Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

Dit werk werd deels ondersteund door het basisprogramma voor wetenschappelijk onderzoek via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2018R1A6A3A01011832), door het ministerie van Wetenschappen, ICT & toekomstige planning (NRF-2016M3C1A6936606) en door het ministerie van handel, industrie & energie (10068076).

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het lokale Comité voor dierenverzorging en-gebruik.
1. voorbereiding van de oplossing
<ol><li>Bereid één vers geïsoleerde cardiale myocytes11. Opmerking: elk laboratorium kan een andere oplossing voor celopslag hebben. Hier worden de myocyten opgeslagen in kweekmedium (DMEM).</li>
	<li>Bereid 100 mL CA2 +-vrije oplossing (tabel 1).</li>
	<li>Bereid 50 mL kweekmedium in een bekerg...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

De storings correctiemethode werd met succes ontwikkeld voor het meten van de signalen van NADH en Fura-2 analogen. Exacte meting van de signalen is essentieel voor exacte correctie. De inherente aard van het fluorescerende apparaat produceert echter een achtergrond signaal dat geen verband houdt met dat van NADH van Fura-2. De hoogste kwaliteit band-pass filter kan alleen passeren tot 10− 8 van de ongewenste golflengten van het licht. Het fluorescerende signaal van een enkele cel is echter erg klein, en de ...

De belangrijke rol van intracellulaire CA2 + is algemeen bekend1. De kwantificering van [CA2 +] is essentieel om de processen van de cellulaire fysiologische functies te begrijpen. Fura-2-analogen zijn zeer nuttig omdat ze enthousiast zijn in het UV-bereik (< 400 nm), en de ratiometrische methode kan worden toegepast voor de kwantitatieve meting. Daarom kunnen andere fysiologische parameters zoals pH, membraanpotentiaal, enz., worden gemeten met andere fluorescerende kleurstoffen. De mitochondriale CA2 + concentratie ([CA. 2 +]m) was naar verluidt 0,08 − 20μM 2,3,4,5. Bij Fura-2-analogen is Fura-2-FF geschikt voor het meten van dit bereik van [CA2 +]. Echter, de levende cellen bevatten helaas NADH/NADPH voor hun metabole processen, en NADH genereert signaalinterferentie vanwege de overlappende excitatie en emissiespectra met de Fura-2 analoog. Deze interferentie beperkt het gebruik van Fura-2-analogen sterk. Specifiek, als de analoge wordt toegepast om te meten mitochondriale [CA2 +], deze interferentie is het grootste obstakel, omdat de hoogste hoeveelheid NADH in de mitochondriën. Dit wordt verder bemoeilijkt door NADH veranderingen gerelateerd aan het Mitochondriale membraanpotentiaal (Ψm) en de verandering van Ψm beïnvloedt [CA2 +]m6,7,8 , 9. Bovendien is het voor het bestuderen van [CA2 +]m dynamiek essentieel om de status van andere mitochondriale parameters te kennen, zoals NADH, Ψmen Ph.
De emissies bij 450 nm en 500 nm met excitaties bij 353 nm, 361 nm en 400 nm bevatten de signalen van NADH en Fura-2-FF, en de vergelijkingen zijn als volgt. Hierin zijn 353 nm en 361 nm de isosbestic punten van Fura-2-FF voor emissies bij 450 nm en bij respectievelijk 500 nm.
F361.450 = f361450, NADH + f361450, Fura vergelijking 1 F353.500 = f353500, NADH + f353500, Fura vergelijking 2 F400.500 = f400500, NADH + f400500, Fura vergelijking 3
waar Fx, y de gemeten emissie-intensiteit is bij y-nm door x-nm excitatie, fx, y, is NADH de zuivere NADH-afhankelijke emissie-intensiteit, en Fx, y, Fura vertegenwoordigt de zuivere Fura-2-FF-afhankelijke emissie-intensiteit. Onder dezelfde concentratie van de fluorescerende kleurstof moet een bepaalde excitatie intensiteit dezelfde emissie-intensiteit opleveren. Daarom moet de emissie-intensiteit verhouding van twee verschillende excitatie golflengten constant zijn. CA2 + en Fura-2 hadden geen invloed op de eigenschappen van NADH fluorescentie; Daarom was de verhouding van de emissie bij 450 nm en bij 500 nm van NADH constant bij elke excitatie golflengte. Dezelfde regel kan worden gebruikt voor Fura-2-FF op basis van de veronderstelling dat NADH of [CA2 +] heeft geen invloed op de emissie en excitatie spectra van Fura-2-FF. CA2 + veroorzaakte echter een spectrale verschuiving van de Fura-2-FF-emissie. Daarom, om het effect van CA2 +te verwijderen, moet isosbestic excitatie, die onafhankelijk is van CA2 +, worden gebruikt. Elke emissie golflengte (d.w.z. 450 nm en 500 nm) heeft een verschillend isosbestic punt, en uit onze experimentele opstelling werden 353 Nm bij 500 nm en 361 Nm bij 450 nm gekozen. Hieruit zijn de volgende vergelijkingen geldig10.
Rf = f361450, Fura/F353500, Fura vergelijking 4 RN1 = f400500, NADH/F361450, NADH vergelijking 5 RN2 = f353500, NADH/F361450, NADH vergelijking 6
Met deze constanten zijn de volgende vergelijkingen van (vergelijking 1) (vergelijking 2) en (vergelijking 3) geldig.
F361.450 = f361450, NADH + Rf × f353500, Fura vergelijking 7 F353.450 = RN2 × f361450, NADH + f353500, Fura vergelijking 8 F400.500 = RN1 × f361450, NADH + F400500, Fura vergelijking 9
Uit deze vergelijkingen, indien Rf, rN1en rN2 bekend zijn, kunnen zuivere signalen van NADH en Fura-2 als volgt worden verkregen.
F361450, NADH = (f361.450 -rf × f353.500)/(1 − rf × rN2) vergelijking 10 F353500, Fura = (rN2 × F361.450 − f353.500)/(rF × rN2 − 1) vergelijking 11 F400500, Fura = f400.500 − RN1 × f361450, NADH vergelijking 12 RFura = F353500, Fura/F400500, Fura vergelijking 13
De CA2 +-gebonden vorm van Fura-2-FF was praktisch niet-fluorescerend bij de 400 nm excitatie golflengte. Op basis van deze eigenschap kan de volgende nieuwe kalibratie vergelijking worden afgeleid.
[CA2 +] = Kd ∙ (F400500, Max/f353500, Max) × (RFura − rmin) vergelijking 14
waarbij Kd een dissociatieconstante is, F400500, Max en f353500, Max zijn de maximale waarden van de uitgestoten signalen bij 500 nm met excitaties bij respectievelijk 400 nm en 353 nm, en rmin is de minimale rFura in CA2 +-gratis conditie. Aangezien de isosbestic-excitaties werden gebruikt, kan de vergelijking als volgt verder worden vereenvoudigd.
[CA2 +] = Kd ∙ (1/Rmin) ∙ (rFura − Rmin) vergelijking 15
Daarom zijn alleen Kd -en Rmin -waarden vereist om [CA2 +] te berekenen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

