægt DNA nødvendig for LDI-PCR i henhold til producentens anvisninger. Alternativt kan høj molekylvægt DNA også udvindes af phenol: chloroform20.</li>
		<li>DNA-koncentrationen måles ved hjælp af et fluorometer i henhold til fabrikantens anvisninger, og der køres 100 ng DNA på 1% (w/v) agopstået gel indeholdende ethidium bromid (0,5 μg/mL) i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer ved 4,5 V/cm21 sammen med λ-HindIII DNA molekylvægt markører til at kontrollere DNA-kvalitet og kvantitet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fordøje genomisk DNA<ol>
<li>Lav en nedbrydnings reaktionsblanding (slutvolumen på 50 μL) ved at tilføje 20 enheder SACi restriktionsenzym, 5 μl 10x reaktionsbuffer (tabel over materialer), 100 ng af DNA (op til 44 μL) i et 0,2 ml PCR-rør på is (1 μl restriktionsenzym fra de fleste producenter i s tilstrækkelig til fuldstændigt at fordøje 100 ng af genomisk DNA). Bland opløsningen ved at fslikke røret og centrifugeres kortvarigt.</li>
		<li>Brug en termisk variator til at inkubere reaktionsblandingen ved 37 °c i 1 time efterfulgt af varme inaktivering ved 65 °c i 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selv-ligating den fordøjet genomisk DNA<ol>
<li>Til 50 μl nedbrydnings blanding (efter trin 2.2.2) tilsættes 8 μl 10x T4 DNA-ligasebuffer, 1 μl (5 enheder) T4-DNA-ubiquitinligase og 21 μl ultrarent vand for at fremstille en endelig reaktions volumen på 80 μl. Bland opløsningen ved at svirpe rørene , og centrifugeres kortvarigt.</li>
		<li>Der inkubates i en termisk variator ved 22 °c i 10 minutter, og der afsluttes med et varme inaktiverings trin ved 65 °c i 10 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. langdistance-inverse PCR
<ol><li>Bestemmelse af primer udglødning temperatur ved gradient PCR<ol>
<li>Indstil en udglødnings temperaturgradient på (A-4) °C, (A-2) °C, A, (A + 2) °C, (A + 4) °C, hvor A er den teoretiske udglødnings temperatur for primer-parret beregnet ved hjælp af den kommercielle leverandørs webbaserede værktøj. Bemærk: termiske cyclere fra nogle producenter kan ikke tillade indstilling af temperaturgradient manuelt. I så fald kan den automatiske gradient indstilling anvendes med et temperaturområde på (A-4) °C til (A + 4) °C.</li>
		<li>Forbered en masterblanding til PCR ved at kombinere og blande følgende komponenter i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas: 4 μL 5x reaktionsbuffer, 0,4 μL 10 mM dNTP, 5 μL 2 μM PCR primer (frem og tilbage, designet i trin 1.3.1) , 0,2 μL (0,1 U) af DNA-Polymerase pr. reaktion. Indstil én reaktion for hver udglødnings temperatur i forløbet.</li>
		<li>For hver reaktion, alikvot 19 μl af masterblandingen i 0,2 ml PCR-rør og tilsættes 1 μl (1,25 ng) af cirkulær DNA-skabelon i punkt 2. Bemærk: Brug cirkulær selv-ligeret DNA genereret fra normale blod-DNA som skabelon for at undgå forbrugende potentielt dyrebare tumor DNA for denne optimering trin.</li>
		<li>Kør gradient PCR program på en termisk variator som beskrevet nedenfor: (i) en cyklus på 3 min ved 98 °c (denaturering); II) 35 cyklusser af (10 s ved 98 °C [denaturering], 20 s ved temperaturgradient på [A-4] til [A + 4] °C [annealing] og 1 − 6 min [30 s pr. kilo base af forventet PCR-produkt] ved 72 °C [udvidelse]); III) en cyklus på 10 min. ved 72 °C (endelig forlængelse).</li>
		<li>Kør 6 μl af PCR-produktet i 1% agopstået gel21 fremstillet i 1x Tae buffer ved 4,5 V/cm og analysér PCR-produkterne givet ved forskellige udglødning temperaturer.</li>
		<li>Vælg den udglødnings temperatur, der giver et PCR-produkt, der svarer til den forventede størrelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Påvisning af de Novo linje-1 retrotransponerings aktivitet i tumor genomet<ol>
<li>Udfør LDI-PCR ved hjælp af det inverse PCR-primer-par på cirkulære DNA-skabeloner genereret fra tumorprøver (afsnit 2). Følg samme anvisninger som for gradient PCR (afsnit 3,1), men denne gang erstatter temperaturgradienten med den optimale udglødnings temperatur.</li>
		<li>Analysér PCR-produkterne ved agrose gel elektroforese som udført i trin 3.1.5. PCR-produkt af kendt størrelse eller det "native" PCR-produkt, der svarer til linje 1 på dets oprindelige locus, skal være synligt for hver reaktion. De Novo LINE-1 3 ́ transduktion i tumor prøven er detekterbar som PCR-produkter i forskellige størrelser sammen med det oprindelige PCR-produkt i agrose-gelen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. sekvensering af LDI-PCR-produkter for at afsløre identiteten af mållokaliteter for linje-1 3 ́ transduktion
<ol><li>Udfør enkelt-molekyle lang læsning sekvensering af alle PCR amplikoner genereret i hver LDI-PCR reaktion for at identificere de mål integration sites af disse linje-1 3 ́ transduktionshændelser. Bemærk: kloning og sanger sekvensering af LDI-PCR-produkterne er også en mulig, omend besværlig, tilgang.</li>
