Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة التعليم (2018R1A6A3A01011832)، من قبل وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (NRF-2016M3C1A6936606) ومن قبل وزارة التجارة والصناعة والطاقة (10068076).

وقد وافقت اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية الحيوانات واستخدامها على جميع البروتوكولات التجريبية.
1. إعداد الحلول
<ol><li>إعداد واحد خلايا القلب معزولة حديثا11. ملاحظة: قد يكون لكل مختبر حل تخزين خلية مختلفة. هنا، يتم تخزين الخلايا العضلية في وسط الثقافة (DMEM).</li>
	<li>?...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

وقد تم تطوير طريقة تصحيح التداخل بنجاح لقياس إشارات NADH وfura-2 التناظرية. القياس الدقيق للإشارات ضروري للتصحيح الدقيق. ومع ذلك، فإن الطبيعة المتأصلة في جهاز الفلورسنت تنتج إشارة خلفية لا علاقة لها بإشارة NADH من fura-2. يمكن لفلتر تمرير النطاق الأعلى جودة تمرير ما يصل إلى 10−8 فقط من الأطوال ...

ومن المعروف على نطاق واسع الدور الهام للداخل الخلايا كاليفورنيا2 + 1. القياس الكمي لـ [Ca2+] ضروري لفهم عمليات الوظائف الفسيولوجية الخلوية. Fura-2 النظير مفيدة جدا لأنها متحمسة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (<400 نانومتر)، ويمكن تطبيق طريقة قياس النسب للقياس الكمي. لذلك، يمكن قياس المعلمات الفسيولوجية الأخرى مثل درجة الحموضة، وإمكانات الغشاء، وما إلى ذلك، مع الأصباغ الفلورية الأخرى. ويقال إن نطاق تركيز الميتوكوندرياCa2+ ([Ca2+]m)كان 0.08−20 μM2و3و4و5. بين fura-2 النظير، fura-2-FF هو مناسب لقياس هذا النطاق من [Ca2+]. ومع ذلك، تحتوي الخلايا الحية للأسف NADH / NADPH لعملياتها الأيضية، وNADH يولد تداخل إشارة بسبب الإثارة المتداخلة وأطياف الانبعاثات مع التناظرية fura-2. هذا التداخل يحد إلى حد كبير من استخدام النظير fura-2. على وجه التحديد، إذا تم تطبيق التناظرية لقياس الميتوكوندريا [كاليفورنيا2+] ، وهذا التدخل هو أكبر عقبة لأن أعلى كمية من NADH هو في الميتوكوندريا. ومما يزيد من تعقيد هذا الأمر التغيرات التي تحدثها NADH المرتبطة بإمكانية غشاء الميتوكوندريا(م)ويؤثر تغيير M [Ca2+] م6و7و8 , 9.وعلاوة على ذلك، لدراسة [Ca2+]م ديناميات، فمن الضروري أن نعرف حالة المعلمات الميتوكوندريا الأخرى، مثل NADH،م،والرقم الهيدروجيني.
الانبعاثات في 450 نانومتر و 500 نانومتر مع الإثارة في 353 نانومتر, 361 نانومتر, و 400 نانومتر تحتوي على إشارات من NADH وfura-2-FF, والمعادلات هي كما يلي. هنا, 353 نانومتر و 361 نانومتر هي النقاط isosbestic من fura-2-FF للانبعاثات في 450 نانومتر و500 نانومتر, على التوالي.
F361,450 = F361,450,NADH + F361,450,Fura Equation 1 F353,500 = F353,500,NADH + F353,500,Fura Equation 2 F400,500 = F400,500,NADH + F400,500,Fura Equation 3
