Name: a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells at JoVE.com

Ce travail a été partiellement soutenu par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l'éducation (2018R1A6A3A01011832), par le Ministère des sciences, des TIC et de la Planification de l'avenir (NRF-2016M3C1A6936606) et par le Ministère du commerce, de l'industrie et de l'énergie (10068076).

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité local de soins et d'utilisation des animaux en établissement.
1. Préparation de la solution
<ol><li>Préparer des myocytes cardiaques isolés simples11. REMARQUE : Chaque laboratoire peut avoir une solution de stockage cellulaire différente. Ici, les myocytes sont stockés dans le milieu de culture (DMEM).</li>
	<li>Préparer 100 ml de ca2- solution gratuite (tableau 1</str...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2++concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes.">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li><li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2++under+various+conditions.">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li><li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium.">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li><li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues.">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li><li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals.">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li><li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes.">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li><li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca(2+)+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae.">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li><li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes.">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li><li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2++Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat.">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li><li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium.">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li><li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte:+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism.">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li><li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology.">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li><li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling.">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

La méthode de correction des interférences a été développée avec succès pour mesurer les signaux des analogues NADH et fura-2. La mesure exacte des signaux est essentielle pour la correction exacte. Cependant, la nature inhérente de l'appareil fluorescent produit un signal de fond sans rapport avec celui de NADH de fura-2. Le filtre de bande-passe de la plus haute qualité ne peut passer que jusqu'à 10à 8 des longueurs d'onde indésirables de la lumière. Cependant, le signal fluorescent d'une seule ...