	<li>Juster de læsninger, der produceres af et enkelt molekyle Long Read sekventering-platforme, til reference genomet ved hjælp af standard sekvens justerings pipelines. Analysér de justerede læsninger ved hjælp af LDI-PCR-software14 for at identificere de Novo line-1-indsættelser og dens målsites.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome.">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li><li>Brouha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+LINE-1s+account+for+the+bulk+of+retrotransposition+in+the+human+population.">Hot LINE-1s account for the bulk of retrotransposition in the human population.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (9), 5280-5285 (2003).</li><li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+retrotransposons:+a+review.">Restricting retrotransposons: a review.</a> Mobile DNA. 7, 16 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+somatic+retrotransposition+in+human+cancers.">Landscape of somatic retrotransposition in human cancers.</a> Science. 337 (6097), 967-971 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+APC+gene+by+a+retrotransposal+insertion+of+L1+sequence+in+a+colon+cancer.">Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of L1 sequence in a colon cancer.</a> Cancer Research. 52 (3), 643-645 (1992).</li><li>Scott, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hot+L1+retrotransposon+evades+somatic+repression+and+initiates+human+colorectal+cancer.">A hot L1 retrotransposon evades somatic repression and initiates human colorectal cancer.</a> Genome Research. 26 (6), 745-755 (2016).</li><li>Pitkanen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+L1+retrotranspositions+originating+from+TTC28+in+colorectal+cancer.">Frequent L1 retrotranspositions originating from TTC28 in colorectal cancer.</a> Oncotarget. 5 (3), 853-859 (2014).</li><li>Tubio, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+DNA+in+cancer.+Extensive+transduction+of+nonrepetitive+DNA+mediated+by+L1+retrotransposition+in+cancer+genomes.">Mobile DNA in cancer. Extensive transduction of nonrepetitive DNA mediated by L1 retrotransposition in cancer genomes.</a> Science. 345 (6196), 1251343 (2014).</li><li>Badge, R. M., Alisch, R. S., Moran, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATLAS:+a+system+to+selectively+identify+human-specific+L1+insertions.">ATLAS: a system to selectively identify human-specific L1 insertions.</a> American Journal of Human Genetics. 72 (4), 823-838 (2003).</li><li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Nature Medicine. 21 (9), 1060-1064 (2015).</li><li>Ewing, A. D., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+reveals+extensive+variation+in+human-specific+L1+content+in+individual+human+genomes.">High-throughput sequencing reveals extensive variation in human-specific L1 content in individual human genomes.</a> Genome Research. 20 (9), 1262-1270 (2010).</li><li>Sanchez-Luque, F. J., Richardson, S. R., Faulkner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposon+Capture+Sequencing+(RC-Seq):+A+Targeted,+High-Throughput+Approach+to+Resolve+Somatic+L1+Retrotransposition+in+Humans.">Retrotransposon Capture Sequencing (RC-Seq): A Targeted, High-Throughput Approach to Resolve Somatic L1 Retrotransposition in Humans.</a> Methods in Molecular Biology. 1400, 47-77 (2016).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+LINE-1+retrotransposition+in+cortical+neurons+and+non-brain+tissues+of+Rett+patients+and+healthy+individuals.">Somatic LINE-1 retrotransposition in cortical neurons and non-brain tissues of Rett patients and healthy individuals.</a> PLOS Genetics. 15 (4), e1008043 (2019).</li><li>Pradhan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+subclonal+L1+transductions+in+colorectal+cancer+by+long-distance+inverse-PCR+and+Nanopore+sequencing.">Detection of subclonal L1 transductions in colorectal cancer by long-distance inverse-PCR and Nanopore sequencing.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14521 (2017).</li><li>Moran, J. V., DeBerardinis, R. J., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+shuffling+by+L1+retrotransposition.">Exon shuffling by L1 retrotransposition.</a> Science. 283 (5407), 1530-1534 (1999).</li><li>Philippe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+individual+L1+retrotransposon+instances+is+restricted+to+cell-type+dependent+permissive+loci.">Activation of individual L1 retrotransposon instances is restricted to cell-type dependent permissive loci.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Penzkofer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1Base+2:+more+retrotransposition-active+LINE-1s,+more+mammalian+genomes.">L1Base 2: more retrotransposition-active LINE-1s, more mammalian genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D68-D73 (2017).