Om [ca.2 +] kwantitatief te meten, worden Fura-2-analogen, die ratiometrische fluoroprobes zijn, vaak gebruikt. Het gebruik van de kleurstof is echter intrinsiek beperkt in levende cellen vanwege interferentie met autofluorescentie, voornamelijk van Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). Specifieker, dit is een groot obstakel bij het meten van de mitochondriale [CA2 +] kwantitatief met behulp van Fura-2 analogen omdat de meerderheid van NADH in de mitochondriën. Als de fluorescerende kleurstof concentratie hetzelfde is, moet een bepaalde excitatie-intensiteit dezelfde emissie-intensiteit opleveren. Daarom moet de emissie-intensiteit verhouding van twee verschillende excitatie golflengten constant zijn. Op basis van dit principe is een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie voor het meten van [CA2 +] ontwikkeld, en de werkelijke signaalintensiteit van NADH en Fura-2 kunnen worden verkregen. Verder werd een nieuwe vergelijking voor de berekening van [CA2 +] ontwikkeld met isosbestic excitatie of excitatie bij 400 nm. Met deze methode, veranderingen in de mitochondriale [CA2 +] kan met succes worden gemeten. Bovendien, met een andere set van de excitatie en emissie golflengten, meerdere parameters, met inbegrip van NADH, [CA2 +], en pH of Mitochondriale membraanpotentiaal (Ψm), gelijktijdig kunnen worden gemeten. Mitochondriale [CA2 +] en Ψm of pH werden gemeten met behulp van FURA-2-FF en tetramethylrhodamine ethyl ester (tmre) of Carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (Carboxy-snarf-1).

Mitochondriale CA2 + wijzigingen als gevolg van correctie10 Figuur 4 toont de wijzigingen in [CA2 +]m voor en na de correctie. De resultaten toonden duidelijk de substantiële veranderingen in [ca.2 +]m. De mitochondriale rust calciumconcentratie zonder cytosolische CA2 + ([ca.2 +]c) was 1,03 ± 0,13 μm (gemiddelde ± 1g , n = 32), en het maximum [CA2 +] m bij[ca....

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Vanwege de spectrale overlapping van de excitatie-en emissie golflengten van NADH en Fura-2-analogen, is de signaalstoring van beide chemicaliën in levende cellen onvermijdelijk tijdens de kwantitatieve meting van [ca.2 +]. Zo werd een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie op maat [CA2 +] ontwikkeld.