Le rôle significatif de ca2 intracellulaire est largement connu1. La quantification de [Ca2'] est essentielle pour comprendre les processus des fonctions physiologiques cellulaires. Les analogues Fura-2 sont très utiles parce qu'ils sont excités dans la gamme UV (400 nm), et la méthode ratiométrique peut être appliquée pour la mesure quantitative. Par conséquent, d'autres paramètres physiologiques tels que le pH, le potentiel membranaire, etc., peuvent être mesurés avec d'autres colorants fluorescents. La concentration mitochondriale de Ca2 '([Ca 2']m)aurait été de 0,08 à 20 m2,3,4,5. Parmi les analogues fura-2, fura-2-FF est approprié pour mesurer cette gamme de [Ca2]. Cependant, les cellules vivantes contiennent malheureusement NADH/NADPH pour leurs processus métaboliques, et NADH génère l'interférence de signal en raison du chevauchement des spectres d'excitation et d'émission avec l'analogique fura-2. Cette interférence limite considérablement l'utilisation des analogues fura-2. Plus précisément, si l'analogique est appliqué pour mesurer les mitochondries [Ca2],cette interférence est le plus grand obstacle parce que la plus grande quantité de NADH est dans les mitochondries. Ceci est encore compliqué par les changements NADH étant liés au potentiel de membrane mitochondriale(m) et le changement de'm affecte [Ca2 ']m6,7,8 , 9. En outre, pour étudier la dynamique [Ca2]m, il est essentiel de connaître l'état d'autres paramètres mitochondriaux, tels que nADH,m, et pH.
Les émissions à 450 nm et 500 nm avec des excitations à 353 nm, 361 nm, et 400 nm contiennent les signaux de NADH et fura-2-FF, et les équations sont les suivantes. Ici, 353 nm et 361 nm sont les points isosbestic de fura-2-FF pour les émissions à 450 nm et à 500 nm, respectivement.
F361 450 ' F361 450,NADH ' F361 450,Fura Equation 1 F353 500 ' F353 500,NADH ' F353 500,Fura Equation 2 F400 500 et F400 500,NADH et F400 500,Fura Equation 3
où Fx,y est l'intensité d'émission mesurée à y-nm par x-nm excitation, Fx,y,NADH représente l'intensité pure d'émission NADH-dépendante, et Fx,y,Fura représente l'intensité pure d'émission fura-2-FF-dépendante. Sous la même concentration du colorant fluorescent, une certaine intensité d'excitation devrait produire la même intensité d'émission. Par conséquent, le rapport d'intensité des émissions de deux longueurs d'onde d'excitation différentes devrait être constant. Ca2 et fura-2 n'ont pas affecté les caractéristiques de fluorescence du NADH; par conséquent, le rapport de l'émission à 450 nm et à 500 nm de NADH était constant à n'importe quelle longueur d'onde d'excitation. La même règle peut être utilisée pour le fura-2-FF en partant de l'hypothèse que le NADH ou [Ca2]n'affecte pas les spectres d'émission et d'excitation de fura-2-FF. Cependant, Ca2 a causé un changement spectral de l'émission de fura-2-FF. Par conséquent, pour supprimer l'effet de Ca2, excitation isosbestique, qui est indépendant de Ca2, doit être utilisé. Chaque longueur d'onde d'émission (c.-à-d., 450 nm et 500 nm) a un point isosbestic différent, et de notre configuration expérimentale, 353 nm à 500 nm et 361 nm à 450 nm ont été choisis. De ceux-ci, les équations suivantes sont valides10.
Rf f F361 450,Fura/F353 500,Fura Equation 4 RN1 - F400,500,NADH/F361 450,NADH Equation 5 RN2 - F353,500,NADH/F361 450,NADH Equation 6
Avec ces constantes, les équations suivantes de (Equation 1) (Equation 2) et (Equation 3) sont valides.
F361 450 ' F361 450,NADH ' Rf ' F353 500,Fura Equation 7 F353 450 ' RN2 'F361,450,NADH ' F353,500,Fura Equation 8 F400,500 ' RN1 'F361,450,NADH 'F400,500,Fura Equation 9
De ces équations, si Rf, RN1, et RN2 sont connus, des signaux purs de NADH et fura-2 peuvent être obtenus comme suit.
F361 450,NADH (F361 450 - Rf - F353 500)/(1 ' Rf ' RN2) Équation 10 F353 500,Fura (RN2 - F361 450 - F353 500)/(Rf ' RN2 ' 1) Équation 11 F400,500,Fura ' F400,500 ' RN1 ' F361,450,NADH Équation 12 RFura - F353 500,Fura/F400 500,Fura Equation 13
La forme Ca2-bound de fura-2-FF était pratiquement non-fluorescent à la longueur d'onde d'excitation de 400 nm. Sur la base de cette propriété, la nouvelle équation d'étalonnage suivante peut être dérivée.
[Ca2 '] ' Kd ' (F400,500,max/F353,500,max) '(RFura ' Rmin) Équation 14
où Kd est une constante de dissociation, F400,500,max et F353,500,max sont les valeurs maximales des signaux émis à 500 nm avec des excitations à 400 nm et 353 nm, respectivement, et Rmin est le minimum RFura en Ca2 --condition libre. Puisque les excitations isosbestic ont été utilisées, l'équation peut être simplifiée plus loin comme suit.
[Ca2 '] ' Kd ' (1 / Rmin) ' (RFura ' Rmin) Équation 15
Par conséquent, seules les valeurs Kd et Rmin sont nécessaires pour calculer [Ca2'].