</li><li>Tabaska, J. E., Zhang, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polyadenylation+signals+in+human+DNA+sequences.">Detection of polyadenylation signals in human DNA sequences.</a> Gene. 231 (1-2), 77-86 (1999).</li><li>Kalkatawi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dragon+PolyA+Spotter:+predictor+of+poly(A)+motifs+within+human+genomic+DNA+sequences.">Dragon PolyA Spotter: predictor of poly(A) motifs within human genomic DNA sequences.</a> Bioinformatics. 29 (11), 1484 (2013).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol:chloroform.">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis.">Agarose Gel Electrophoresis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).</li><li>Macfarlane, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction-specific+ATLAS+reveals+a+cohort+of+highly+active+L1+retrotransposons+in+human+populations.">Transduction-specific ATLAS reveals a cohort of highly active L1 retrotransposons in human populations.</a> Human Mutation. 34 (7), 974-985 (2013).</li><li>Beck, C. R., Garcia-Perez, J. L., Badge, R. M., Moran, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE-1+elements+in+structural+variation+and+disease.">LINE-1 elements in structural variation and disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 187-215 (2011).</li><li>Morrish, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+mediated+by+endonuclease-independent+LINE-1+retrotransposition.">DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition.</a> Nature Genetics. 31 (2), 159-165 (2002).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+disease+genes:+large-scale+cloning+and+pathway+predictions.">Leukaemia disease genes: large-scale cloning and pathway predictions.</a> Nature Genetics. 23 (3), 348-353 (1999).</li><li>Pradhan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+screening+of+chromosomal+rearrangements+in+uterine+leiomyomas+by+long-distance+inverse+PCR.">Detection and screening of chromosomal rearrangements in uterine leiomyomas by long-distance inverse PCR.</a> Genes, Chromosomes and Cancer. 55 (3), 215-226 (2016).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Her beskriver vi en metode, der kan bruges til at identificere de Novo line-1 indsættelser stammer fra enhver aktiv linje-1 af interesse. Vi har optimeret denne metode til en meget aktiv linje-1, placeret på 22q 12.1, og tidligere viste det at være meget følsom i påvisning sub-Clonal indsættelse i kolorektal cancer14.
LDI-PCR-succesen afhænger af kvaliteten af genomisk DNA. Derfor har vi inkluderet et ekstra kvalitetskontrol trin for at sikre, at der ved protokollens begyndelse findes højmolekyl vægt-DNA (trin 2.1.2). Vi anbefaler at opbevare genomisk DNA ved-20 °C ved langtidsopbevaring og at tilberede aliquoter for at undgå cyklusser med frysning og optøning. Ved hjælp af genomisk DNA fra blod eller patient-matchede normale væv anbefales stærkt at skelne, om den linje-1 retrotransponering opdaget er en kimcelle eller en somatisk begivenhed. Da cut steder for restriktionsenzymer er stokastiske i genomet, er det muligt, at en bestemt de Novo line-1 indsættelse site måske ikke havn nogen cut steder for restriktions enzymet, der anvendes i dets nærhed. Derfor at øge sandsynligheden for påvisning af størstedelen af de Novo line-1 indsættelser i tumor DNA, mere end ét restriktionsenzym bør anvendes i separate reaktioner til at generere forskellige biblioteker af cirkulære DNA-skabelon. Desuden, hvis den unikke tag af LINJEN-1 af interesse har mere end én PAS, derefter ved hjælp af primer par støder op til hver PAS forbedrer chancerne for at opdage stærkt trunkerede transducinger.
Selv om der findes elegante metoder til Genome-dækkende detektion af de Novo line-1-indsættelser, kan de være overvældende, hvis målet er at afprøve en bestemt linje-1 i en specifik cellekontekst. Til dette formål kan LDI-PCR være en billig og enkel, men robust tilgang til at visualisere linje 1-retrotransponerings hændelser. Den målretningsmetode, der anvendes i denne metode, svarer til TS-ATLAS22. LDI-PCR undgår dog at bruge link-oligonukleotider og kan forstærke både 5 og 3 '-kryds af de Novo line-1-indsætningen samtidigt. Oplysninger om både 5-og 3-vejkryds af linje 1-indsættelse, destinationsstedet for integration, polyA-hale og ændringer på målstedet, som alle er kendetegnende for linje 1-retrogennemførelse, kan opnås ved at koble LDI-PCR med et enkelt molekyle lang læse sekvensering teknologier. Lange læsninger således genereret indeholder den indsatte linje-1 sekvens, dens unikke tag og målsekvenser i en enkelt læse, omgåelse vanskeligheder med kort læsninger i den repetitive region.