Een roman Nicotinamide adenine dinucleotide correctiemethode voor intracellulaire CA2 + meting met Fura-2-analoog in levende cellen

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV prikkelbare meervoudsondes, hebben een inherente signaalverontreiniging, vanwege de auto-meervoud geluiden. Het grootste deel van het probleem met NADH, is het beperken van het gebruik van een meervoud sonde. Een methode kan worden gebruikt om de buitenste florescentie van NADH nauwkeurig te corrigeren, om een echt, niet-verontreinigd meervoudsondesignaal te extraheren.Het aantonen van de procedure zal Jeong Hoon Lee zijn, onze assistent-professor in mijn laboratorium. Nadat de myocyten zich op de bodem van de buis hebben laten vestigen, wordt de supernatant aangezogen. Label de cellen met twee milliliter vers bereide een millimolar fura-2-FFAM verdunningsoplossing gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius.Plaats de buis aan het einde van de incubatie in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten rechtop voordat u de supernatant verwijdert. Voeg vervolgens vier milliliter kamertemperatuur cultuur medium voor opslag bij kamertemperatuur. Voor in situ isobestische fura-2-ffa punt identificatie mount de verdunde cellen op de microscoop stadium en wacht drie minuten voor de cellen te zinken naar de bodem.Profuse NADH-vrije 37 graden Celsius calciumvrije oplossing in de celcultuur en zoek een doelcel. Overvloedige saponineoplossing gedurende 60 seconden voordat u opnieuw profusing met de NADH-vrije calciumvrije oplossing. Meet tegelijkertijd de fura-2-ff uitgezonden signalen op 450 en 500 nanometer, met behulp van een excitatiescan van 350 tot 365 nanometer met een stap van 0,1 nanometer en opnieuw te overmatigen met NADH-vrije calciumvrije oplossing.Trek vervolgens de signalen in de calciumverzadigde oplossing af van de signalen in de calciumvrije omstandigheden. Bereken vervolgens de standaarddeviaties van de emissie bij elke excitatie en selecteer de excitatiegolflengte met de minimale standaarddeviatiewaarden als afzonderlijke isobestische punten. Om een multi-parametrisch meetsysteem te gebruiken om het achtergrondsignaal te detecteren en het signaal binnen het celgebied te corrigeren, monteer je kleurstofvrije cellen in het microscoopbad en laat je de cellen drie minuten vestigen.Profuse NADH calcium-vrije oplossing in het bad voor ongeveer vijf minuten op een twee tot drie milliliter per minuut tarief en stel het object veld om de beoogde cel te dekken. Na het verplaatsen van de cel uit het veld meten de achtergrondsignalen van de cel-vrij venster en stel de signalen als verschuivingen. Breng vervolgens de cel terug naar de oorspronkelijke positie en meet de achtergrondsignalen van de cel en het celgebied.Om de R-factor te berekenen gebruik maken van de verworven cel achtergrond en gebied signalen voor het opnieuw monteren van de kleurstof-vrije cellen op de microscoop en profusing met calcium-vrije oplossing. Meet de signalen zoals aangegeven voordat de celsuspensie wordt uitgemaakt met malateoplossing. Na het meten van de signalen overvloedig de cellen met pyruvaat oplossing gevolgd door overvloed met malate-pyruvaat oplossing en rotenone oplossing.Bereken vervolgens de helling voor elk signaal. Hier worden de veranderingen in mitochondriaal calcium voor en na de correctie getoond. De resultaten tonen duidelijk aanzienlijke veranderingen in het mitochondriale calcium met een mitochondriale rustende calciumconcentratie zonder cytosolische calcium van 1,03 plus of min 0,13 micromolar en maximaal mitochondriaal calcium bij één micromolar calcium van 29,6 plus of min 1,61 micromolar.Het mitochondriale transmembranepotentieel werd gemonitord met een overvloed aan twee nanomolars TMRE. De verandering in het mitochondriale potentieel werd berekend op basis van een veronderstelde initiële mitochondriale membraanpotentieel van min 150 millivolt, wat een afname van nadh in reactie op calciumtoevoeging aantoonde, met een negbaar effect op het mitochondriale membraanpotentieel. De mitochonddirale pH werd niet uitgevoerd door de toename van mitochondriaal calcium veroorzaakt door carboxy SNARF-1 laden.Onjuiste isobestische punten resulteren in onjuiste R- en NADH-correctie. Zorg er dus voor dat je altijd de celvrije achtergrond en het celgebied correct meet. Deze techniek wordt gebruikt om mitochondriale calcium dynamische studies in de bioanalytische morsen bereid.

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Meten Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detectie van intracellulaire genexpressie in levende cellen van muizen, de mens en Porcine Origin Met behulp van fluorescentie-gelabelde Nanodeeltjes

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...