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL eppendorf tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>2 mL Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>Instrutech</td>
			<td>ITC-18</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP, Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Ealing Electro-Optics, Inc</td>
			<td>35-3920</td>
			<td>Equipment, 640&#177;11nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>690-9823</td>
			<td>Equipment, 590&#177;15nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>500DF20-9916</td>
			<td>Equipment, 500&#177;20nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band pass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>60685</td>
			<td>Equipment, 450&#177;30nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carboxy-SNARF-1(AM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1272</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device (CCD) camera</td>
			<td>Philips</td>
			<td>FTM1800NH/HGI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>86009</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;400nm, 490&#177;10, 560&#177;10, Transmission : 460&#177;15, 510&#177;20, &#62;580nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>567DCXRU</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;560nm, Transmission : &#62; 580 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>480dclp</td>
			<td>Equipment, Reflection : &#60;470nm, Transmission : &#62; 490 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>20728</td>
			<td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &#60;405nm, 470&#177;30, Transmission : 430nm~520nm, &#62; 640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>154938</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5030</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>21857</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>field diaphragm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>86506</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2-FF(AM)</td>
			<td>TEFLABS</td>
			<td>137</td>
			<td>chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green tube</td>
			<td>DWM</td>
			<td></td>
			<td>test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES,&#160; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed counter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-6022</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>21002</td>
			<td>Equipment, 50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>27606</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared filter </td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>D750/100X</td>
			<td>Equipment, 750&#177;100nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil immersion lens </td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRF01400</td>
			<td>40x, NA 1.3; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon counter unit</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C3866</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon multiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R2949</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome II</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>SA3/MG04</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P4494</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>T669</td>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel nicotinamide adenine dinucleotide correction method for intracellular ca2+ measurement with fura-2-analog in live cells

Pour mesurer [Ca2'] quantitativement, les analogues fura-2, qui sont des fluoroprobes ratiométriques, sont fréquemment utilisés. Cependant, l'utilisation de colorant est intrinsèquement limitée dans les cellules vivantes en raison de l'interférence d'autofluorescence, principalement du dinucleotide d'adénine de nicotinamide (NADH). Plus précisément, il s'agit d'un obstacle majeur lors de la mesure de la mitochondriale [Ca2 ]quantitativement en utilisant des analogues fura-2 parce que la majorité de NADH est dans les mitochondries. Si la concentration de colorant fluorescent est la même, une certaine intensité d'excitation devrait produire la même intensité d'émission. Par conséquent, le rapport d'intensité des émissions de deux longueurs d'onde d'excitation différentes devrait être constant. Sur la base de ce principe, une nouvelle méthode de correction en ligne de l'interférence de signal NADH pour mesurer [Ca2]a été développée, et l'intensité réelle de signal de NADH et fura-2 peut être obtenue. En outre, une nouvelle équation à calculer [Ca2]a été développée avec une excitation ou une excitation isosbestique à 400 nm. Avec cette méthode, les changements dans les mitochondries [Ca2]pourraient être mesurés avec succès. En outre, avec un ensemble différent des longueurs d'onde d'excitation et d'émission, plusieurs paramètres, y compris NADH, [Ca2],et le pH ou le potentiel de membrane mitochondriale(M),pourraient être mesurés simultanément. Les mitochondries [Ca2m]etm ou pH ont été mesurées à l'aide de fura-2-FF et de téramethylrhodamine ester éthylin (TMRE) ou carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).

Changements mitochondriaux Ca2mD dus à la correction10 La figure 4 montre les changements dans [Ca2 '] m avant et après la correction. Les résultats ont clairement montré les changements substantiels dans [Ca2 'm. La concentration mitochondriale de calcium au repos sans cytosolique Ca2 ' ([Ca2 ']c) était de 1,03 à 0,13 M (moyenne , S.E., n ' 32), et le maximum [Ca2 ']m<...

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A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

En raison du chevauchement spectral des longueurs d'onde d'excitation et d'émission des analogues NADH et fura-2, l'interférence du signal des deux produits chimiques dans les cellules vivantes est inévitable lors de la mesure quantitative de [Ca2']. Ainsi, une nouvelle méthode de correction en ligne de l'interférence du signal NADH pour mesurer [Ca2]a été développée.