Der er to store begrænsninger ved at bruge LDI-PCR til påvisning af linje 1-aktivitet. Den første er iboende til PCR: det kan kun pålideligt forstærke fragmenter op til 10 KB i størrelse. Dette bør overvejes, når der vælges begrænsnings enzym (er), da det oprindelige fragment ikke bør overskride denne grænse. For det andet, denne metode kan kun afsløre retrotransponering begivenheder, der mobiliserer linje-1's 3 ́ ledsage region ved 3 ́ transducinger. Derfor, aktivitet af disse linje-1s, der ikke udviser 3 ́ transduktion vil ikke blive opdaget ved hjælp af denne metode. På trods af at det forstærkes af LDI-PCR, kan nogle linje-1-retrotransponerings hændelser, der (a) genererer et PCR-mål af samme størrelse som "native"-placeringen eller andre retrogennemførelsespositioner eller (b) er sjældne eller subklonale, ikke påvises af agrose gel Elektroforese. Sådanne linje-1-retrotransponerings hændelser kan registreres ved at sekvense LDI-PCR-produktet ved hjælp af et enkelt molekyle lang læse sekvensering af teknologier14.
Arbejdsprocessen, der er beskrevet her, kan let ændres for at registrere aktiviteten af andre "hot" line-1s ved hjælp af et egnet begrænsnings enzym og ved at designe inverse primere, der er målrettet mod disse linje-1s. Ud over påvisning af linje 1-medieret 3 ́-transduktion kan denne metode tilpasses til at detektere mindre hyppige linje 1-medierede 5 ́-transducinger23. Lignende metode er blevet brugt til at identificere integrationen site af LINE-1 reportere i celle-baserede assays24 og proviral integration sites i Cancer25. Udover linje-1 indsættelser, denne metode kan også udnyttes til at opdage andre genomiske aberrationer, såsom DNA rearrangeringer, hvor oplysninger om omorganisering-tilbøjelige region præ-eksisterer26.

Lange spækket nukleare elementer (linje-1s) er en familie af mobile genetiske elementer kaldet retrotransposons, der selvstændigt kan flytte fra et sted til et andet via en Copy-and-paste mekanisme kaldet retrotransponering. Over evolutionær tid, det menneskelige genom har akkumuleret mere end 500.000 kopier af linje-1 gentager1. Men de fleste af de linje 1 eksemplarer, der findes i genomet, er muterede og kan derfor ikke bevæge sig gennem retrogennemførelse; kun ~ 150 kopier har intakt kopi af DNA-sekvens nødvendig for dem at flytte2. I normale somatiske celler er mobiliteten for disse linje-1s begrænset af forskellige værts faktorer3. Disse restriktioner er lettet i forskellige epiteliale tumorer, forårsager linje-1s at være derepresses og resulterer i mange de Novo indsættelser i tumor genom4. Nogle af disse tumor-associerede de Novo indsættelser har vist sig at forårsage af mutagenese i gener, dermed kørsel tumorprogression5,6. Derfor er det vigtigt at være i stand til at kort nye indsættelser i tumor genomet.
Eksisterende metoder til påvisning af de Novo line-1 indsættelser brug (1) hel-genom sekvensering tilgang4,7,8, hvor forskellige beregningsmæssige algoritmer bruges til at finde de Novo line-1 indsættelser fra WGS-data eller (2) næste generations sekvensering, der er rettet mod 3 ' ende af unge, potentielt aktive linje-1s9,10,11,12,13. Men at finde nye indsættelser blandt flere tusinde næsten identiske eksemplarer med disse metoder er langt fra trivielt, og udfordringen forværres yderligere af tumor heterogenitet og genomændringer forbundet med LINE-1 indsættelse4.
Undersøgelser ved hjælp af disse eksisterende metoder viste, at blot et par linje-1s tegner sig for størstedelen af de Novo line-1 indsættelser observeret i tumorer7,8. For at svare på, om en bestemt tumorprøve viser linje 1-aktivitet, er det derfor tilstrækkeligt at kort sætte retrotransponerings hændelser forårsaget af denne håndfuld meget aktive linje-1 loci. I denne artikel beskriver vi en simpel polymerase-kædereaktion (PCR)-baseret metode14 , der kan bruges til at overvåge aktiviteten af en bestemt linje-1 locus i den første intron af TTC28 genet på 22q 12.1, der er meget aktiv i kolorektal cancer 7 , 8. denne linje-1 locus vil blive omtalt som TTC28-line-1 i hele artiklen. Denne analyse identificerer specifikt de Novo line-1-retrotransponerings hændelser, der mobiliserer ikke-gentagne sekvenser på 3-flanken-regionen af kildelinjen-1 ved en mekanisme kaldet 3 ́ transduktion15. 3 ́ transduktion opstår på grund af den svage linje-1 polyadenylations signal (pas), der forårsager transkriptional maskineri til at springe den over og i stedet opsige transkriptionen på den stærkere pas downstream, og dermed fange den ledsage ikke-gentagne sekvens ( herefter benævnt "Unique tag"), som derefter indsættes i målet placering sammen med linje-1 sekvens. Philippe et al.16 viste for nylig, at forskellige celletyper kan udtrykke forskellige linje-1 loci. I lyset af denne konstatering, denne metode kan anvendes til at overvåge aktiviteten af de mest udtrykte linje-1, der mobiliserer deres unikke tag i kræfttype interesse.