حيث Fx,y هو كثافة الانبعاثات المقاسة في y-nm بواسطة x-nm الإثارة، Fx،y، NADH يمثل كثافة الانبعاثات المعتمدة على NADH نقية، وFx،y، Fura يمثل كثافة الانبعاثات النقية fura-2-FF-تعتمد على. تحت نفس التركيز من صبغة الفلورسنت، ينبغي أن تنتج كثافة الإثارة معينة نفس كثافة الانبعاثات. ولذلك، ينبغي أن تكون نسبة كثافة الانبعاثات لاثنين من الأطوال الموجية المختلفة ثابتة. Ca2+ وfura-2 لم يؤثر على خصائص الفلورة NADH; ولذلك، فإن نسبة الانبعاثات عند 450 نانومتر و500 نانومتر من NADH كانت ثابتة في أي موجة إثارة. ويمكن استخدام نفس القاعدة لfura-2-FF على أساس افتراض أن NADH أو [Ca2+] لا يؤثر على الأطياف الانبعاثات والإثارة من fura-2-FF. ومع ذلك، تسبب Ca2+ في تحول طيفي لانبعاث الفوا-2-FF. لذلك، لإزالة تأثير Ca2+، الإثارة isosbestic، وهو مستقل عن Ca2+، يحتاج إلى استخدامها. كل موجة الانبعاثات (أي، 450 نانومتر و 500 نانومتر) لديه نقطة isosbestic مختلفة، ومن الإعداد التجريبي لدينا، 353 نانومتر في 500 نانومتر و 361 نانومتر في 450 نانومتر تم اختيار. من هذه المعادلات التالية صالحة10.
Rf = F361,450,Fura/F353,500,Fura Equation 4 RN1 = F400,500,NADH/F361,450,NADH Equation 5 RN2 = F353,500,NADH/F361,450,NADH Equation 6
مع هذه الثوابت، المعادلات التالية من (المعادلة 1) (المعادلة 2) و (المعادلة 3) صالحة.
F361,450 = F361,450,NADH + Rf × F353,500,Fura Equation 7 F353,450 = RN2 × F361,450,NADH + F353,500,Fura Equation 8 F400,500 = RN1 × F361,450,NADH + F400,500,Fura Equation 9
من هذه المعادلات، إذا كان Rf،RN1،و RN2 معروفة، يمكن الحصول على إشارات نقية من NADH وfura-2 على النحو التالي.
F361,450,NADH = (F361,450 - Rf × F353,500)/(1− Rf × RN2)المعادلة 10 F353,500,Fura = (RN2 × F361,450 − F353,500)/(Rf × RN2 − 1) المعادلة 11 F400,500,Fura = F400,500 − RN1 × F361,450,NADH Equation 12 RFura = F353,500,Fura/F400,500,Fura Equation 13
كان شكل Ca2+من المنضم من fura-2-FF غير فلورسنت عمليا ً في الطول الموجي للإثارة 400 نانومتر. استناداً إلى هذه الخاصية، يمكن اشتقاق معادلة المعايرة الجديدة التالية.
[Ca2+] = Kd ∙ (F400,500,max/F353,500,max)× (RFura − Rmin)Equation 14
حيث Kd هو ثابت التفكك، F400،500، ماكس و F353،500، كحد أقصى هي القيم القصوى للإشارات المنبعثة في 500 نانومتر مع الإثارة في 400 نانومتر و 353 نانومتر، على التوالي، وRدقيقة هو الحد الأدنى RFura في كاليفورنيا2 +خالية من الشرط. بما أنّ الإثارة [إسوسبستيك] كان استعملت, المعادلة يستطيع كنت بسّطت أبعد [أس فولّووس].
[Ca2+] = Kd ∙ (1/ Rmin)∙ (RFura − Rmin)المعادلة 15
لذلك، يجب فقط قيمالحد الأدنى Kd و R لحساب [Ca2+].

