Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af grundlæggende videnskabelige forsknings program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for uddannelse (2018R1A6A3A01011832), af Ministeriet for videnskab, IKT & fremtidig planlægning (NRF-2016M3C1A6936606) og af Ministeriet for handel, industri & energi (10068076).

Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af den lokale institutions Komité for dyrepasning og-anvendelse.
1. klargøring af opløsningen
<ol><li>Forbered enkelt frisk isoleret hjertemyocytter11. Bemærk: hvert laboratorium kan have en anden celle opbevaringsløsning. Her lagres myocytterne i kulturmediet (DMEM).</li>
	<li>Forbered 100 mL ca2 +-fri opløsning (tabel 1).</li>
	<li>Forbered 50 mL dyrkningsmedium i et 50 mL bægerglas. Aliquo...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

Den interferens korrektion metode blev udviklet med succes til måling af signaler af NADH og Fura-2 analoger. Nøjagtig måling af signalerne er afgørende for nøjagtig korrektion. Men den iboende karakter af den fluorescerende anordning producerer et baggrunds signal uden forbindelse med NADH af Fura-2. Den højeste kvalitet band-pass filter kan kun passere op til 10− 8 af de uønskede bølgelængder af lyset. Men det fluorescerende signal fra en enkelt celle er meget lille, og refleksionen af excitation ...

Den væsentlige rolle intracellulære ca2 + er almindeligt kendt1. Kvantificeringen af [ca2 +] er afgørende for at forstå processerne i de cellulære fysiologiske funktioner. Fura-2 analoger er ganske nyttigt, fordi de er begejstrede i UV-området (< 400 nm), og den ratiometriske metode kan anvendes til kvantitativ måling. Derfor kan andre fysiologiske parametre såsom pH, membran potentiale, etc., måles med andre fluorescerende farvestoffer. Mitokondrie ca2 + koncentrationen (ca2 +]m) rækkevidde var angiveligt 0,08 − 20 μM2,3,4,5. Blandt Fura-2-analoger er Fura-2-FF egnet til måling af dette interval på [ca2 +]. Men de levende celler desværre indeholder NADH/NADPH for deres metaboliske processer, og NADH genererer signal interferens på grund af den overlappende excitation og emission Spectra med Fura-2 analog. Denne interferens begrænser i høj grad brugen af Fura-2 analover. Specifikt, hvis analog anvendes til at måle mitokondrie [ca2 +], denne interferens er den største hindring, fordi den højeste mængde af NADH er i mitokondrier. Dette kompliceres yderligere af, at NADH-ændringer hænger sammen med potentialet for mitokondriel membran (en),og ændringen af denændrede betydning påvirker [ca2 +]m6,7,8 , 9. Endvidere, for at studere [ca2 +]m dynamik, er det vigtigt at kende status for andre MITOKONDRIE parametre, såsom NADH, omm, og ph.
Emissionerne ved 450 Nm og 500 nm med excitationer ved 353 nm, 361 nm og 400 nm indeholder signalerne fra NADH og Fura-2-FF, og ligningerne er som følger. Heri er 353 nm og 361 nm de isosbestiske punkter i Fura-2-FF for emissioner ved henholdsvis 450 Nm og 500 nm.
F361.450 = f361450, NADH + f361450, Fura ligning 1 F353.500 = f353500, NADH + f353500, Fura ligning 2 F400.500 = f400500, NADH + f400500, Fura ligning 3
hvor Fx, y er den målte emissionsintensitet ved y-nm ved x-nm excitation, fx, y, NADH repræsenterer den rene NADH-afhængige emissionsintensitet, og fx, y, Fura repræsenterer den rene Fura-2-FF-afhængige emissionsintensitet. Under samme koncentration af det fluorescerende farvestof skal en bestemt excitation intensitet producere den samme emissionsintensitet. Derfor skal emissions intensitets forholdet for to forskellige excitation bølgelængder være konstant. Ca2 + og Fura-2 påvirkede ikke NADH-fluorescens egenskaber. Derfor var forholdet mellem emissionen ved 450 Nm og ved 500 nm af NADH konstant ved enhver excitation bølgelængde. Den samme regel kan anvendes til Fura-2-FF baseret på den antagelse, at NADH eller [ca2 +] ikke påvirker emission og excitation Spectra af Fura-2-FF. Men ca2 + forårsagede en spektral forskydning af Fura-2-FF emission. Derfor, for at fjerne effekten af ca2 +, isosbestic excitation, som er uafhængig af ca2 +, skal anvendes. Hver emissions bølgelængde (dvs. 450 Nm og 500 nm) har et andet isosbestisk punkt, og fra vores eksperimentelle opsætning blev 353 nm ved 500 nm og 361 nm ved 450 Nm valgt. Fra disse er følgende ligninger gyldige10.
Rf = f361450, Fura/f353500, Fura ligning 4 RN1 = f400500, NADH/F361450, NADH ligning 5 RN2 = f353500, NADH/F361450, NADH ligning 6
Med disse konstanter er følgende ligninger fra (ligning 1) (ligning 2) og (ligning 3) gyldige.
F361.450 = f361450, NADH + Rf × f353500, Fura ligning 7 F353.450 = RN2 × f361450, NADH + f353500, Fura ligning 8 F400.500 = RN1 × f361450, NADH + f400500, Fura ligning 9
Fra disse ligninger, hvis Rf, rN1og rN2 er kendt, kan der opnås rene signaler af NADH og Fura-2 som følger.
F361450, NADH = (f361.450 -rf × f353.500)/(1 − rf × rN2) ligning 10 F353500, Fura = (rN2 × F361.450 − f353.500)/(rF × rN2 − 1) ligning 11 F400500, Fura = f400.500 − RN1 × f361450, NADH ligning 12 RFura = f353500, Fura/f400500, Fura ligning 13
Ca2 +-bundet form af Fura-2-FF var praktisk taget ikke-fluorescerende ved 400 nm excitation bølgelængde. Baseret på denne egenskab kan følgende nye kalibrerings ligning udledes.
[Ca2 +] = Kd ∙ (F400500, Max/f353500, maks) × (rFura − rmin) ligning 14
hvor Kd er en dissociationskonstant, f400500, maks og f353500, Max er maksimumværdierne for de udsendte signaler ved 500 nm med excitationer ved henholdsvis 400 nm og 353 nm, og rmin er minimum rFura i ca2 +-fri tilstand. Da de isosbestiske excitationer blev anvendt, kan ligningen forenkles yderligere som følger.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/rmin.) ∙ (rFura − rmin) ligning 15
Derfor kræves kun Kd -og R-min -værdier for at beregne [ca2 +].