Une nouvelle nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Méthode pour la mesure intracellulaire Ca2 avec Fura-2-Analog dans les cellules vivantes

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

Les sondes plurielles excitables UV, ont une contamination inhérente au signal, en raison des sons auto-pluriels. La plupart du problème avec NADH, est de limiter l’utilisation d’une sonde plurielle. Une méthode peut être utilisée, pour corriger avec précision la florescence externe du NADH, afin d’extraire un véritable signal de sonde pluriel non contaminé.Jeong Hoon Lee, notre professeur adjoint de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure. Après avoir permis aux myocytes de s’installer au fond du tube, aspirer le surnatant. Étiquetez les cellules avec deux millilitres de solution de dilution diluante fura-2-FFAM fraîchement préparée pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.À la fin de l’incubation, placer le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en position verticale avant d’enlever le supernatant. Ajouter ensuite quatre millilitres de milieu de culture de température ambiante pour le stockage à température ambiante. Pour in situ isobestic fura-2-ffa point d’identification monter les cellules diluées sur le stade du microscope et attendre trois minutes pour les cellules de couler vers le fond.Profuse NADH-libre de 37 degrés Celsius solution sans calcium dans la culture cellulaire et de localiser une cellule cible. Profuse solution saponine pendant 60 secondes avant de ré-profusing avec la solution sans calcium SANS NADH. Mesurez simultanément les signaux émis fura-2-ff à 450 et 500 nanomètres, à l’aide d’un balayage d’excitation de 350 à 365 nanomètres avec une étape de 0,1 nanomètre et ré-profuse avec nadh-libre solution sans calcium.Ensuite, soustrayez les signaux dans la solution saturée de calcium des signaux dans les conditions sans calcium. Calculez ensuite les écarts types de l’émission à chaque excitation et sélectionnez la longueur d’onde d’excitation montrant les valeurs minimales d’écart type en tant que points isobestic individuels. Pour utiliser un système de mesure multi-paramétrique pour détecter le signal d’arrière-plan et pour corriger le signal dans la zone cellulaire, monter des cellules sans colorant dans le bain microscope et permettre aux cellules de se contenter de trois minutes.Profuse NADH solution sans calcium dans le bain pendant environ cinq minutes à une vitesse de deux à trois millilitres par minute et mettre le champ d’objet pour couvrir la cellule ciblée. Après avoir sorti la cellule du champ, mesurez les signaux de fond de la fenêtre sans cellule et réglez les signaux comme des décalages. Retournez ensuite la cellule à la position initiale et mesurez les signaux de fond cellulaire et la zone cellulaire.Pour calculer le facteur R, utilisez le fond cellulaire acquis et les signaux de zone avant de remonter les cellules sans colorant sur le microscope et de profuser avec une solution sans calcium. Mesurez les signaux comme indiqué avant de profuser la suspension cellulaire avec une solution malate. Après avoir mesuré les signaux profuse les cellules avec la solution pyruvate suivie de profusion avec la solution malate-pyruvate et la solution de rotenone.Calculez ensuite la pente pour chaque signal. Ici, les changements dans le calcium mitochondrial avant et après la correction sont montrés. Les résultats indiquent clairement des changements substantiels dans le calcium mitochondrial avec une concentration mitochondrique de calcium de repos sans calcium cytosolic de 1.03 plus ou moins 0.13 micromolar et calcium mitochondrique maximum à un micromolaire de calcium de 29.6 plus ou moins 1.61 micromolar.Le potentiel transmembrane mitochondrial a été surveillé avec une profusion de deux nanomolaires TMRE. Le changement dans le potentiel mitochondrial a été calculé basé sur un potentiel initial supposé de membrane mitochondrique de moins 150 millivolts, démontrant une diminution de NADH en réponse à l’addition de calcium, avec un effet négligeable sur le potentiel mitochondrique de membrane. Le pH mitochondiral n’a pas été réalisé par l’augmentation du calcium mitochondrial induite par la charge carboxy SNARF-1.Des points isobestiques incorrects entraînent une correction incorrecte de R et de NADH. Prenez donc soin de toujours mesurer correctement le fond sans cellule et la zone cellulaire. Cette technique est utilisée pour préparer des études dynamiques mitochondriques sur le calcium dans les déversements bioanalytiques.

Research

JoVE Journal

Biology

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Recherche

Biologie

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