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

ولقياس [Ca2+] كمياً، كثيراً ما تُستخدم النظائر fura-2، التي هي مركبات فلورية قياسية النسبية. ومع ذلك، فإن استخدام الصبغة محدود في جوهره في الخلايا الحية بسبب تداخل الفلورة الذاتية، وذلك أساسا من نيكوتيناميد الدينوكليوتيد (NADH). وبشكل أكثر تحديدا، وهذا هو عقبة رئيسية عند قياس الميتوكوندريا [كاليفورنيا2 +] كميا باستخدام النظير fura-2 لأن غالبية NADH في الميتوكوندريا. إذا كان تركيز صبغة الفلورسنت هو نفسه، يجب أن تنتج كثافة الإثارة معينة نفس كثافة الانبعاثات. ولذلك، ينبغي أن تكون نسبة كثافة الانبعاثات لاثنين من الأطوال الموجية المختلفة ثابتة. وبناء على هذا المبدأ، تم تطوير طريقة تصحيح جديدة على الإنترنت لتداخل إشارة NADH لقياس [Ca2+] ويمكن الحصول على كثافة الإشارة الحقيقية لNADH وfura-2. وعلاوة على ذلك، تم تطوير معادلة جديدة لحساب [Ca2+] مع الإثارة isosbestic أو الإثارة في 400 نانومتر. مع هذه الطريقة، يمكن قياس التغييرات في الميتوكوندريا [Ca2+] بنجاح. وبالإضافة إلى ذلك، مع مجموعة مختلفة من الإثارة والموجات الموجية للانبعاثات، يمكن قياس معلمات متعددة، بما في ذلك NADH، [Ca2+] وإمكانية وجود غشاء الميتوكوندريا(M)في وقت واحد. تم قياس الميتوكوندريا [Ca2+]وM أو الرقم الهيدروجيني باستخدام fura-2-FF وtetramethylrhodamine إيثيل إستر (TMRE) أو كاربوكسي-seminaphtorhodafluor-1 (كاربوكسي-SNARF-1).

الميتوكوندريا Ca2+ التغييرات بسبب تصحيح10 ويبين الشكل 4 التغييرات في [Ca2+]م قبل التصحيح وبعده. وأظهرت النتائج بوضوح التغييرات الكبيرة في [كاليفورنيا2+]م. كان تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا يستريح دون Ca السيتوسول2+ Ca([2+]ج)1.03 ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

ونظراً للتداخل الطيفي لموجات الإثارة والانبعاثات لنظائر NADH وfura-2، فإن تداخل الإشارة من كلتا الكيميائيتين في الخلايا الحية أمر لا مفر منه أثناء القياس الكمي [Ca2+]. وهكذا، تم تطوير طريقة تصحيح جديدة عبر الإنترنت لتداخل إشارة NADH لقياس [Ca2+] .

رواية نيكوتيناميد الدينين الدينوكليوتيد طريقة تصحيح لقياس Ca2 + داخل الخلايا مع Fura-2-التناظرية في الخلايا الحية