Det første trin i LDI-PCR er fordøjelsen af genomisk DNA med et restriktionsenzym, der genererer et Begrænsnings fragment, der indeholder den linje-1, der er analyseret (her, TTC28-line-1) og dens unikke tag (figur 1). Fordøjet DNA er derefter cirkuleret af selv-ligation og PCR forstærket ved hjælp af inverse primere placeret inden for den unikke tag. Ved at gøre det, den fulde længde kildelinje-1 på sin "native" placering er altid forstærket og ved siden af det, afkom linje-1 indsættelser på forskellige Target loci indeholder den unikke tag vil også blive forstærket (figur 1), og dermed rapportering den pågældende linje 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">1 Kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:174px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:166px;">N3232L</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10 mM dNTP</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Used to make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:174px;">BioNordika</td>
			<td style="width:166px;">BN-50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Blood sample (frozen)</td>
			<td style="width:174px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>Blood sample from a healthy individual for control PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ChemiDoc XRS+ System</td>
			<td style="width:174px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:166px;">1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td style="width:174px;">Qiagen</td>
			<td style="width:166px;">69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:174px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:166px;">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">25102-12-9</td>
			<td>Used to make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FastDigest buffer</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FastDigest SacI</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FD1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Generuler 1 Kb plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">SM0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Mini-Sub&#160;Cell GT Cell</td>
			<td style="width:174px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:166px;">1704406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">F537L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:174px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:166px;">1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Quantus Fluorometer</td>
			<td style="width:174px;">Promega</td>
			<td style="width:166px;">E6150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate</td>
			<td style="width:174px;">4titude</td>
			<td style="width:166px;">4ti-0750/TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:174px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">77-86-1</td>
			<td>Used to make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:174px;">Applied Bioscience</td>
			<td style="width:166px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of retrotransposition activity of hot line-1s by long-distance inverse pcr

Lange spækket nukleare elementer 1 (linje-1s) er den eneste familie af mobile genetiske elementer i det menneskelige genom, der kan bevæge sig autonomt. De gør det ved en proces, der kaldes retrogennem førelse, hvori de transskribere til at danne en mRNA-mellemprodukt, som derefter indsættes i genomet ved omvendt transskription. På trods af at være tavs i normale celler, linje-1s er meget aktive i forskellige epiteliale tumorer. De Novo LINE-1 indsættelser kan potentielt drive tumorigenesis, og derfor er det vigtigt at systematisk studere linje-1 retrotransponering i kræft. Ud af ~ 150 retrotransponering-kompetent linje-1s til stede i det menneskelige genom, kun en håndfuld af linje-1 loci, også omtalt som "hot" linje-1s, tegner sig for størstedelen af de Novo line-1 indsættelse i forskellige kræfttyper. Vi har udviklet en simpel polymerase kædereaktion (PCR)-baseret metode til at overvåge retrotransponering aktivitet af disse hot LINE-1s. Denne metode, baseret på langdistance-inverse (LDI)-PCR, udnytter 3 ' transduktion, en mekanisme, hvormed en linje-1 mobiliserer sin ledsage ikke-repetitive region, som efterfølgende kan bruges til at identificere de Novo line-1 3 ́ transduktionshændelser stammer fra en bestemt varm linje-1.

I tilfælde af TTC28-line-1, der er mere end én pas inden for en 1 kb vindue nedstrøms for sin cognate pas, derfor regionen mellem TTC28-line-1 pas og stærkeste pas på 811 BP downstream blev betragtet som den unikke tag for TTC28-line-1. Tre inverse PCR-primer-par blev designet på dette unikke tag, der svarer til forskellige PASs present14. Vi valgte tre restriktionsenzymer: (i) NSIi, der skærer 5 ́ upstream af TTC28-line-1 og 3 ́ uden for det unikke tag, og (II) SACi og (III) PSTi, der skærer 5 ́ inden for linjen-1 i sin langt 5 ' ende, og 3 ́ uden for det unikke tag. Disse genererer begrænsnings fragmenter af henholdsvis 10.288 BP, 5.699 BP og 6.305 BP.
For at demonstrere denne metode udførte vi LDI-PCR på DNA udvundet fra MCF7 cellelinje. Denne brystkræft cellelinje er tidligere blevet rapporteret til at vise TTC28-line-1 aktivitet16. For nemheds skyld lavede vi en cirkulær DNA-skabelon ved hjælp af et restriktionsenzym, SACI, ud af tre og udførte en LDI-PCR ved hjælp af et primer-par ud af tre (tabel 1) for at detektere de Novo line-1-indsættelser, der stammer fra TTC28- LINJE-1.