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

For at måle [ca2 +] kvantitativt, anvendes Fura-2-analoger, som er ratiometriske fluoropklæder, hyppigt. Men, farvestof skik er uløseligt begrænset i levende celler på grund af autofluorescens interferens, hovedsagelig fra nicotinamid adenin dinucleotid (NADH). Mere specifikt, dette er en stor hindring, når du måler mitokondrie [ca2 +] kvantitativt ved hjælp af Fura-2 analoger, fordi størstedelen af NADH er i mitokondrierne. Hvis den fluorescerende farvestof koncentration er den samme, skal en bestemt excitation intensitet producere den samme emissionsintensitet. Derfor skal emissions intensitets forholdet for to forskellige excitation bølgelængder være konstant. Baseret på dette princip, en ny online korrektion metode NADH signal interferens til at måle [ca2 +] blev udviklet, og den reelle signalintensitet af NADH og Fura-2 kan opnås. Desuden blev der udviklet en ny ligning til beregning af [ca2 +] med isosbestisk excitation eller excitation ved 400 nm. Med denne metode, ændringer i mitokondrie [ca2 +] kunne måles med succes. Med et andet sæt af excitation og emission bølgelængder, flere parametre, herunder NADH, [ca2 +], og pH eller mitokondriel membran potentiale (Me m), kunne samtidig måles. Mitokondrie [ca2 +]og eller ph blev målt ved hjælp af FURA-2-FF og tetramethylrhodamin ETHYL ester (tmre) eller carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (CARBOXY-SNARF-1).

Mitochondrial ca2 + ændringer på grund af korrektion10 Figur 4 viser ændringerne i [ca2 +]m før og efter korrektionen. Resultaterne viste tydeligt de væsentlige ændringer i [ca2 +]m. Den mitokondrielle hvile calciumkoncentration uden cytosolisk ca2 + ([ca2 +]c) var 1,03 ± 0,13 μM (gennemsnit ± S.E., n = 32), og den maksimale [ca2 +]m ved 1-μM [ca2 +...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

På grund af den spektral overlapning af excitation og emission bølgelængder af NADH og Fura-2 analogerne, signal interferens fra begge kemikalier i levende celler er uundgåelig under kvantitativ måling af [ca2 +]. Således, en ny online korrektion metode NADH signal interferens til at måle [ca2 +] blev udviklet.