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

الأشعة فوق البنفسجية المجسات الجمع، لديها تلوث إشارة متأصلة، وذلك بسبب الأصوات الجمع التلقائي. معظم المشكلة مع NADH، هو الحد من استخدام مسبار الجمع. ويمكن استخدام طريقة، لتصحيح دقيق للفلوريس الخارجي من NADH، من أجل استخراج صحيح، غير مُلَكّع إشارة مسبار الجمع.إثبات الإجراء سيكون جيونغ هون لي، أستاذ أبحاثنا المساعد من مختبري. بعد السماح myocytes لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب ، وpirnatate عظمى. تسمية الخلايا مع مليلترين من الطازجة أعدت واحد ملليمتر fura-2-FFAM تخفيف حل لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية.في نهاية الحضانة، ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وضع مستقيم قبل إزالة المابير. ثم إضافة أربعة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة ثقافة المتوسطة للتخزين في درجة حرارة الغرفة. في الموقع isobestic الفورا-2-Ffa نقطة تحديد جبل الخلايا المخففة على مرحلة المجهر والانتظار ثلاث دقائق للخلايا لتغرق إلى أسفل.افراط NADH خالية من 37 درجة مئوية خالية من الكالسيوم حل في الخلية ثقافة وتحديد خلية الهدف. محلول سابونين الزفير لمدة 60 ثانية قبل إعادة الإفراط مع محلول خالي من الكالسيوم الخالي من الكالسيوم من NADH. في وقت واحد قياس الإشارات المنبعثة من فورا-2-ff في 450 و 500 نانومتر، وذلك باستخدام مسح استثارة من 350 إلى 365 نانومتر مع خطوة 0.1 نانومتر وإعادة إسراف مع محلول خالية من الكالسيوم NADH.طرح التالي الإشارات في محلول الكالسيوم المشبعة من الإشارات في ظروف خالية من الكالسيوم. ثم حساب الانحرافات المعيارية للانبعاثات عند كل استثارة وتحديد الطول الموجي الإثارة تبين الحد الأدنى من قيم الانحراف المعياري كنقاط اسكوبية فردية. لاستخدام نظام قياس متعدد الباراتترية للكشف عن إشارة الخلفية وتصحيح الإشارة داخل منطقة الخلية ، قم بتركيب خلايا خالية من الصبغة في حمام المجهر والسماح للخلايا بالاستقرار لمدة ثلاث دقائق.وافرت ناده حل خالي من الكالسيوم في الحمام لمدة خمس دقائق بمعدل 2-3 ملليلتر في الدقيقة، وتعيين حقل الكائن لتغطية الخلية المستهدفة. بعد نقل الخلية من حقل قياس إشارات الخلفية من نافذة خالية من الخلايا وتعيين إشارات كما الإزاحات. ثم ارجع الخلية إلى الموضع الأولي وقم بقياس إشارات خلفية الخلية ومنطقة الخلية.لحساب عامل R استخدام خلفية الخلية المكتسبة وإشارات المنطقة قبل إعادة تركيب الخلايا الخالية من الصبغة على المجهر والاستفادة مع محلول خال من الكالسيوم. قياس الإشارات كما هو مبين قبل الإسراف في تعليق الخلية مع حل malate. بعد قياس الإشارات بغزارة الخلايا مع محلول بيروفات تليها وفرة مع محلول malate-بيروفات ومحلول الروتينون.ثم حساب الميل لكل إشارة. هنا تظهر التغيرات في الكالسيوم الميتوكوندريا قبل وبعد التصحيح. النتائج تكشف بوضوح عن تغييرات كبيرة في الكالسيوم الميتوكوندريا مع تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا يستريح دون الكالسيوم السيتوسولي من 1.03 زائد أو ناقص 0.13 ميكرومولار والحد الأقصى للكالسيوم الميتوكوندريا في واحد ميكرومولار من الكالسيوم 29.6 زائد أو ناقص 1.61 ميكرومولار.تم رصد إمكانات عبر الميكوندرية مع وفرة من اثنين من نانومولار TMRE. تم حساب التغير في إمكانات الميتوكوندريا على أساس احتمال غشاء ميتوكوندريا أولي مفترض من ناقص 150 ملليفولت، مما يدل على انخفاض في NADH استجابة لإضافة الكالسيوم، مع تأثير سلبي على إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لم يتأثر الجسم بالضمر الميتوكوندري بسبب الزيادة في الكالسيوم الميتوكوندريا الناجم عن تحميل الكاربوكسي SNARF-1.نقاط isobestic غير صحيحة ينتج تصحيح R و NADH غير صحيحة. لذا عليك أن تأخذ الحرص على قياس دائما بشكل صحيح في الخلفية خالية من الخلية ومنطقة الخلية. وتستخدم هذه التقنية في إعداد دراسات الكالسيوم الميتوكوندريا الديناميكية في الانسكابات البيولوجية.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing : طريقة بسيطة لالتنميط الجيني دقيقة

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

قياس الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

الكشف عن التعبير الجيني بين الخلايا في الخلايا الحية من الفئران، الإنسان ولحم الخنزير المنشأ عن طريق النانوية المسمى الإسفار

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...