God kvalitet af DNA udvundet fra MCF7 cellelinje blev sikret ved agrose gel elektroforese (figur 2). Intakt høj molekylvægt DNA viser, at genomisk DNA er af optimal kvalitet til denne analyse. Hvis en smøre er synlig i stedet, dette indikerer dårlig kvalitet af den ekstraherede DNA, som igen vil hæmme downstream procedurer.
Figur 3 viser et repræsentativt resultat af et GRADUERINGS PCR-eksperiment, der tager sigte på at bestemme den optimale udglødnings temperatur for TTC28-line-1 inverse primer-parret. Blod genomisk DNA fordøjet med SACi, efterfulgt af selv-ligation at danne en cirkulær DNA-skabelon, blev brugt til denne reaktion. Et meget specifikt PCR-produkt af forventet størrelse (5.649 BP) ved 62, 64 og 66 °C viser, at den optimale udglødnings temperatur for dette primer-par ligger inden for intervallet 62 − 66 °C.
Vi genererede en cirkulær DNA-skabelon ved at fordøje MCF7 genomisk DNA med SACi restriktions enzymet efterfulgt af selv ligering. Figur 4 viser, at TTC28-line-1 3 ́ transduktion forekommer i MCF7 cellelinjer: de Novo indsættelser kan DETEKTERES som LDI-PCR produkter af varierende størrelser sammen med en Native PCR produkt af kendte størrelse (5.649 BP). For at identificere genomkoordinaterne for de Novo målstederne kan PCR amplikoner sorteres (Se protokol afsnit 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59880/59880fig1.jpg"> Figur 1 : Oversigt over LDI-PCR til påvisning af linje-1 3 ́ transduktion. En cirkulær DNA-skabelon genereres ved først at fordøje (I) det med en restriktion enzym og selv-ligating (II) det. Dette trin efterfølges af inverse PCR (III) med inverse PCR-primere, der er målrettet mod den entydige kode for linje 1 af interesse (sekvens mellem linje-1's egne svagere pas, i pink og stærkere pas nedstrøms, i rødt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/59880fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59880/59880fig2.jpg"> Figur 2 : Kvalitetsvurdering af UDVUNDET DNA. 100 ng af DNA ekstraheret fra MCF7 cellelinje og blod fra en normal person, som vil blive anvendt som en kontrolprøve, blev kørt sammen med 1 μL og 2 μL λ DNA/HindIII markør mærket som M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/59880fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59880/59880fig3.jpg"> Figur 3 : Gradient PCR til bestemmelse af optimal udglødnings temperatur for inverse PCR-primere (tabel 1). LDI-PCR med inverse primer-par ved udglødnings temperatur fra 56 til 66 °C viser et særskilt PCR-produkt ved 62 − 66 °C. Grøn pil angiver den valgte udglødnings temperatur til fremtidige eksperimenter. Cirkulær DNA skabelon genereret ved at fordøje blod genomisk DNA fra en normal person med SACjeg efterfulgt af selv-ligation blev brugt til denne optimering trin. M, markør (1 kb plus DNA-stigen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/59880fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59880/59880fig4.jpg"> Figur 4 : LDI-PCR for at identificere linje-1 3 ́ transduktion som følge TTC28 -Line-1. Cirkulære DNA-skabeloner genereret ved at fordøje MCF7 og blod (fra normal individ) genomisk DNA med SACi efterfulgt af selv ligation blev forstærket af inverse primere i optimal udglødnings temperatur. "Native" PCR produkt, mærket med Asterisk, af forventet størrelse (5.649 BP) blev påvist i både MCF7 DNA og normal blod DNA, mens MCF7 også produceret yderligere PCR produkter af varierende størrelser, hvilket indikerer de Novo linje-1 retrotransponering. M, markør (1 kb DNA-stige). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/59880fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer-navn</td>
			<td>Sekvens (5 ́ → 3 ́)</td>
		</tr>
<tr>
<td>L1_001 (rev)</td>
			<td>TTCACTAAGCATGTATGTGGAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>L1_002 (FWD)</td>
			<td>CCCAAAATATACCCAATTACTGGCA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: invers PCR primer-par, der er designet til det unikke tag TTC28 -Line-1 14 .
Supplerende fil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/Supplemental_File_revised.docx" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR at JoVE.com

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

Denne artikel skitserer en simpel PCR-baseret analyse til at overvåge aktiviteten af en aktiv linje-1 retroomsætning og til at kort de Novo retrogennem førelser i et givent genom. Ved hjælp af MCF7 Cell line, viser vi heri, hvordan denne metode kan anvendes til at detektere aktivitet af en linje-1 placeret på 22q 12.1.

Påvisning af tilbagevirkende aktivitet af Hot LINE-1s ved lang distance-inverse PCR

Long interspersed nuclear elements 1 (LINE-1s) are the only family of mobile genetic elements in the human genome that can move autonomously. They do so ...