En roman nicotinamid adenin dinucleotid korrektion metode til intracellulære ca2 + måling med Fura-2-analog i levende celler

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV excitable flertalssonder, har en iboende signal forurening, på grund af auto-flertal lyde. Det meste af problemet med NADH, er at begrænse brugen af en flertalssonde. En metode kan anvendes, til præcist at korrigere den ydre florescence fra NADH, for at udtrække en sand, uforuretet flertalssonde signal.Demonstration af proceduren vil være Jeong Hoon Lee, vores forskning adjunkt fra mit laboratorium. Efter at myocytterne har ladet sig slå sig ned i bunden af røret, skal du aspirere supernatanten. Mærke cellerne med to milliliter frisklavet en millimolar fura-2-FFAM fortyndingsopløsning i 60 minutter ved fire grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen anbringes røret i et 37 grader Celsius-vandbad i 30 minutter i opretstående stilling, før supernatanten fjernes. Derefter tilsættes fire milliliter rumtemperaturkulturmedium til opbevaring ved stuetemperatur. For in situ isobestic fura-2-ffa punkt identifikation montere fortyndede celler på mikroskopet fase og vente tre minutter for cellerne til at synke til bunden.Profuse NADH-fri 37 grader Celsius calcium-fri løsning i cellekulturen og finde en målcelle. Profuse saponin opløsning i 60 sekunder, før re-profusing med NADH-fri calcium-fri opløsning. Mål samtidig de fura-2-ff udsendte signaler ved 450 og 500 nanometer ved hjælp af en excitationsscanning fra 350 til 365 nanometer med et 0,1 nanometertrin og re-kraftig med NADH-fri calciumfri opløsning.Derefter trækkes signalerne i den calciummættede opløsning fra signalerne under de calciumfrie forhold. Derefter beregnes standardafvigelserne for emissionen ved hver excitation, og excitationsbølgelængden, der viser minimumsstandardafvigelsesværdierne som individuelle isobestiske punkter. Hvis du vil bruge et multiparametrisk målesystem til at registrere baggrundssignalet og korrigere signalet inden for celleområdet, skal du montere farvestoffrie celler i mikroskopbadet og lade cellerne nøjes i tre minutter.Profuse NADH calcium-fri opløsning i badet i cirka fem minutter på en to til tre milliliter per minut sats og sæt objektet feltet til at dække den målrettede celle. Når cellen er flyttet ud af feltet, skal du måle baggrundssignalerne i det cellefrie vindue og indstille signalerne som forskydninger. Vend derefter cellen tilbage til startpositionen, og mål cellebaggrundssignalerne og celleområdet.Til beregning af R-faktoren skal du bruge de erhvervede cellebaggrunds- og områdesignaler, før de farvefri celler monteres på mikroskopet og profusing med calciumfri opløsning. Mål signalerne som angivet, før celleaffjedringen profus med malatopløsning. Efter måling af signalerne profuse cellerne med pyruvat opløsning efterfulgt af overflod med malate-pyruvat opløsning og rotenon opløsning.Beregn derefter hældningen for hvert signal. Her er ændringerne i mitokondrielt calcium før og efter korrektionen vist. Resultaterne viser tydeligt væsentlige ændringer i mitokondrielt calcium med en mitokondriel hvilende calciumkoncentration uden cyklisk calcium på 1,03 plus eller minus 0,13 mikromolar og maksimalt mitokondrielt calcium ved en mikromolar calcium på 29,6 plus eller minus 1,61 mikromolar.Mitokondriel transmembrane potentiale blev overvåget med et væld af to nanomolars TMRE. Ændringen i mitokondrielt potentiale blev beregnet på grundlag af et formodet indledende mitokondriel membranpotentiale på minus 150 millivolt, hvilket viste et fald i NADH som reaktion på calcium tilsætning, med en negilsk effekt på mitokondrielle membranpotentiale. Mitokondrielle pH blev ikke foretaget af stigningen i mitokondriel calcium forårsaget af carboxy SNARF-1 belastning.Forkert isobestic points resulterer i forkert R og NADH korrektion. Så sørg for altid at måle cellefri baggrund og celleområde korrekt. Denne teknik bruges til at forberede mitokondrielle calcium dynamiske undersøgelser i de bioanalytiske udslip.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Måling af cellulære Kemotaksi med ECIS / Taxa

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Måling Intracellular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Ændringer i human Sperm med fire teknikker: Konventionel fluorometri, Stoppet Flow fluorometri, Flowcytometri og Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Fremgangsmåde til Embryonale Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Metode til mus pancreasø Isolation og intracellulære cAMP Bestemmelse

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital mikroskopi af Imaging Subcellulære Strukturer Live mus, der udtrykker fluorescerende proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Undersøgelse af protein-protein interaktioner i levende celler Brug Bioluminescens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i dyrkede pattedyrceller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

To-foton Imaging af intracellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Håndtering og nitrogenoxid Produktion i Endothelial og glatte muskelceller af en isoleret rotteaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Påvisning af Intracellulær genekspression i levende celler af murine, Human og porcin oprindelse anvendelse af fluorescens-mærkede Nanopartikler

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...