Denne metode kan registrere aktiviteten af retrotranspositioner kaldet LINE-1s. Disse mobile genetiske elementer forårsager de novo indsættelser i kræftgenomer og dermed bidrage til genomisk ustabilitet. Fordelen ved denne PCR-baserede teknik er, at den er enkel og omkostningseffektiv sammenlignet med sekventeringsmetoder med høj overførselshastighed.Vi demonstrerer her sin nytte i at opdage de novo insertions, der stammer fra en LINE-1 inde i TTC28 genet på humant kromosom 22. LINE-1 aktivitet kan tjene som biomarkør for malignitet eller præ-malignitet især i epiteltumor typer, ligesom tyktarmskræft eller høj kvalitet serøs kræft i æggestokkene. Udover LINE-1 indsættelser, kan denne metode opdage andre genomiske afvigelser, såsom DNA rearrangements, der altid har brug for omlægning af en grund.For at vælge en passende begrænsning enzym, og til at designe inverse primere, Først, downloade TTC28 LINE-1 sekvens i FASTA format fra en LINE-1 database, såsom L1Base. L1Base-id'et for TTC28 Line-1 er 135. Medtag fem kilobaser sekvens, flankerende både fem prime og tre prime, slutningen af Line-1 sekvens.Eksporter sekvensen til et tekstbehandlingsprogram. Her er Line-1-flankeringssekvensen kommenteret med brun skrifttype og Line-1-sekvenser med grå skrifttype. At bestemme den unikke tag i en kilobase sekvens nedstrøms for TTC28 Line-1's tre prime og ind i en af de polyadenylation signal forudsigelse værktøjer, såsom Polyadq eller Dragon PolyA Spotter.Anmærk alt polyadenylation signal i denne ene kilobase vindue. Sekvensen mellem TTC28 LINE-1's eget svage polyadenylationssignal fremhævet her i pink og det stærkeste polyadenylationssignal nedstrøms er det unikke tag af denne LINE-1 fremhævet her i gult. Hvis du vil designe inverse PCR-primere, skal du indtaste den unikke tagsekvens i et webbaseret primerdesignværktøj, som NCBI's Primer-BLAST, der genererer specifikke PCR-primere, skal du holde produktlængdeparameteren minimum for at vise, at primerpar er tæt på hinanden.Vælg den relevante genomdatabase. Da produktionen af Primer Blast genererer konventionelle PCR-primere, der vender mod hinanden, skal du bruge den omvendte komplementfunktion til primer-parret til at udføre omvendt PCR. Inter-design primere, svarende til øst polyadenylation signal, når det er muligt.Vi har deigned tre primer par, fremhævet i krikand og grøn, svarende til tre stærke polyadenylation signal i den unikke tag af TTC28 LINE-1. Dernæst for at vælge et egnet restriktionsenzym, fordøje LINE-1-sekvensen sammen med sine fem kilobase opstrøms og nedstrøms flanker i silica ved hjælp af webbaserede værktøjer, såsom RestrictionMapper. Dette vil give en omfattende liste over begrænsning enzymer, der fordøjer denne grund, genererer forskellige begrænsning fragmenter.Vælg restriktionsenzymer, der laver en fem prime cut upstream af LINE-1's fem prime end eller mod de fem primære ende af LINE-1, hvis det er inden for LINE-1 selv. Og en tre prime kort nedstrøms op fra den unikke tag. Den oprindelige begrænsning fragment med LINE-1 sekvens og dens unikke tag lavet af selektive begrænsning enzymer, bør ikke være længere end 12 kilobaser, da det måske ikke forstærkes af PCR effektivt.Bemærk, at de selektive begrænsningsenzymer vil være ufølsomme over for DNA-methylering, bør være varmeinaktiverede og bør generere klæbrige ender, der supplerer hinanden. For at demonstrere langdistance inverse PCR, vil vi bruge SacI begrænsning enzym, der skærer DNA på DAZCTC steder fremhævet her i lysegrøn. SacI opfylder alle kriterierne på TTC28 LINE-1 locus og genererer en indfødt begrænsning fragment af 5, 700 base par.Uddrag genomisk DNA fra prøver ved hjælp af kommercielt tilgængelige DNA ekstraktion kit, der er i stand til at udtrække god kvalitet, høj molekylær DNA er nødvendige for langdistance inverse PCR. Her har vi udvundet genomisk DNA fra MCF7 brystkræft cellelinje og normalt menneskeblod ved hjælp af fremstilling instruktion. Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et fluorometer.100 hundrede nanogram DNA på en person agarose gel sammen med en DNA molekylvægt markør for at kontrollere DNA-kvalitet og kvantitet. For at lave cirkulære DNA skabeloner, første fordøje DNA med passende begrænsning enzym. Her bruger vi SacI til at fordøje MCF7 og blodgenomisk DNA Lav en fordøjelsesreaktion mix i henhold til tekstprotokollen.Opløsningen blandes ved at svippe røret og centrifuge kort. Inkuber reaktionsblandingen ved 37 grader Celsius i en time efterfulgt af varmeinaktivering, som pr. producentens instruktion. Dernæst lave en ligation reaktion master mix løsning i henhold til teksten protokol til selv-ligate den fordøjede DNA.For hver reaktion tilsættes 30 mikroliter af denne ligationsreaktionsmasterblanding direkte til 50 mikroliter af fordøjet DNA-opløsning fra det foregående trin. Opløsningen blandes ved at svippe røret og centrifuge røret kortvarigt. Inkuber denne reaktion mix i en termisk cycler ved 22 grader Celsius i 10 minutter, efterbehandling med en varme inaktivering trin ved 60 grader Celsius i yderligere 10 minutter.Denne cirkulære DNA-skabelon vil blive brugt i efterfølgende omvendt PCR-trin. Indstil en glødende temperaturgradient i en termisk cycler for at bestemme den optimale primer-glødetemperatur ved hjælp af gradient PCR. Forbered en master mix til PCR ved at kombinere og blande alle komponenter i henhold til tekstprotokollen.Opsæt én reaktion for hver glødetemperatur i gradienten. For hver reaktion, tildele 19 mikroliter af master mix PCR rør og tilsæt en mikroliter af cirkulær DNA-skabelon, genereret fra blod genomisk DNA. Kør forløbs-PCR-programmet.Kør seks mikroliter af PCR produkt, varme det ved forskellige glødende temperatur i ét kursus i agarose gel. For at detektere de novo TTC28 LINE-1 retrotransposition aktivitet i genomet af MCF7 cellelinje, udføre PCR ved hjælp af omvendt primer par på cirkulære DNA skabeloner, genereret fra MCF-7 cellelinje. Følg samme instruktioner som for gradient PCR, men denne gang udskiftning af temperaturgradient med optimal glødetemperatur, som er 64 grader Celsius.Analysér de omvendte pcr-produkter med agarosegel for resultaterne. Denne agarose gel billede taget efter en elektrofokroser viser genomisk DNA udvundet fra MCF7 og blodprøver har høj molekylvægt, hvilket gør det egnet til langdistance inverse PCR. Dette agarose gel billede taget efter elektrofober viser, at det omvendte primer par, som vi har designet forstærker den korrekte cirkulære skabelon ved alle glødende temperaturer i gradienten som observeret ved intens span mellem 5 kilobase og syv kilobase DNA markør.Men, forskellige bånd er også observeret ved lavere temperaturer, hvilket indikerer dårlig primer specificitet og dårlig glødende temperaturer. Således, for denne primer par, 64 grader Celsius er den optimale glødende temperatur. Dette agarose gel billede viser PCR produkt opnået efter at have udført langdistance inverse PCR på DNA udvundet fra MCF7 cellelinje og normalt blod.Et PCF-produkt på 5.700 basispar, der er markeret med en stjerne, repræsenterer den oprindelige PCR svarende til Linje 1 på sit oprindelige sted. Dette oprindelige PCR-produkt er synligt i både MCF7 og normalt blod-DNA. De novo LINE-1 retrotransposition og MCF7 genom kan påvises som PCR produkt af forskellige størrelser, sammen med indfødte PCR produkt i agarose gel.Sekvensering af det omvendte PCR-produkt på lang afstand ved hjælp af enkelt-molekylære langlæsede sekvenseringsteknologier kan gøre det muligt at identificere målidentifikation i en nuklear stram opløsning. Selv om en besværlig tilgang, kloning og sanger sekventering af langdistance inverse PCR produkt er også muligt. I denne video blev aktiviteten af en LINE-1 på kromosom 22 opdaget.Den samme arbejdsgang kan tilpasses til at overvåge andre LINE-1s, der er aktive i forskellige tumortyper.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Påvisning af sjældne mutationer i CtDNA ved hjælp af næste Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum og Plasma kopi nummer påvisning ved hjælp af Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Påvisning af en CDH1 sjældne udskrift Variant i frisk frosset gastrisk kræft væv af Chip-baserede digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Høj-følsomhed påvisning af Micrometastases genereret af normal god landbrugspraksis Lentivirus-transduced Organoids kulturperler fra en Patient-afledte tyktarmen tumoren

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potensering af Anticancer antistof effektivitet af antineoplastiske stoffer: påvisning af antistof-drug synergi med kombination indeks ligning

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Påvisning af Protease aktivitet af fluorescerende peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Evaluering af kolorektal cancer risiko og prævalens ved afføring DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Påvisning og overvågning af tumor associeret cirkulerende DNA i patientens Biofluider

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Onkogen Genfusions detektering ved hjælp af forankret multiplex Polymerasekæde reaktion efterfulgt af næste generations sekvensering

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...